English

• 1.   引言

  商业化的仪器、软件和现代化的工作流程使得液相色谱法(Liquid chromatography)成为日常分析表征中不可缺少的重要技术，在生命科学、环境科学等领域得到广泛应用。随着对分析速度、分析效率和经济适用性要求的不断提高，分析仪器的微型化已经成为分析领域的一个重要发展趋势^[1~4]。近年来，来自于生物有机体的复杂样品的分离分析得到了广泛的关注和迅速的发展，其中对于包括单细胞及亚细胞样品^[5~7]、法医学样品^[8]、临床样品^[9]等在内的珍贵样品的研究占有重要的地位。目前，珍贵样品的分析由于其微小的样品量和复杂的化学组成而面临着巨大的挑战，迫切需要建立一种高灵敏、高选择性的微型化分离检测技术。新型分离系统的微型化也成为色谱领域所面临的重要挑战。

  微量进样系统、微柱分离系统及微驱动系统的发展极大地促进了液相色谱系统的微型化^{[10, 11]}。例如，微升/纳升吸移管(Micropipettes/nanopipettes)^{[12, 13]}和飞升吸移管(Femto-liter pipettes)^[14]的研究实现了从细胞内等微小体积样品中直接取样，电渗泵^[15]等微泵的出现克服了常规液相色谱系统中流动相需要分流的问题。色谱柱的微型化是液相色谱系统微型化中最重要的组成部分。随着微型化的发展，色谱柱的内径已经从mm级别减小到μm级别^[16~20]。随着色谱柱内径的减小，分离效率升高，信噪比增加，柱内扩散减小^[21~24]。另外，与常规色谱柱相比，窄内径色谱柱有效减少了流动相的消耗和废液的产生，降低了环境污染。

  多孔层开管柱(Porous layer open tubular column, PLOT column)是在毛细管内壁上生长一层多孔层作为固定相的重要微柱形式。1958年，Golay首先提出了PLOT柱的设想^[25]。随后在1960年，Golay详细描述了该提案。他提议制作一种内径中间9/10是开放通道的半填充柱，在外围剩余空间有一层填充材料薄层^[25]。1962年，Halász和Heine^[26]制备了“填充毛细管柱”并应用于低沸点碳氢化合物的气相色谱分离，实现了Golay的设想。该填充毛细管柱在毛细管中插入一根干净的钢丝，在毛细管与钢丝之间填入吸附剂，随后取出钢丝。1963年，Halász等^[27]从真正意义上实现了PLOT柱。首先，制备出凃渍载体的悬浮液，将悬浮液注入毛细管中，闭合毛细管的一端，从毛细管的开口端开始缓慢地以恒定速率通过加热狭缝进入空气温控器，使得毛细管内溶剂蒸发，从毛细管开口端逸出。在毛细管的内壁上留下一层涂渍了液体相的载体，形成了载体涂渍开管柱。同年，Golay等^[28]进一步研究了PLOT气相色谱柱的理论板当量高度。随后PLOT柱被大量应用于气相色谱分离并引入液相色谱领域。随着超小体积进样装置和高灵敏度检测器的发展，PLOT柱在液相色谱领域得到迅速发展。

  近年来，Collins等^[29]和Knob等^[30]分别对应用于毛细管液相色谱中的PLOT柱和能够提高PLOT柱表面积的制备方法进行了综述。本文聚焦于内径≤25 μm的窄内径的PLOT毛细管柱的制备方法，以及用于窄内径PLOT毛细管柱的高灵敏检测方法和窄内径PLOT毛细管柱在液相色谱中的应用。

  2.   窄内径PLOT柱的制备

  PLOT柱的制备方法决定了分析方法的再现性和柱性能。根据多孔层材料的种类，窄内径PLOT柱主要分为有机聚合物PLOT柱和无机二氧化硅PLOT柱。

  2.1   通用于粗内径PLOT柱和窄内径PLOT柱的方法

  尽管一些制备方法是为粗内径毛细管制备PLOT柱或整体柱发展起来，但是经过调整后也适用于窄内径PLOT柱的制备。

  1993年，Crego等^[31]基于正硅酸乙酯(TEOS)在特定pH值水-乙醇溶液中发生水解和聚合反应，在50-μm-i.d.毛细管内壁制备二氧化硅凝胶，随后化学键合C₁₈基团。该制备方法不仅被用于50-μm-i.d.的毛细管，也被用于在5-μm-i.d.和10-μm-i.d.的毛细管中制备多孔层。结果表明，使用完全相同的制备方案制备的10-μm-i.d.的PLOT柱出现堵塞的现象。此时，减少预凝胶时间，在5-μm-i.d.和10-μm-i.d.的毛细管中制备PLOT柱的成功率明显提高。值得注意的是，当5-μm-i.d. PLOT柱的预凝胶时间为6 h而10-μm-i.d. PLOT柱的预凝胶时间为6.5 h时，5-μm-i.d. PLOT柱中多孔层的厚度是10-μm-i.d. PLOT柱中多孔层厚度的1/2，但是保留值k′比10-μm-i.d. PLOT柱更大。这是由于5-μm-i.d. PLOT柱的内腔体积是10-μm-i.d. PLOT柱的1/4，其相比(Phase ratio)比10-μm-i.d. PLOT柱大2倍。由此结果可知，为了提高保留值，降低柱内径比增加多孔层的厚度更有效果。Peng等^[32]通过原子转移自由基聚合的方法在10-μm-i.d.、25-μm-i.d.和50-μm-i.d.的毛细管中以[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(MSA)为两性离子单体，N, N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂制备了聚[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(pMSA)PLOT柱。图 1是裸毛细管和制备的一系列pMSA PLOT柱的扫描电镜图，在3种不同内径的毛细管中发生聚合反应制得的pMSA PLOT柱的形貌各不相同，50-μm-i.d.的毛细管中全部长满了聚合物，形成了整体柱；10-μm-i.d.和25-μm-i.d.的毛细管中均在内壁上生长了多孔聚合物，形成了PLOT柱。此研究结果也符合Nischang等^[33]在其综述中的结论，表面/体积比(Surface-to-volume ratio)越大越容易在毛细管中间形成多孔聚合物床，比值越小越容易在毛细管壁上生长多孔聚合物，越有利于制备开管柱。He等^[34]也研究了限域效应对毛细管中生长的多孔聚合物的形貌的影响。

  图 1

  

  图 1.  裸毛细管和制备的一系列PLOT柱的扫描电镜(SEM)图^[32]。(A)裸毛细管(标尺5 μm)；(B) PLOT-3 (25-μm-i.d., 在50℃聚合反应6 h，标尺5 μm)(C)PLOT-4(25-μm-i.d.，在50℃聚合反应10 h，标尺5 μm)；(D)PLOT-5 (25-μm-i.d.，在50℃下聚合反应14 h，标尺5 μm)；(E)PLOT-1(10-μm-i.d.，在50℃下聚合反应10 h，标尺2 μm)；(F)PLOT-2 (50-μm-i.d.，在50℃下聚合反应10 h，标尺10 μm)

  Figure 1.  Scanning electron microscope (SEM) images of bare capillary and several synthesized porous layer open tubular (PLOT) column ^[32]: (A) bare capillary (scar bar 5 μm); (B) PLOT-3 (25-μm-i.d., polymerization reaction; 6 h at 50℃, scar bar 5 μm); (C) PLOT-4 (25-μm-i.d., polymerization reaction: 10 h at 50℃, scar bar 5 μm); (D) PLOT-5 (25-μm-i.d., polymerization reaction: 14 h at 50℃, scar bar 5 μm); (E) PLOT-1 (10-μm-i.d., polymerization reaction: 10 h at 50℃, scar bar 2 μm). (F) PLOT-2 (50-μm-i.d., polymerization reaction 10 h at 50℃, scar bar 10 μm)

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  2.2   窄内径有机聚合物PLOT柱

  有机聚合物PLOT柱在较宽的pH值范围内具有较好的稳定性，制备方法较为简便，易于调整多孔结构和表面化学性质^[35]。但是，当使用的流动相中存在有机溶剂时，聚合物多孔层易发生溶胀和收缩，从而影响使用寿命和分离结果的重复性。

  2.2.1   自由基聚合反应制备窄内径PLOT柱

  热引发自由基聚合反应常被用于窄内径有机聚合物PLOT柱的制备，制备过程主要分为3个步骤：活化、修饰和聚合。熔融石英毛细管内表面的硅醇基团密度很低^[36]，为进行下一步修饰，首先要将毛细管表面的硅氧烷基团转化成硅烷醇基团。碱溶液如NaOH能够有效活化毛细管^[37]，使硅醇基团暴露。活化步骤包括碱液与毛细管作用、碱液的冲洗和吹干。Yue等^[37]在室温下使用1.0 mol/L NaOH溶液冲洗毛细管整夜，Rogeberg等^[38]将毛细管注满1.0 mol/L NaOH溶液，两端密封后放入100℃柱温箱中加热2 h，两种方法均能得到紧密键合在毛细管内壁上的聚合物层。第二个步骤是使用硅烷化试剂对毛细管进行修饰，该步骤决定了聚合物层能否共价键合在毛细管内壁上和PLOT柱的机械强度^[39]。毛细管经活化后吹干，注入硅烷化试剂溶液如3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)进行反应。Courtois等^[39]系统研究了11种硅烷化方案，不同的硅烷化时间、硅烷化温度、硅烷化试剂与溶剂的比例等均影响后续的制备结果。最后，将含有单体、致孔剂和热引发剂的预聚合溶液引入毛细管中，密封两端，加热，原位制备了有机聚合物PLOT柱。使用的单体主要有苯乙烯^{[37, 40]}、二乙烯基苯^{[37, 40]}、[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵^[32]、甲基丙烯酸苄基酯^[41]等。致孔剂既可以用一元致孔剂^{[42, 43]}，也可以用二元致孔剂^[14]，致孔剂有甲醇、乙醇、环己醇、正十二烷醇等。这种热引发自由基聚合反应方法操作简便，易于控制，在窄内径聚合物PLOT的制备方法中占有重要地位。

  2.2.2   表面修饰窄内径PLOT柱

  先基于上面聚合的方法制备PLOT柱，再进一步进行原位修饰，可以制备出不同功能的色谱柱。Luo等^[43]以氯甲基苯乙烯和二乙烯基苯为单体，甲醇为致孔剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为热引发剂在10-μm-i.d.的毛细管中制备了聚(氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯)PLOT柱，以氯甲基苯乙烯为单体制备的PLOT柱有利于进一步表面修饰。随后，通入乙二胺进行原位修饰，制备出了氨基键合的聚(氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯)HILIC-PLOT柱，用于多糖的分离。2.5 m长的HILIC-PLOT柱在20 nL/min的流速下背压约为700 psi，在如此低的流速下，多糖的离子化效率提高了10倍以上。除此之外，Luo等还制备了酰胺键合的HILIC-PLOT柱和磺基甜菜碱键合的HILIC-PLOT柱用于高度复杂的样品的分离^[43]。

  2.2.3   窄内径阵列PLOT柱

  窄内径PLOT柱具有消耗样品体积小等优点。同时，由于PLOT柱的内径窄小导致其内表面积小，所能够生长或刻蚀得到的多孔材料有限，从而在柱容量方面受到限制。为满足液相色谱应用中固定相容量和背压的需求，Kazarian等^[44]在含有126条内径为4 μm的平行通道的熔融石英光子晶体纤维(Fused silica photonic crystal fibres，FS-PCF)毛细管中均键合了聚苯乙烯—二乙烯基苯(PS-DVB)的多孔层，制备了一种窄内径多通道PLOT柱(图 2)。通过调整预聚合溶液的配比，得到了纵向均匀的修饰层，各通道聚合物层的厚度为(0.26±0.02) μm。这种新PLOT柱成功应用于多环芳香烃的固相微萃取和标准蛋白细胞色素C的色谱分离，萃取回收率在77%~103%之间，在等度洗脱的条件下，多次进样的保留时间重现性低于1%。一根20 cm的PLOT柱，流动相含30%乙腈，流速为0.4 μL/min时，测得的背压＜50 bar。

  图 2

  

  图 2.  在内径为4 μm的FS-PCFs通道内制备的PLOT柱^[44]。(A)未修饰的FS-PCF的结构；(B)典型的表面修饰后的FS-PCF；(C)表面修饰后的FS-PCF的高分辨照片

  Figure 2.  Preparation of PLOT columns within a 4-μm channel I.D. Fused silica photonic crystal fibres (FS-PCFs)^[44]: (A) FS-PCF structure in its unmodified format; (B) Typical PS-PCF following surface modification; (C) High resolution images of FS-PCF channels

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  2.3   窄内径二氧化硅PLOT柱

  相比于有机聚合物PLOT柱，无机二氧化硅PLOT柱具有更好的机械稳定性，在有机溶剂中不易发生溶胀和收缩。溶胶-凝胶反应制备二氧化硅PLOT柱的主要步骤包括^[45]：(1)毛细管的预处理；(2)水解和缩聚过程；(3)硅烷化。在制备二氧化硅PLOT柱时毛细管也要通过碱溶液刻蚀或水热处理^[31]。在酸或碱的催化下，硅醇盐前驱体如四乙氧基硅烷、四甲氧基硅烷等进行水解，缩聚成为凝胶，老化和脱水后形成干凝胶，得到多孔二氧化硅层。二氧化硅层可进一步修饰键合上其它基团。

  2016年, Hara等^[46]通过溶胶-凝胶过程在5-μm-i.d.毛细管中制备了300~550 nm厚的介孔二氧化硅层。将含有四甲氧基硅烷(TMOS)、尿素、聚乙二醇和0.01 mol/L醋酸溶液的溶液推入毛细管，在25℃凝胶化20 h，随后在95℃下进行水热处理，尿素水解生成氨使凝胶形成中孔，用甲醇冲洗PLOT柱后干燥。根据TMOS含量的不同，Hara等设定了3种制备方案。图 3是使用3种不同方案制备得到的PLOT柱的扫描电镜图。结果表明，在5-μm-i.d.毛细管中，随着原料溶液中四甲氧基硅烷(TMOS)含量的增加，PLOT柱中多孔层的体积增加，然而，将TMOS的含量由7.2 mL增加到8.0 mL时也很难引起“浸润相变”(“Wetting transition”)所需要的相分离了，制得的多孔层的厚度也无法进一步增加。毛细管的内径尺寸^{[46, 47]}和溶胶-凝胶过程中不同阶段各参数^[31](如各原料之间的比例、催化剂溶液的pH值、预凝胶的温度和时间等)的变化均影响所制备的PLOT柱的结构特性。

  图 3

  

  图 3.  不同方案制备得到的PLOT柱的扫描电镜图^[46]：(A)PLOT(5)-A，5 μmi.d.毛细管，方案A(5.0 mL的TMOS)，(B)PLOT(5)-B，5 μmi.d.毛细管，方案B(6.4 mL的TMOS)，(C)PLOT(5)-C, 5 μm i.d.毛细管，方案C (7.2 mL的TMOS)，放大倍率是10000倍，标尺是500 nm

  Figure 3.  Scanning electron micrographs^[46] of (A) PLOT (5)-A, 5 μmi.d. capillary with recipe A (5.0 mL of tetramethoxysilane(TMOS)), (B) PLOT (5)-B, 5 μmi.d. capillary with recipe B (6.4 mL of TMOS), and (C) PLOT(5)-C, 5 μmi.d. capillary with recipe C (7.2 mL of TMOS). The measurements were carried out at 10000 fold magnification, and the scale bars correspond to 500 nm

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  3.   与窄内径PLOT柱联用的质谱检测方法

  无论是针对小分子代谢物、蛋白质，还是细胞萃取液中的组分，在复杂生物基质中识别未知分析物仍然是一个巨大的挑战。质谱法是一种高灵敏、高特异性、无需衍生的检测方法，能够在一次分析中提供丰富的结构信息，是研究未知样品的重要工具。样品基质的复杂性会导致分子特性丢失或掩盖，液相色谱与质谱连用(LC-MS)方法能够有效地解决该问题。LC-MS在组学分析^[48](如蛋白质组学、代谢组学等)和单细胞分析中得到广泛应用并促进了窄内径色谱柱的发展。

  Karger课题组^{[37, 40, 42, 43, 49~51]}对超窄内径PLOT液相色谱—质谱联用方法做了大量研究。电喷雾离子源(ESI)的离子化效率与分析物的性质、流动相的体积流速和喷针的形状和尺寸相关。超窄内径PLOT柱与电喷雾离子源质谱(ESI-MS)联用，色谱柱的窄内径降低了样品的带展宽，导致洗脱的样品浓度高，流速低，电喷雾的液滴尺寸更小，降低了离子抑制的可能性，提高了分析物的离子化效率。另外，在低流速下，电喷雾喷针能够放置在离MS入口更近的地方，提高了进样效率。Karger课题组使用10-μm-i.d.的PLOT柱与质谱相连，流动相的流速约为20 nL/min，离子化效率明显提高^[43]，检测灵敏度低至zeptomole级别^[50]。Luo等^[43]制备了2.5 m长的10-μm-i.d.的HILIC-PLOT柱，详细研究了流动相的体积流速对多糖离子化效率的影响，结果如图 4所示，体积流速低于50 nL/min时，多糖的离子化效率明显提高，离子抑制降低。在20 nL/min流速下，一次分析中发现了卵清蛋白酶促释放的28种多糖并分析了多糖的结构。窄内径PLOT柱与MS的结合对于复杂体系中分析物的识别和结构解析具有巨大潜力。

  图 4

  

  图 4.  不同液体流速下血管紧张肽(10^-6mol/L)、乳-N-四糖(10^-5 mol/L)和3-唾液酸化-四糖(10^-5 mol/L)(1:10:10)的离子强度比较^[43]：(A)血管紧张肽、乳-N-四糖和3-唾液酸化-四糖的离子化效率作为流速的函数；(B)不同流速下血管紧张肽、乳-N-四糖和3-唾液酸化-四糖的离子化效率比。I、F和C分别表示强度、流速和浓度

  Figure 4.  Comparison of ion intensities for angiotensin (10^-6 mol/L), lacto-N-tetraose (10^-5 mol/L), and 3-sialyl-tetrasaccharide (10^-5mol/L) (1:10:10) at different liquid flow rates^[43]: (A) ionization efficiencies of angiotensin, lacto-N-tetraose, and 3-sialyltetrasaccharide as a function of flow rate and (B) ionization efficiency ratio of 3-sialyl-tetrasaccharide and lacto-N-tetraose to angiotensin at different flow rates. I, F and C represent intensity, flow rate, and concentration, respectively

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  4.   窄内径PLOT柱的应用

  4.1   超小体积样品分析

  细胞是有机生命体的基本单元，近年来单细胞及亚细胞样品的分析成为分析化学研究的一大热点，为适应超小体积样品的分离分析，Li等^[14]制备了一种集取样与分离功能为一体的等内径双功能色谱柱(图 5)。这种双功能色谱柱由内径为900 nm外径为150 μm的熔融石英毛细管制备，以O-[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基氨基甲酰基]-10, 11-二氢奎尼丁(MQD)作为手性试剂制备了手性皮流多孔层开管柱(pico-PLOT)，通过HF刻蚀得到外径约5 μm的细小尖端并作为飞升取样器。通过电渗泵驱动，pico-PLOT能够直接进样约几百fL的氨基酸手性对映体样品，在13.50 pL/min流速下实现基线高效分离。这种双功能色谱柱在超小体积样品分析领域，特别是在单细胞分析领域中具有很好的应用前景。

  图 5

  

  图 5.  (A) 双功能色谱柱的飞升取样器尖端的SEM图^[14]：(a)侧面图；(b)尖端的截面图。(B)SEM图和TEM图^[14]：(a)内径是900 nm的裸毛细管的SEM图；(b)pico-PLOT柱的截面图；(c)图为(b)的SEM放大图；(d)pico-PLOT溶解掉二氧化硅管壁后遗留的聚合物的TEM图

  Figure 5.  (A) SEM images of femtopipette tip end of bifunctional chromatographic column^[14]:(a) side view; (b) cross-section view of the tip. (B) SEM and TEM images^[14]: (a) SEM image of a bare capillary with an inner diameter of 900 nm; (b) SEM image of cross-sectional view of pico-PLOT column; (c) magnified SEM image of (b); (d) TEM image of left polymer tube after dissolving the silica capillary wall of the pico-PLOT column

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  4.2   细胞裂解液分析

  血液和组织中的稀有细胞作为疾病状态的特异性指标、成年人干细胞的来源和患者分层与监测的重要工具而具有重要的研究意义。Li等^[50]研究了一种集合免疫亲和微流控磁泳隔离、聚焦超声辅助裂解、SPE-PLOT-nLC-MS/MS分析的平台对MCF-7细胞等细胞裂解液进行蛋白质组学图谱分析。10-μm-i.d.的聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)PLOT柱与质谱联用技术每次能够分析100~200个细胞，可识别约4000种蛋白质。

  此外，Thakur等^[49]将激光捕获纤维切割与短程十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Short-range SDS-PAGE)和LC-MS结合，对10000个细胞的细胞裂解液进行精确蛋白质组学图谱分析。该方法使用的液相色谱柱为10-μm-i.d. PS-DVB PLOT柱。经过优化后，该方法被用于原发性和转移性乳腺癌细胞裂解液的分析，每种细胞类型中能够识别约1700种蛋白质。无标记定量对原发性癌细胞群体和转移性癌细胞群体的不同的蛋白质表达进行了鉴定，信息学分析证明了两种细胞类型的囊泡转移和胞外重构明显发生改变。这种分析流程对于有限量、富含信息量的细胞群体的分析具有重要意义。

  蛋白质的糖基化是真核生物中最广泛且最复杂的翻译后修饰过程，调节细胞过程的多样性，与DNA转录和RNA翻译不同，糖基化没有模板，而是在酶的作用下添加单糖或多糖到蛋白质骨架上，这就导致了蛋白质糖基化的多样性和异质性^[52~54]。蛋白质糖基化的改变包括多糖结构的变化和占用位点的变化，糖基化的异常可以作为很多疾病的标志^[55]。Wang等^[51]运用超窄内径PLOT柱(2.5 m×10-μm-i.d.)-线性离子阱碰撞诱导裂解/电子转移解离质谱对N位糖基化进行了位点特异性表征。经过10次LC-MS分析，仅消耗100 fmol蛋白消化物即可识别并定量分析了3种触珠蛋白的糖肽上的全部26种糖链异质体/多糖，此外还测定了多糖的占位水平。

  4.3   蛋白质组学分析

  窄内径PLOT LC-MS技术被广泛用于蛋白质组学分析。蛋白质组学的常规分析策略分为“自上而下(Top-down)”和“自下而上(Bottom-up)”。

  4.3.1   “自下而上”蛋白质组学

  在蛋白质组学分析中，“自下而上”分析策略是将蛋白质酶解成多肽，通过质谱分析肽段从而识别蛋白质。“自上而下”分析策略是将完整的蛋白质作为一个整体直接进行质谱分析。与“自上而下”分析策略相比，“自下而上”分析策略更受青睐，这是由于多肽比完整蛋白质更易分离、离子化和打碎^[56]，而且灵敏度更高，分析通量更大。

  Hustoft等^[57]提出了一种高灵敏、高选择性的开管纳米蛋白质组学平台(Open tubular nanoproteomic platform)用于分析ng样品中的目标蛋白质。该平台包括20-μm-i.d.固定有胰蛋白酶和胞内蛋白酶赖氨酸-C的开管酶反应器、50-μm-i.d.预柱、10 -μm-i.d.聚苯乙烯-二乙烯基苯PLOT柱和质谱，能够加速在线蛋白质消化，适用于有限量样品的分析。结果表明，Wnt通路蛋白Axin1能够从仅10 ng样品中被辨别出来，在综合模式下，HCT15结肠癌细胞中约1500种蛋白质可以在240 min内实现在线消化和检测。此外，Hustoft等^[58]也将在线酶解-“sub-chip”尺寸开管LC-MS方法用于血清胃泌素释放肽前体(ProGRP)的检测。

  4.3.2   “自上而下”蛋白质组学

  “自上而下”的分析策略更适用于分析蛋白质不同的修饰和选择性剪切状态。传统填充柱液相色谱分离完整蛋白质时易出现吸附、带展宽等现象^[56]。Rogeberg等^[56]将3 m长的10-μm-i.d. PLOT柱用于完整蛋白质的分离，有效解决了传统填充柱中存在的问题，得到的样品峰宽和峰形更窄，遗留(Carry-over)更少，柱内和柱间保留时间重复性低于0.6%和2.5%(相对标准偏差，RSD)。该分析系统也被应用于脱脂牛奶中蛋白质的分离。

  4.4   小分子化合物分析

  通过溶胶-凝胶法制备的5~20-μm-i.d.二氧化硅PLOT柱被用于分离小分子化合物。Hara等^[46]在5-μm-i.d.ODS修饰的二氧化硅PLOT柱中分离香豆素440、香豆素450、香豆素460、香豆素480，PLOT柱长60 cm，多孔层厚度为300 nm时，理论塔板数达到150000。除此之外，二氧化硅PLOT柱也被用于多环芳烃^{[31, 45, 59]}和农药^[60]的分离。

  5.   结论与展望

  单细胞分析已成为近年来的研究热点，但适用于这类超小体积样品分离且内径小于5-μm-i.d.的PLOT柱的研究仍然较为匮乏。目前，开管柱的柱效已经达到每米百万理论塔板数，然而60 cm长的5-μm-i.d. PLOT柱的柱效率约为15万理论塔板数，需要进一步提高窄内径PLOT柱的分离效率、柱容量来适应更加复杂的生物样品的研究。当前，窄内径PLOT柱的制备周期过长，制备时间的缩短有利于PLOT柱的广泛应用。光引发聚合反应是制备粗内径PLOT柱的主要方法之一，这类方法用时短、效率高，然而这种方法并未被广泛推广到窄内径PLOT柱的制备中。窄内径PLOT柱正常用于液相色谱分离时处于液体环境中，然而大多数表征方法如扫描电镜在表征多孔层时是干燥状态，无法反映PLOT柱工作时真实的情况。由于这类PLOT柱的内径非常窄、多孔层厚度薄，用于常规PLOT柱的表征手段已不能满足窄内径PLOT柱的需要，发展相应的表征方法也成为窄内径PLOT柱的重要发展方向。

  
  
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  图 1  裸毛细管和制备的一系列PLOT柱的扫描电镜(SEM)图^[32]。(A)裸毛细管(标尺5 μm)；(B) PLOT-3 (25-μm-i.d., 在50℃聚合反应6 h，标尺5 μm)(C)PLOT-4(25-μm-i.d.，在50℃聚合反应10 h，标尺5 μm)；(D)PLOT-5 (25-μm-i.d.，在50℃下聚合反应14 h，标尺5 μm)；(E)PLOT-1(10-μm-i.d.，在50℃下聚合反应10 h，标尺2 μm)；(F)PLOT-2 (50-μm-i.d.，在50℃下聚合反应10 h，标尺10 μm)

  Figure 1  Scanning electron microscope (SEM) images of bare capillary and several synthesized porous layer open tubular (PLOT) column ^[32]: (A) bare capillary (scar bar 5 μm); (B) PLOT-3 (25-μm-i.d., polymerization reaction; 6 h at 50℃, scar bar 5 μm); (C) PLOT-4 (25-μm-i.d., polymerization reaction: 10 h at 50℃, scar bar 5 μm); (D) PLOT-5 (25-μm-i.d., polymerization reaction: 14 h at 50℃, scar bar 5 μm); (E) PLOT-1 (10-μm-i.d., polymerization reaction: 10 h at 50℃, scar bar 2 μm). (F) PLOT-2 (50-μm-i.d., polymerization reaction 10 h at 50℃, scar bar 10 μm)

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  图 2  在内径为4 μm的FS-PCFs通道内制备的PLOT柱^[44]。(A)未修饰的FS-PCF的结构；(B)典型的表面修饰后的FS-PCF；(C)表面修饰后的FS-PCF的高分辨照片

  Figure 2  Preparation of PLOT columns within a 4-μm channel I.D. Fused silica photonic crystal fibres (FS-PCFs)^[44]: (A) FS-PCF structure in its unmodified format; (B) Typical PS-PCF following surface modification; (C) High resolution images of FS-PCF channels

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  图 3  不同方案制备得到的PLOT柱的扫描电镜图^[46]：(A)PLOT(5)-A，5 μmi.d.毛细管，方案A(5.0 mL的TMOS)，(B)PLOT(5)-B，5 μmi.d.毛细管，方案B(6.4 mL的TMOS)，(C)PLOT(5)-C, 5 μm i.d.毛细管，方案C (7.2 mL的TMOS)，放大倍率是10000倍，标尺是500 nm

  Figure 3  Scanning electron micrographs^[46] of (A) PLOT (5)-A, 5 μmi.d. capillary with recipe A (5.0 mL of tetramethoxysilane(TMOS)), (B) PLOT (5)-B, 5 μmi.d. capillary with recipe B (6.4 mL of TMOS), and (C) PLOT(5)-C, 5 μmi.d. capillary with recipe C (7.2 mL of TMOS). The measurements were carried out at 10000 fold magnification, and the scale bars correspond to 500 nm

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  图 4  不同液体流速下血管紧张肽(10^-6mol/L)、乳-N-四糖(10^-5 mol/L)和3-唾液酸化-四糖(10^-5 mol/L)(1:10:10)的离子强度比较^[43]：(A)血管紧张肽、乳-N-四糖和3-唾液酸化-四糖的离子化效率作为流速的函数；(B)不同流速下血管紧张肽、乳-N-四糖和3-唾液酸化-四糖的离子化效率比。I、F和C分别表示强度、流速和浓度

  Figure 4  Comparison of ion intensities for angiotensin (10^-6 mol/L), lacto-N-tetraose (10^-5 mol/L), and 3-sialyl-tetrasaccharide (10^-5mol/L) (1:10:10) at different liquid flow rates^[43]: (A) ionization efficiencies of angiotensin, lacto-N-tetraose, and 3-sialyltetrasaccharide as a function of flow rate and (B) ionization efficiency ratio of 3-sialyl-tetrasaccharide and lacto-N-tetraose to angiotensin at different flow rates. I, F and C represent intensity, flow rate, and concentration, respectively

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  图 5  (A) 双功能色谱柱的飞升取样器尖端的SEM图^[14]：(a)侧面图；(b)尖端的截面图。(B)SEM图和TEM图^[14]：(a)内径是900 nm的裸毛细管的SEM图；(b)pico-PLOT柱的截面图；(c)图为(b)的SEM放大图；(d)pico-PLOT溶解掉二氧化硅管壁后遗留的聚合物的TEM图

  Figure 5  (A) SEM images of femtopipette tip end of bifunctional chromatographic column^[14]:(a) side view; (b) cross-section view of the tip. (B) SEM and TEM images^[14]: (a) SEM image of a bare capillary with an inner diameter of 900 nm; (b) SEM image of cross-sectional view of pico-PLOT column; (c) magnified SEM image of (b); (d) TEM image of left polymer tube after dissolving the silica capillary wall of the pico-PLOT column

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