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  致病杆菌是斯氏线虫 (Steinernema) 的肠道共生菌, 属于肠杆菌科^[1~3].感染期的线虫 (IJ) 通过昆虫宿主的自然开口进入昆虫体腔, 随后细菌被释放到昆虫血淋巴中^[3].一方面细菌在昆虫体内快速繁殖同时产生许多毒力因子, 并协同线虫杀死宿主^{[4, 5]}; 另一方面致病杆菌产生多种抗菌物质抑制其它腐生微生物生长^[6~8], 并降解宿主尸体为线虫提供营养物质.目前已经从致病杆菌中分离到多种结构多样性的次级代谢物, 如: dithiolopyrrolones^[9], benzopyran-1-one^[10], indole^{[11, 12]}, phenylpyruvate dimmers^[13], benzylideneacetone^[14], phenethylamides^[15]和peptides^{[16, 17]}.这些次级代谢产物具有广泛的生物活性, 包括抗细菌、真菌, 杀虫, 抗肿瘤^[18~20].这些特异的生物学功能使得这类细菌被作为具有开发价值和应用前景的生物资源而备受关注.本研究利用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和半制备高效液相色谱技术对伯氏致病杆菌SN52的发酵产物进行分离纯化得到两个新的rhabduscin^{[21, 22]}类似物1和2, 运用HR-ESI-MS, 1D和2D NMR等波谱技术并结合相关文献数据确定其结构为4-O-(4-乙酰胺-β-L-鼠李糖苷)-苯甲醛 (1) 和4-O-(4-乙酰胺-β-L-鼠李糖苷)-(Z)-N-苯乙烯基甲酰胺 (2).同时测试了1和2的酚氧化酶抑制活性.

  1   结果与讨论

  1.1   化合物1的结构鉴定

  化合物1:白色粉末状固体, 易溶于甲醇.根据HR-ESI-MS (测量值m/z 310.1288 [M+H]⁺, 计算值为310.1290) 推断其分子式为C₁₅H₁₉NO₆, 并得到其¹³C NMR数据的佐证. ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆)(表 1) 显示有一个双峰甲基[δ_H 1.01 (d, J＝6.2 Hz, 3H)], 一个单峰甲基[δ_H1.91 (s, 3H)], 一组1, 4-二取代苯环信号[δ_H 7.19 (d, J＝8.8 Hz, 2H), 7.88 (d, J＝8.8 Hz, 2H)], 一个醛基质子信号[δ_H 9.89 (s, 1H)], 一个活泼氢信号[δ_H7.61 (d, J＝9.8 Hz, 1H)], 一个缩醛氢信号[δ_H5.03 (d, J＝7.1 Hz, 1H)]和四个杂原子取代的氢信号[δ_H 3.62~3.63 (m, 2H), 4.12 (dd, J＝9.8, 2.6 Hz, 1H), 3.95 (dq, J＝1.1, 6.2 Hz, 1H)]. 1DNMR和HSQC光谱信号给出2个甲基、5个次甲基、6个芳香族碳 (2组重叠的次甲基碳和2个季碳)、一个醛基和一个羰基.进一步分析¹³C NMR化学位移, 5个次甲基 (δ_C 100.0, 70.0, 71.6, 52.6, 69.9) 和甲基 (δ_C 16.6) 表明存在鼠李糖部分.在HMBC谱图 (图 2) 中δ_H4.12 (H-4′), 1.91 (H₃-8′) 与δ_C 170.4 (C-7′) 的相关, 以及¹H-¹H COSY谱图 (图 2) 中的H-4′和4′-NH的相关证明存在乙酰氨基鼠李糖苷片段.此外HMBC中δ_H 7.19 (H-2, H-6) 和δ_C162.0 (C-1) 相关, δ_H7.88 (H-3, H-5) 和δ_C 191.5 (C-7) 相关, 进一步证实存在1, 4-二取代苯环.基于从H-1′到C-1的HMBC相关信号表明, 鼠李糖环通过醚官能团连接到苯环部分.仔细比较化合物1与rhabduscin的1D和2D-NMR光谱数据, 发现它们光谱数据非常相似, 表明它们共享相同的骨架.与已知化合物rhabduscin^[21]的NMR数据比较发现, 其鼠李糖为β-吡喃糖苷构型, 此外比较rhabduscin的ROESY相关^[21]和化合物1的NOESY相关信号发现, 它们的鼠李糖部分的相对构型是相同的.到目前为止, 在自然界中已经发现鼠李糖仅以L-型存在, 而rhabduscin和1都来自Xenorhabdus spp.并且1的比旋光度[α]_D²⁸－28.6 (c 0.7, MeOH) 与rhabduscin的比旋光度[α]_D－21.8 (c 0.11, MeOH) 相近, 因此我们推断化合物1中的鼠李糖部分为L构型.最后化合物1的结构鉴定为4-O-(4-乙酰胺-β-L-鼠李糖苷)-苯甲醛 (图 1).

  图 1  化合物1, 2和rhabduscin的结构 Figure 1.  Structures of compounds 1, 2 and rhabduscin

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  图 2  化合物主要的COSY和HMBC相关信号 Figure 2.  Key ¹H-¹H COSY (bold) and HMBC (arrows) correlations of compounds 1 and 2

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  化合物2:白色粉末状固体, 易溶于甲醇.根据HR-ESI-MS (测量值m/z 351.1561 [M+H]⁺, 计算值为351.1556) 推断其分子式为C₁₇H₂₂N₂O₆.观察化合物2的¹H NMR和¹³C NMR发现和化合物1的¹H NMR和¹³C NMR高度相似.仔细分析2的1D和2D NMR谱图表明其存在1, 4-二取代的苯环和乙酰氨基鼠李糖苷部分.此外在2的¹H NMR和HSQC谱图中显示了两个烯烃信号[δ_H5.66 (d, J＝9.8 Hz, 1H) 和δ_H6.72 (dd, J＝9.8, 10.5 Hz, 1H)], 一个NH基团[δ_H 9.92 (d, J＝11.0 Hz, 1H)]和一个醛基质子信号[δ_H 8.12 (s, 1H)].进一步分析其HMBC和COSY光谱揭示了乙烯基甲酰胺基团的存在.根据偶合常数J_H7-H8＝9.8 Hz确定7位双键为Z-型.此外在δ_H7.32 (H-3, H-5) 处的质子信号与δ_C 110.1 (C-7) 处烯烃次甲基信号的¹H-¹³C长程偶联证实乙烯基甲酰胺基团连接到苯环的C-4位上 (图 2).最后根据比旋光度[α]_D²⁸－34.6 (c 1.3, MeOH) 和NOESY相关信号, 化合物2被确定为4-O-(4-乙酰胺-β-L-鼠李糖苷)-(Z)-N-苯乙烯基甲酰胺 (图 1).

  到目前为止对这类天然产物的研究较少, 结构类似物质byelyankacin^[23]首次在肠杆菌属 (Enterobacter sp. B20) 中得到鉴定, 该物质通过抑制酪氨酸酶 (酚氧化酶型酶) 表现出对人体黑色素的形成具有强的抑制活性, 并且已被发明为有效减轻色素沉着、斑点、雀斑、黄褐斑的皮肤美白剂^[24].随后在Photorhabdus luminescens 和Xenorhabdus nematophila中鉴定到rhabduscin (图 1), 它对蘑菇酪氨酸酶和昆虫酚氧化酶都具有纳摩尔级 (IC₅₀值) 的抑制水平^[22].本研究中用微孔板酶测定法^[22]对化合物1和2进行了酚氧化酶抑制活性测试, 结果显示化合物1和2对酚氧化酶都没有明显的抑制作用 (IC₅₀＞2 mmol/L).而以前的报道显示rhabduscin的IC₅₀值为纳摩尔级, 这一结果支持了异腈基官能团在酚氧化酶抑制中起关键作用的观点.

  总之利用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备高效液相色谱技术从伯氏致病杆菌SN52中, 分离鉴定了两个新的rhabduscin类似物, 它们的发现丰富了这类物质的结构多样性, 为讨论其构效关系提供了一定的物质基础.同时化合物1和2的发现证实了Xenorhabdus bovienii 中也产这类物质, 说明Xenorhabdus bovienii也含有这类结构的生物合成途径, 而我们并没有分离得到化合物rhabduscin, 其原因可能是异腈基官能团不稳定所造成的.

  2   实验部分

  2.1   仪器与试剂

  旋光仪AP-300型 (日本爱拓公司); NMR用Bruker公司的Avance 600核磁共振仪测定, TMS为内标; 高分辨质谱用美国安捷伦6500系列四级杆-飞行时间质谱仪测定; 高效液相色谱采用美国Agilent 1260, 分析型C18柱 (Agilent ZORBAX Eclipse XDB, 4.60 mm×250 mm, 5 μm) 和半制备型C18柱 (Agilent ZORBAX Eclipse XDB, 9.4 mm×250 mm, 5 μm); 柱色谱硅胶 (100~200目) 为青岛海洋化工厂生产; Sephadex LH-20为瑞士GE公司生产; 所有化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司 (中国上海); 色谱甲醇购自美国Sigma-Aldrich公司; 吸光度 (OD) 使用Multiskan^TM FC型酶标仪 (芬兰的Thermo Fisher Scientific公司).

  2.2   伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii SN52的发酵萃取

  伯氏致病杆菌SN52是沈阳农业大学植物保护学院微生物次生代谢产物研究室已鉴定的菌株 (GenBank accession No. KU297676).将保存于－80 ℃菌种库中的SN52接种于NBTA鉴别培养基中28 ℃培养24 h, 蓝色单菌落为初生型菌株用于下一步发酵.将培养好的菌株接种于发酵培养基中, 发酵培养基为M培养基 (葡萄糖0.631%, 蛋白胨2.129%, MgSO₄•7H₂O 0.15%, (NH₄)₂SO₄0.246%, KH₂PO₄ 0.086%, K₂HPO₄0.111%, NaSO₄0.172%, 总体积1000 mL pH 7.2) 装于2000 mL三角瓶中 (每瓶含400 mL)、共20 L. 28 ℃, 180 r/min条件下发酵5 d后将发酵培养物在4 ℃下6500 r/min离心30 min以除去菌体, 在室温下用3%的Amberlite XAD 16树脂吸附4 h.通过离心收集树脂并用甲醇洗脱四次, 然后将合并的甲醇洗脱液减压蒸干, 得到粗提物.将干燥的粗提物再溶解于50%的甲醇 (600 mL) 中, 将上述溶液用等体积的二氯甲烷萃取四次, 得到棕色浸膏6.5 g.

  2.3   分离纯化

  6.5 g浸膏经硅胶柱色谱[350 mm×40 mm; V(CH₂Cl₂)：V(MeOH)＝100：2, 100：6, 100：12, 100：100和0：100, 每个梯度2 L]梯度洗脱, TLC检测合并为5个部分 (Fr.1~Fr.5). Fr.5 (1.5 g) 经凝胶Sephadex LH-20柱色谱 (MeOH洗脱) 纯化后, 再用半制备HPLC [流动相: V(MeOH)：V(H₂O)＝24：76, 3 mL/min]进一步分离纯化得到化合物1 (7 mg, t_R＝17.4 min) 和2 (13 mg, t_R＝35.3 min).

  4-O-(4-乙酰胺-β-L-鼠李糖苷)-苯甲醛 (1):白色粉末, m.p. 113~127 ℃; [α]_D²⁸－28.6 (c 0.7, MeOH); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) 和¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) 见表 1; HR-ESI-MS calcd for C₁₅H₂₀NO₆[M+H]⁺ 310.1290, found 310.1288.

  表 1  化合物1和2的氢谱和碳谱数据^a Table 1.  ¹H NMR and ¹³C NMR data for compounds 1 and 2

  表选项

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  Position	1			2
  	δC	δH (J in Hz)		δC	δH (J in Hz)
  1	162.0			160.0
  2, 6	116.2	7.19 d (8.8)		116.2	7.01 d (8.6)
  3, 5	131.7	7.88 d (8.8)		129.4	7.32 d (8.6)
  4	130.4			128.8
  7	191.5	9.89 s		110.1	5.66 d (9.8)
  8				118.8	6.72 dd (9.8, 10.5)
  9				156.0	8.12 s
  1'	100.0	5.03 d (7.1)		100.7	4.87 d (6.9)
  2'	70.0	3.62~3.63 m		70.1	3.59~3.60 m
  3'	71.6	3.62~3.63 m		71.7	3.59~3.60 m
  4'	52.6	4.12 dd (9.8, 2.6)		52.7	4.10 dd (9.4, 1.7)
  5'	69.9	3.95 dq (1.1, 6.2)		69.7	3.88 dq (1.5, 6.2)
  6'	16.6	1.01 d (6.2)		16.7	1.01 d (6.2)
  7'	170.4			170.4
  8'	22.6	1.91 s		22.6	1.91 s
  4'-NH		7.61 d (9.8)			7.60 d (9.4)
  8-NH					9.92 d (11.0)
  aRecorded in DMSO-d6; 1H NMR (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz).

  表 1  化合物1和2的氢谱和碳谱数据^a
  Table 1.  ¹H NMR and ¹³C NMR data for compounds 1 and 2

  4-O-(4-乙酰胺-β-L-鼠李糖苷)-(Z)-N-苯乙烯基甲酰胺 (2):白色粉末, m.p. 131~135 ℃; [α]_D²⁸－34.6 (c 1.3, MeOH); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) 和¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) 见表 1; HR-ESI-MS calcd for C₁₇H₂₃-N₂O₆ [M+H]⁺ 351.1556, found 351.1561.

  2.4   酚氧化酶抑制活性测试

  试供昆虫为蜡螟幼虫 (Galleria mellonella) 来自本实验室人工饲养.通过使用Crawford等^[22]所描述的微孔板酶测定法评价化合物1和2对酚氧化酶的抑制活性.使用曲酸作为阳性对照并且用5% DMSO溶液作为空白对照.于酶标仪490 nm波长下测定光密度 (OD) 每分钟的变化, 并获得初始速率.使用GraphPad Prism 5的非线性回归计算IC₅₀值.

  辅助材料 (Supporting Information)新化合物1和2的¹H NMR, ¹³C NMR, HR-ESI-MS, HSQC, HMBC, COSY和NOESY谱图.这些材料可以免费从本刊网站 (http://sioc-journal.cn/) 上下载.

• 1. [1]

     Akhurst, R. J. Rev. Nematol. 1982, 5, 277.

  2. [2]

     Boemare, N. E.; Akhurst, R. J. Gen. Microbiol. 1988, 134, 751. doi: 10.1099/00221287-134-3-751

  3. [3]

     Forst, S.; Nealson, K. Microbiol. Rev. 1996, 60, 21.

  4. [4]

     Forst, S.; Dowds, B.; Boemare, N.; Stackebrandt, E. Annu. Rev. Microbiol. 1997, 51, 47. doi: 10.1146/annurev.micro.51.1.47

  5. [5]

     Herbert, E. E.; Goodrich-Blair, H. Nat. Rev. Microbiol. 2007, 5, 634. doi: 10.1038/nrmicro1706

  6. [6]

     Akhurst, R. J. J. Gen. Microbiol. 1982, 128, 3061. doi: 10.1099/00221287-128-12-3061

  7. [7]

     Boemare, N. E.; Boyer-Giglio, M. H.; Thaler, J. O.; Akhurst, R. J.; Brehelin, M. Environ. Microbiol. 1992, 58, 3032.

  8. [8]

     Singh, S.; Orr, D.; Divinagracia, E.; McGraw, J.; Dorff, K.; Forst, S. Appl. Environ. Microbiol. 2015, 81, 754. doi: 10.1128/AEM.02650-14

  9. [9]

     McInerney, B. V.; Gregson, R. P.; Lacey, M. J.; Akhurst, R. J.; Lyons, G. R.; Rhodes, S. H.; Smith, D. R.; Engelhardt, L. M.; White, A. H. J. Nat. Prod. 1991, 54, 774. doi: 10.1021/np50075a005

  10. [10]

      McInerney, B. V.; Taylor, W. C.; Lacey, M. J.; Akhurst, R. J.; Gregson, R. P. J. Nat. Prod. 1991, 54, 785. doi: 10.1021/np50075a006

  11. [11]

      Li, J.; Chen, G.; Webster, J. M.; Czyzewska, E. J. Nat. Prod. 1995, 58, 1081. doi: 10.1021/np50121a016

  12. [12]

      Li, J.; Chen, G.; Webster, J. M. Can. J. Microbiol. 1997, 43, 770. doi: 10.1139/m97-110

  13. [13]

      Brachmann, A. O.; Forst, S.; Furgani, G. M.; Fodor, A.; Bode, H. B. J. Nat. Prod. 2006, 69, 1830. doi: 10.1021/np060409n

  14. [14]

      Ji, D.; Yi, Y.; Kang, G. H.; Choi, Y. H.; Kim, P.; Baek, N. I.; Kim, Y. FEMS Microbiol. Lett. 2004, 239, 241. doi: 10.1016/j.femsle.2004.08.041

  15. [15]

      Lang, G.; Kalvelage, T.; Peters, A.; Wiese, J.; Imhoff, J. F. J. Nat. Prod. 2008, 71, 1074. doi: 10.1021/np800053n

  16. [16]

      Paik, S.; Park, Y. H.; Suh, S. I.; Kim, H. S.; Lee, I. S.; Park, M. K.; Lee, C. S.; Park, S. H. Bull. Korean Chem. Soc. 2001, 22, 372.

  17. [17]

      Gualtieri, M.; Aumelas, A.; Thaler, J. O. J. Antibiot. 2009, 62, 295. doi: 10.1038/ja.2009.31

  18. [18]

      Seo, S.; Lee, S.; Hong, Y.; Kim, Y. Appl. Environ. Microbol. 2012, 78, 3816. doi: 10.1128/AEM.00301-12

  19. [19]

      Li, B.; Lyle, M. P.; Chen, G.; Li, J.; Hu, K.; Tang, L.; Alaoui-Jamali, M. A.; Webster, J. Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 4601. doi: 10.1016/j.bmc.2007.04.017

  20. [20]

      Li, J.; Hu, K.; Webster, J. M. Chem. Heterocycl. Commun. 1998, 34, 1331. doi: 10.1007/BF02256814

  21. [21]

      Crawford, J. M.; Kontnik, R.; Clardy, J. Curr. Biol. 2010, 20, 69. doi: 10.1016/j.cub.2009.10.059

  22. [22]

      Crawford, J. M.; Portmann, C.; Zhang, X.; Roeffaers, M. B.; Clardy, J. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 2012, 109, 10821. doi: 10.1073/pnas.1201160109

  23. [23]

      Takahashi, S.; Iwai, H.; Kosaka, K.; Miyazaki, T.; Osanai, Y.; Arao, N.; Tanaka, K.; Nagai, K.; Nakagawa, A. J. Antibiot. 2007, 60, 717. doi: 10.1038/ja.2007.93

  24. [24]

      Nakagawa, A. US 7115721, 2006 [Chem. Abstr. 2006, 2474467].

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  图 1  化合物1, 2和rhabduscin的结构

  Figure 1  Structures of compounds 1, 2 and rhabduscin

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  图 2  化合物主要的COSY和HMBC相关信号

  Figure 2  Key ¹H-¹H COSY (bold) and HMBC (arrows) correlations of compounds 1 and 2

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  表 1  化合物1和2的氢谱和碳谱数据^a

  Table 1.  ¹H NMR and ¹³C NMR data for compounds 1 and 2

  Position	1			2
  	δC	δH (J in Hz)		δC	δH (J in Hz)
  1	162.0			160.0
  2, 6	116.2	7.19 d (8.8)		116.2	7.01 d (8.6)
  3, 5	131.7	7.88 d (8.8)		129.4	7.32 d (8.6)
  4	130.4			128.8
  7	191.5	9.89 s		110.1	5.66 d (9.8)
  8				118.8	6.72 dd (9.8, 10.5)
  9				156.0	8.12 s
  1'	100.0	5.03 d (7.1)		100.7	4.87 d (6.9)
  2'	70.0	3.62~3.63 m		70.1	3.59~3.60 m
  3'	71.6	3.62~3.63 m		71.7	3.59~3.60 m
  4'	52.6	4.12 dd (9.8, 2.6)		52.7	4.10 dd (9.4, 1.7)
  5'	69.9	3.95 dq (1.1, 6.2)		69.7	3.88 dq (1.5, 6.2)
  6'	16.6	1.01 d (6.2)		16.7	1.01 d (6.2)
  7'	170.4			170.4
  8'	22.6	1.91 s		22.6	1.91 s
  4'-NH		7.61 d (9.8)			7.60 d (9.4)
  8-NH					9.92 d (11.0)
  aRecorded in DMSO-d6; 1H NMR (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz).

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