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• DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)是由DNA依赖的蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)与Ku蛋白(由Ku70和Ku80组成的蛋白异构体)组成的一种蛋白复合物，其功能是启动DNA双链断裂的非同源末端连接修复(NHEJ)^[1~4]。DNA损伤诱导剂和放疗已经广泛应用于临床肿瘤治疗，其抗肿瘤机制为诱导肿瘤细胞发生致死性的DNA双链断裂(DSB)，DSB主要是通过非同源末端连接来修复的，因此在此修复过程中起关键作用的DNA-PK的抑制剂就具有增强放化疗敏感性的作用^{[5, 6]}。奥拉帕尼是一种多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)抑制剂，其可阻断参与修复受损DNA的酶^[7~9]。2014年，美国FDA批准奥拉帕尼应用于BRCA基因缺陷相关的卵巢癌的治疗。随着奥拉帕尼的临床获批，DNA修复抑制剂引起了广大研究者的注意，越来越多的新型DNA修复抑制剂被研发并投入到临床试验当中。研究发现，STL127705是一种具有嘧啶并嘧啶二酮骨架结构的DNA-PK的抑制剂，其对肿瘤细胞的杀伤效应不大，但其能够通过阻断DNA修复通路，极大地增强DNA损伤诱导剂或放疗的抗肿瘤功效^[10]。

  有关STL127705的合成方法之前未见报道，从其化学结构分析，可由3, 4-二甲氧基苯乙胺与含有嘧啶并嘧啶二酮结构的衍生物缩合而成；嘧啶并嘧啶二酮结构化合物可由4-氨基嘧啶-5-酰胺衍生结构合环反应制得；4-氨基嘧啶-5-酰胺衍生物可由相应的4-氨基-5-嘧啶甲酸衍生物与3-氟苯胺酯化缩合来得到(图式 1)。

  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物STL127705的逆合成路线分析

  Scheme 1.  Retrosynthesis of target compound STL127705

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  通过对目标化合物的逆合成分析，本文设计的合成路线是以2-甲基硫-4-氯嘧啶-5-基甲酸乙酯为起始原料，先对其4位进行氨化生成化合物1，再水解化合物1中的甲酸乙酯，游离的羧酸基团与3-氟苯胺进行缩合酰化反应，生成化合物3。化合物3与二(三氯甲基)碳酸酯发生合环反应，生成化合物4。然后将化合物4中的甲硫醚基团氧化为甲磺酰基，化合物5与3, 4-二甲氧基苯乙胺反应生成最终的目标化合物STL127705(图式 2)。

  图式 2

  

  图式 2.  本文报道的目标化合物STL127705的合成路线

  Scheme 2.  Synthetic route of target compound STL127705 reported in this paper

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  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  实验中相关化学试剂均为国产分析纯级，无水溶剂用常规方法干燥处理。使用E. Merck (GF₂₅₄) 0.25mm TLC硅胶板监测反应；柱层析分离纯化采用快速制备仪器Biotage Isolera I，所用的硅胶为300~400目；反应收率由过柱纯化后计算而得；熔点采用X4型显微熔点仪测定；质谱通过LCQ-Deca XP/Ad型(Thermo Electron)离子阱质谱仪测定，离子源采用电喷雾离子化(ESI)；¹H NMR和¹³C NMR谱由Bruker Avance Ⅲ 400MHz核磁共振波谱仪测定。

  1.2   化合物的合成

  1.2.1   化合物1的合成

  将5.00g(21.5mmol)2-甲基硫-4-氯嘧啶-5-基甲酸乙酯溶于20mL四氢呋喃，向反应液中加入5mL 25%氨水溶液，室温下反应2h，TLC监测至反应结束后加入30mL饱和氯化铵溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1:1(体积比，下同))得到白色固体4.12g，收率89.3%，熔点130~131℃。ESI-MS m/z：214.0[M+H]⁺；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：8.61(s，1H，H-4)，7.84(s，2H，-NH₂)，3.47~3.41(q，J=6.8Hz，2H，-OCH₂CH₃)，2.45(s，3H，-SCH₃)，1.04~1.00(t，J=6.8Hz，3H，-OCH₂CH₃)。

  1.2.2   化合物2的合成

  将4.12g(19.3mmol)化合物1溶于15mL甲醇，滴加3mL 0.50g/mL氢氧化锂水溶液，在50℃条件下反应5h，TLC监测至反应结束，加入30mL饱和氯化铵溶液，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1:3)得到白色固体3.25g，收率91.0%，熔点122~124 ℃。ESI-MS m/z：183.9 [M-H]^-；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：13.17(s，1H，-COOH)，8.54(s，1H，H-4)，7.89(s，1H，-NH₂)，7.82(s，1H，-NH₂)，2.47(s，3H，-SCH₃)。

  1.2.3   化合物3的合成

  将3.25g(17.6mmol)化合物2和8.01g(21.1mmol)2-(7-氧化苯并三氮唑)-N, N, N′, N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)溶于20mL干燥的N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气保护和室温条件下，向反应液中加入4.6mL(26.4mmol)N, N-二异丙基乙胺(DIPEA)，滴加完毕后反应10min，再向反应液中加入2.40g(21.1mmol)3-氟苯胺，室温下反应12h，待反应结束后向反应液中加入30mL饱和氯化铵溶液，用乙酸乙酯(20mL×4)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，2:3)得到淡黄色固体4.55g，收率93.0%，熔点145~147 ℃。ESI-MS m/z：279.4 [M+H]⁺；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：10.33(s，1H，-CONH-)，8.65(s，1H，H-4)，7.82(s，2H，-NH₂)，7.65(dt，J=11.8、2.2 Hz，1H，H-2’)，7.49~7.43 (m，1H，H-6’)，7.39 (dt，J=15.0，7.5Hz，1H，H-4’)，6.94 (ddd，J=8.1、2.5、1.8 Hz，1H，H-5’)，2.48 (s，3H，-SCH₃)。

  1.2.4   化合物4的合成

  在氮气保护和冰浴条件下，将4.55g(16.4mmol)化合物3和20g(65.6mmol)二(三氯甲基)碳酸酯溶于30mL干燥的四氢呋喃中，滴加5.7mL(32.8mmol)DIPEA，反应2h，TLC监测至反应完成后向反应液中加入50mL饱和氯化铵溶液，用乙酸乙酯(30mL×4)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1:1)得到淡黄色固体4.43g，收率88.9%，熔点139~140 ℃。ESI-MS m/z：305.5 [M+H]⁺；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：12.48(s，1H，H-7)，8.93(s，1H，H-4)，7.60~7.50(m，1H，H-4’)，7.35~7.24(m，2H，H-2’，H-5’)，7.21(d，J=7.9Hz，1H，H-6’)，2.61(s，3H，-SCH₃)。

  1.2.5   化合物5的合成

  在冰浴条件下，将4.43g(14.6mmol)化合物4溶于30mL干燥的二氯甲烷中，慢慢地向反应液中加入14.8g(73.0mmol)85%间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)，待固体溶解后，撤去冰浴，室温下反应12h，TLC监测至反应完成，向反应液中加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷(30mL×4)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1:2)得到黄色固体3.45g，收率70.4%，熔点142~143 ℃。ESI-MS m/z：337.0 [M+H]⁺；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：13.18(s，1H，H-7)，9.32(s，1H，H-4)，7.58(dd，J=14.7、8.0 Hz，1H，H-4’)，7.39~7.30 (m，1H，H-5’)，7.26 (d，J=9.5Hz，1H，H-2’)，7.22(d，J=8.0Hz，1H，H-6’)，3.48(s，3H，-SO₂CH₃)。

  1.2.6   目标化合物STL127705的合成

  在氮气保护下，将3.45g(10.3mmol)化合物5和2.85g(15.5mmol)3, 4-二甲氧基苯乙胺溶于10mL N, N-二甲基乙酰胺(DMA)中，80℃反应2h，TLC监测至反应完成，向反应液中加入30mL水淬灭反应，用二氯甲烷(30mL×4)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1:2)得到黄色固体3.50g，收率77.8%，熔点212~213 ℃。HRMS (ESI) m/z：C₂₂H₂₀FN₅O₄ [M+H]⁺，理论值437.4256，实测值437.4216；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：11.51 (s，1H，H-7)，8.70 (s，1H，H-4)，7.80 (s，1H，H-9″)，7.51 (dd，J=15.1、7.7 Hz，1H，H-4’)，7.29~7.10 (m，3H，H-2’，H-5’，H-6’)，6.89 (d，J=8.4 Hz，2H，H-2″，H-5″)，6.81 (d，J=7.3 Hz，1H，H-6″)，3.79 (s，3H，-OCH₃)，3.77 (s，3H，-OCH₃)，3.67~3.61 (dd，J=7.1、6.8 Hz，2H，H-8″)，2.87 (t，J=7.3Hz，2H，H-7″)；¹³C NMR (101MHz，DMSO-d₆)δ：173.70，167.52，162.23，161.61，160.16，150.38，149.83，148.82，147.15，137.91，127.82，123.96，122.33，117.25，116.98，113.26，112.81，103.86，57.82，57.73，45.62，33.96。

  2.   结果与讨论

  从目标化合物STL127705的¹H NMR谱中观察到终产物存在互变异构现象，可能的互变异构位点为分子结构中的环内酰胺键，其可由酮式发生烯醇式互变(图式 3)。两种异构体之间存在一种动态平衡，在低温时这种互变速率比较慢，¹H NMR可以检测出两套峰，当温度升高时，互变速率变快，就会融合成一套峰。因此测试了终产物的升温(80℃)¹H NMR，图谱结果显示为一套峰，证实我们的推测。

  图式 3

  

  图式 3.  目标化合物的互变异构现象

  Scheme 3.  Tautomerism of target compound

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  中间体4和中间体5同样存在环内酰胺键，但是在¹H NMR中并未观察到明显的两套峰现象，可能是由于两种异构体稳定性差距很大，那么平衡可能99%偏向于其中一个稳定结构，¹H NMR就仅会显示一套峰。然而，目标化合物的结构发生了改变，会影响平衡的偏向，两个异构体的稳定性比较接近，在室温下观测到的¹H NMR就会显示出二者的氢峰，所以是两套峰。

  3.   结论

  本文报道了一种简单、有效的DNA-PK抑制剂STL127705的合成方法。该方法以市售化工原料为起始原料，经过6步反应，以36.8%的收率得到目标产物，纯度达到95.5%。该制备方法条件温和，无需苛刻的反应条件，方法简单，技术可行性高，为新型的具有嘧啶并嘧啶二酮结构的DNA-PK抑制剂的合成研究提供了依据。

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  图式 1  目标化合物STL127705的逆合成路线分析

  Scheme 1  Retrosynthesis of target compound STL127705

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  图式 2  本文报道的目标化合物STL127705的合成路线

  Scheme 2  Synthetic route of target compound STL127705 reported in this paper

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  图式 3  目标化合物的互变异构现象

  Scheme 3  Tautomerism of target compound

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