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• 半胱氨酸(Cys)是人体中广泛存在的一种巯基氨基酸, 是蛋白质和酶的重要组成部分, 在生理过程中起着重要的作用^[1~3]. Cys在人体中血浆中的含量, 能够间接地反映出人体的健康水平, 一些疾病如阿尔兹海默症、心血管疾病、神经管缺陷、炎性肠病、骨质疏松等与之含量息息相关^[4~7].因此, 对Cys的快速灵敏检测与识别具有重要的意义.

  目前为止, 测试Cys的方法主要为高效液相色谱、电化学、电感耦合等离子质谱^[8~11].虽然这些仪器检测灵敏度高, 但是由于其仪器昂贵、操作复杂、测试繁琐等缺点, 限制了其进一步的应用发展.荧光化学传感器作为一种新型的传感方法, 因其方法简单、灵敏度高、高效及生物组织在线监测等优点, 成为近年来分析研究者的研究热点^[12~17].

  由于巯基氨基酸具有强的亲核性及与金属离子配位性特点, 一些基于金属配合物取代配位反应^[18~20]、迈克尔加成反应^{[21, 22]}、二硫键的断裂反应^[23~25]及与醛的环化反应^[24]的巯基氨基酸荧光化学传感器已经有相关文献报道.但这些传感器主要局限于有机物小分子, 聚合物分子荧光识别巯基氨基酸的例子还鲜有文献报道.相比于有机小分子, 聚合物分子常具有光信号放大效应、好的水溶性及易器件化等优点, 在实际应用中具有更广泛的前景^[26~30].

  两亲性高分子聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)由于具有良好的水溶性与生物相容性, 及对生物体低毒无副作用等优点, 在有机分子改性方面得到了广泛运用^[31~33].近年来基于PEG修饰高分子荧光化学传感器已有相关文献报道.在此我们报道一种新的PEG修饰水溶性高分子荧光化学传感器P1, 在纯水溶液中, P1能够荧光猝灭识别Hg²⁺, 并形成稳定的1:1型络合物P1-Hg²⁺ (Eq. 1)^[34~37]. Hg²⁺是一种有毒重金属离子, 对环境及生物体产生很大危害, 基于识别的荧光化学传感器已有大量报道.有意思的是, 这种在位生成的P1-Hg²⁺配合物可荧光增强识别Cys.当Cys存在时, 由于Cys与Hg²⁺强的亲和作用强于P1生成Cys-Hg²⁺络合物而置换出自由P1分子, 从而使得荧光恢复.

  1   结果与讨论

  1.1   合成与结构表征

  聚合物分子P1的合成方法见Scheme 1.以蒽为初始原料, 首先根据文献方法合成10-叠氮甲基-9-蒽甲醛(1)^[38], 然后与炔基取代二甲基吡啶胺(2) “Click”反应得到化合物3.化合物3经还原得到化合物4, 再与碘代聚乙二醇单甲醚(5)反应得到P1.聚合物P1及其前体4的结构通过¹H NMR和FT-IR得到证实.

  图式 1  目标分子P1的合成路线 Scheme1.  Synthetic route of P1

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  1.2   P1对Hg²⁺的荧光识别研究

  在纯水相4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 10 mmol/L, pH＝7.4) 缓冲体系中, 首先研究了P1对不同金属离子(Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Co²⁺, Fe²⁺, Al³⁺, Cr³⁺, Ag⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺和Pb²⁺)的荧光识别能力.如图 1所示, 受体分子P1在401、425及450 nm处有强的蒽单分子发射峰.当滴加2倍量不同金属离子时, P1对一些过渡金属离子都有一定的荧光响应.如滴加Cu²⁺, Co²⁺, Ag⁺和Hg²⁺表现出荧光猝灭响应, 而滴加Zn²⁺有一定的荧光增强响应.这说明受体分子与金属离子有强的配位作用, 可归因为受体分子P1中4个N原子(两个吡啶N原子, 胺N原子及三位三唑环N原子)与金属离子螯合效应的结果.二(2-吡啶甲基)胺(DPA)及其衍生物是一个强的多齿配体, 其对选择性重金属离子及过渡金属离子常有强的配位作用.基于DPA修饰的荧光化学传感器对顺磁性(Cu²⁺, Co²⁺)及重金属离子(Ag⁺和Hg²⁺)常为荧光猝灭响应, 而对Zn²⁺则为配位荧光增强响应^[39].

  图 1  HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) 溶液中P1 (10^－5 mol/L)滴加不同金属离子荧光光谱 Figure Figure1.  Fluorescence spectra of P1(10^－5 mol/L, λ_ex ＝370 nm) upon the addition of 2.0 equiv. of various metal ions in HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) solution

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  鉴于滴加Hg²⁺时荧光响应最大, 其荧光猝灭率达到85%, 因此我们详细研究了滴加Hg²⁺时受体P1的荧光变化.如图 2所示, 在HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) 缓冲溶液中, 随着Hg²⁺的不断加入, P1基于蒽的单分子发射峰逐渐减弱, 当滴加约一倍量时达到饱和, 表明P1与Hg²⁺形成了1:1型配合物.滴加Hg²⁺导致P1荧光猝灭的原因是由于荧光团蒽与Hg²⁺之间的发生了光诱导电子转移(PET)过程, 导致蒽荧光淬灭.这一作用过程在一些文献已经有相关报道^[40].根据P1与Hg²⁺的荧光滴定数据, 通过Benesi-Hildebrand公式线性拟合, 算得P1-Hg²⁺络合物的稳定常数为3.36×10⁵ L/mol.

  图 2  (a)在HEPES (10 mmol/L, pH＝7.4) 溶液P1 (1.0×10^－5 mol/L, 激发波长370 nm)中对滴加不同倍量的Hg²⁺ 荧光发射变化图和(b) P1在425 nm荧光强度与Hg²⁺ 量BenesiHildebrand线性拟合 Figure Figure2.  (a) Emission spectra of 1 (1.0×10^－5 mol/L, λ_ex ＝370 nm) upon addition various amount of Hg²⁺ in HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) solution and (b) the Benesi-Hildebrand plot of P1-Hg²⁺ by the emission data

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  1.3   P1-Hg²⁺对Cys识别性质研究

  由于Hg²⁺对S原子具有很好的亲和性, 一些Hg²⁺金属有机配和物已被广泛用于识别巯基氨基酸^[41~45].基于此, 本文研究了P1-Hg²⁺络合物对不同氨基酸识别能力.从图 3可看出, 在HEPES (10 mmol/L, pH＝7.4) 溶液中, 当分别滴加10倍量不同氨基酸(Ala、Cys、Glu、Gly、His、Leu、Met、Phe、Ser、Trp、Arg、Thr、Asp)时, 仅Cys表现出明显的荧光增强响应, 而加入其他氨基酸时P1-Hg²⁺的荧光变化则较少.这种荧光变化可能是因为Cys与Hg²⁺较P1及其他氨基酸有更强的配位能力, 发生了P1-Hg²⁺+Cys→P1+Cys-Hg²⁺置换反应, 从而使得P1的荧光恢复.

  图 3  HEPES (10 mmol/L, pH＝7.4) 溶液中P1-Hg²⁺ (1.0×10^‒5 mol/L, λ_ex ＝370 nm)滴加不同的氨基酸的荧光发射光谱(a)及在425 nm滴加不同胺基酸荧光强度柱状图(b) Figure Figure3.  Fluorescence spectra of P1-Hg²⁺ (1.0×10^‒5 mol/L, λ_ex ＝370 nm) upon the addition of 10 equiv. of various amino acids in HEPES (10 mmol/L, pH＝7.4) solution (a) and the bar graph of relative fluorescence I/I₀ of P1-Hg²⁺ at 425 nm upon the addition of amino acids (b)

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  P1-Hg²⁺中滴加Cys荧光变化见图 4.随着Cys浓度的逐渐增加, P1的荧光强度开始变化并不大.当Cys浓度达到0.3 equiv.时, P1-Hg²⁺的荧光强度变化加速, 当滴加约1.0 equiv. Cys时荧光增强变化趋于饱和, 其荧光增强系数I/I₀达到6左右.这种非线性S型荧光响应变化在文献中也有相关报道^[46].同时, 根据荧光滴定曲线可看出, P1-Hg²⁺荧光强度变化与Cys浓度在0.4~0.7 equiv.间有很好的线性关系(R²＝0.9868).

  图 4  (a) HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) 溶液中P1-Hg²⁺ (1.0× 10^－5 mol/L)滴加不同量Cys (0~2.5 equiv.)的荧光变化图及(b) P1-Hg²⁺ 在425 nm处荧光强度与滴加Cys当量变化图 Figure Figure4.  (a) Emission spectra of P1-Hg^2＋ (1.0×10^－5 mol/L, λ_ex＝370 nm) upon addition various amount of Cys in HEPES solution and (b) the emission intensity of P1-Hg^2＋ at 425 nm versus the equiv. of Cys

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  1.4   pH及其他共存胺基酸对P1-Hg²⁺识别Cys的影响

  P1-Hg²⁺在不同pH值环境水溶液中对Cys荧光识别能力影响见图 5.从图中可看出, P1-Hg²⁺在弱碱性条件对Cys有很好的能力, 而在酸性条件下识别能力减弱.这可能是因为Cys在碱性条件时以羧酸盐的形式存在, 羧酸盐与S原子通过螯合作用较P1对Hg²⁺有更好的配位能力, 从而与Hg²配位置换出P1.

  图 5  P1-Hg²⁺(1.0×10^－5 mol/L, 激发波长370 nm)在不同pH条件下426 nm荧光强度变化 Figure Figure5.  Fluorescence intensity of P1-Hg^2＋ (1.0×10^－5 mol/L, λ_ex＝370 nm) at 426 nm under different pH conditions

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  作为一个好的传感材料, 应该具有良好的抗其他共存离子的干扰能力.因此文章进一步研究了P1-Hg²⁺对Cys与其他氨基酸的竞争性实验.如图 6所示, 当其他背景的氨基酸存在时对P1-Hg²⁺络合物识别Cys的荧光信号没有发生明显的变化.这表明P1-Hg²⁺在HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) 体系条件下对Cys有很好的选择性.

  图 6  在HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) 溶液中P1-Hg²⁺(1.0× 10^－5 mol/L)滴加Cys(前)及其他氨基酸时在426 nm处荧光变化 Figure Figure6.  Competitive selectivity of P1-Hg^2＋ toward Cys (10 equiv.) in the presence of other amino acids (10 equiv.) in HEPES solution (10 mmol/L, pH＝7.4).

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  1.5   识别机理研究

  P1-Hg²⁺对Cys荧光响应可能发生了如Eq. 1所示配体转换反应.为了证实该机理, 我们以前体化合物3为模型通过密度泛函理论(DFT)计算及¹H NMR滴定研究了其与Hg²⁺的结合模式. DFT计算3-Hg²⁺络合物的最优构型见图 7.从图中可看出, 受体分子3中的两个吡啶环N原子[N(1) 与N(2)], 三级胺N(3) 原子及三唑环N(4) 原子与中心Hg²⁺参与了配位, 其中Hg与吡啶环N原子距离为2.50 Å, 与N(3) 距离为2.68 Å, 而与三唑环N(4) 原子距离为2.46 Å.从Hg—N距离可看出, 三唑环中N原子配位能力较其他N原子配位能力更强.

  图 7  3-Hg²⁺ 配体物DFT计算最优构型 Figure Figure7.  Calculated structure (B3LYP/6-31G*) of 3-Hg²⁺ complex

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  为了进一步证实该反应机理, 我们通过核磁滴定的数据进一步证实上述机理.受体分子3滴加Hg²⁺及Cys前后¹H NMR变化见图 8.在氘代乙腈中, 随着Hg²⁺的滴加, 3中三唑环质子H_a (Δδ＝－0.04) 及与胺基吡啶环相邻的亚甲基H_c和H_d (Δδ＝－0.21) 发生了低场方向移动, 表明三唑中的N原子, 三级胺及吡啶环中的N原子都参与了与汞离子的配位, 与DFT计算结果相一致.当配体与金属离子配位时, 由于配体中配位原子吸电子增强, 导致其邻位质子发生低场方向移动.同时从图 8中还可看出, 当3与Hg²⁺发生配位时, 一些蒽环上的质子及其相连的亚甲基上的Hb发生了一定的高场方向移动, 这可能因为与金属离子配位降低了受体分子柔性的结果.当3-Hg²⁺络合物滴加等当量Cys, 其¹H NMR谱与受体3基本相同, 表明发生了如Eq. 1所示P1-Hg²⁺+Cys→P1+Cys-Hg²⁺的置换反应.

  图 8  在氘代乙腈溶液中受体分子3滴加Hg(ClO₄)₂以及Cys时的核磁氢谱变化图 Figure Figure8.  Partial ¹H NMR spectrum of 3 upon addition of Hg(ClO₄)₂ and then addition of Cys in CD₃CN solution

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  2   结论

  以2, 2-二甲基吡啶胺、10-叠氮化蒽-9-甲醛、聚乙二醇单甲醚为原料, 通过Click反应合成了一种聚乙二醇修饰荧光化合物P1.在纯水溶液中, 当滴加选择性的金属离子如Cu²⁺, Ag⁺, Hg²⁺, Co²⁺和Zn²⁺时, P1的荧光发生了荧光猝灭或增强响应, 且对Hg²⁺的荧光识别能力最强.同时, P1-Hg²⁺配合物对Cys表现出独特荧光增强响应, 且不受其他氨基酸的干扰. DFT及¹H NMR滴定表明, 受体分子中四个N原子与中心离子Hg²⁺发生了络合作用, 当滴定Cys时发生了配体置换反应而导致荧光恢复.目前文献报道基于Cys的荧光传感器虽然很多, 但在纯水溶液中的例子尚不多.本文水溶性高分子负载有机受体将为新型Cys荧光化学传感器的设计合成提供了一种新思路.

  3   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  核磁共振仪(德国Bruker公司, Bruker Vance 400 MHz, TMS为内标)、紫外可见光谱(HITACHI U-3010型紫外可见分光光度计)、荧光光谱(Hitachi F-4500型荧光光谱仪).

  聚乙二醇单甲醚(平均分子量1900)、蒽、二甲基吡啶胺等试剂及药品购于国药集团化学试剂公司. 10-叠氮甲基-9-蒽甲醛(1)、炔基取代二甲基吡啶胺(2)及碘代聚乙二醇单甲醚(5)按文献方法合成.无水溶剂按文献方法纯化制备, 其他试剂均为分析纯, 使用前未作进一步纯化.本实验所用缓冲体系为HEPES (10 mmol/L, pH＝7.4) 溶液, 测试样品浓度为10 µmol/L, 滴定所用金属离子(Sn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ag⁺等)均为高氯酸盐.

  3.2   10-{4-[(双吡啶-2-甲基氨基)甲基][1, 2, 3]三唑-1-甲基}蒽-9-甲醛(3) 的合成

  在氮气保护下, 将化合物1 (261.3 mg, 1.0 mmol)和化合物2 (237.3 mg, 1.0 mmol)溶于5 mL N, N-二甲基甲酰胺溶液中, 然后向其溶液中加入CuSO₄•H₂O (50 mg, 0.2 mmol)和NaVc (65 mg, 0.2 mmol), 室温下搅拌4 h.反应完成后, 向反应瓶中加入20 mL去离子水, 二氯甲烷萃取, 无水硫酸钠干燥, 旋干, CH₂Cl₂/MeOH (V/V＝98:2) 为洗脱剂硅胶柱分离, 得黄色液体360 mg, 产率72%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ: 8.52 (d, J＝8.6 Hz, 2H), 8.33 (s, 4H), 7.62~7.52 (m, 4H), 7.48 (t, J＝7.6 Hz, 2H), 7.33 (d, J＝7.5 Hz, 2H), 7.08 (s, 1H), 7.04~6.94 (m, 2H), 6.47 (s, 2H), 5.70 (s, 2H), 3.65 (s, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 148.8, 136.4, 128.5, 127.7, 124.5, 123.9, 123.2, 121.9, 77.3, 77.0, 76.7, 59.6, 29.7. Anal. calcd for C₃₁H₂₆N₆O: C 74.68, H 5.26, N 16.86; found C 74.46, H 5.43, N 16.71.

  3.3   10-{4-[(双吡啶-2-甲基氨基)甲基][1, 2, 3]三唑-1-甲基}蒽-9-甲醇(4) 的合成

  在氮气保护下, 向50 mL无水乙醇中室温加入化合物3 (250 mg, 0.5 mmol), 溶液冰浴冷却至0 ℃加入NaBH₄ (37 mg, 1.0 mmol), 室温搅拌4 h.反应完成后加入盐酸溶液调节pH至中性, 二氯甲烷萃取, 无水硫酸钠干燥, 旋干, CH₂Cl₂/MeOH (V/V＝98/2) 为洗脱剂硅胶柱分离得到淡黄色固体100 mg, 产率39.84%. m.p. 156~157 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 11.43 (d, J＝3.3 Hz, 1H), 8.80 (d, J＝8.0 Hz, 2H), 8.38 (d, J＝4.1 Hz, 1H), 8.36 (d, J＝6.1 Hz, 1H), 8.32 (t, J＝9.7 Hz, 2H), 7.70~7.55 (m, 4H), 7.46 (d, J＝10.5, Hz, 2H), 7.31 (d, J＝7.1 Hz, 2H), 7.17 (s, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.45 (t, J＝8.3 Hz, 2H), 3.71 (d, J＝25.7 Hz, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 163.5, 155.7, 149.8, 149.2, 136.9, 22.9, 122.6, 122.1, 52.9, 47.7, 29.7. Anal. calcd for C₃₁H₂₈N₆O: C 74.38, H 5.64, N 16.79; found C 74.06, H 5.81, N 16.62.

  3.4   P1的合成

  在氮气保护条件下, 将化合物4 (100 mg, 0.2 mmol)溶于20 mL除水THF中, 在冰浴条件下加NaH (7.8 mg, 0.3 mmol), 反应0.5 h后, 将5 (402 mg, 0.2 mmol)溶于10 mL THF中, 逐渐滴加到反应瓶中, 室温搅拌过夜.反应完成后, 旋干溶剂, 在冰乙醚溶液中析出固体, 重复3次, 得到目标产物P1. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 3.36 (s, CH₃O), 3.45 (d, J＝4.2 Hz, CH₂C₅H₄N), 3.62 (s, CH₂CH₂O), 5.43 (s, CH₂C₂N₃H), 6.51~8.55 (anthracene, pyridine). IR (KBr) v: 2890, 1972, 1600, 1340, 1269, 1240, 1062, 956, 838 cm^－1.

  3.5   荧光滴定测试

  采用Hitachi F-4500型荧光光谱仪.首先将聚合物受体P1配制成10 µmol/L溶液, 随后将不同量金属离子分别滴加到P1溶液中, 测定P1对不同金属离子荧光响应.当测定P1-Hg²⁺对不同氨基酸识别能力实验时, 首先将1 equiv. Hg²⁺加入到P1溶液中形成稳定的P1-Hg²⁺配合物, 再加入不同氨基酸测定其荧光变化.在滴定试验中, 金属离子及氨基酸都配制成1.0×10^－3 mol/L, 使用微型移液器加入.由于加入金属离子或氨基酸体积较少, 可认为受体分子的浓度基本不变.

  辅助材料(Supporting Information) 化合物3, 4及P1的¹H NMR、¹³C NMR、IR图谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图式 1  目标分子P1的合成路线

  Scheme 1  Synthetic route of P1

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  图 1  HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) 溶液中P1 (10^－5 mol/L)滴加不同金属离子荧光光谱

  Figure 1  Fluorescence spectra of P1(10^－5 mol/L, λ_ex ＝370 nm) upon the addition of 2.0 equiv. of various metal ions in HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) solution

  Inset: the bar graph of P1 at 425 upon addition of various metal ions

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  图 2  (a)在HEPES (10 mmol/L, pH＝7.4) 溶液P1 (1.0×10^－5 mol/L, 激发波长370 nm)中对滴加不同倍量的Hg²⁺ 荧光发射变化图和(b) P1在425 nm荧光强度与Hg²⁺ 量BenesiHildebrand线性拟合

  Figure 2  (a) Emission spectra of 1 (1.0×10^－5 mol/L, λ_ex ＝370 nm) upon addition various amount of Hg²⁺ in HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) solution and (b) the Benesi-Hildebrand plot of P1-Hg²⁺ by the emission data

  Inset: the emission intensity of P1 at 425 nm vs the equivalence of Hg²⁺

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  图 3  HEPES (10 mmol/L, pH＝7.4) 溶液中P1-Hg²⁺ (1.0×10^‒5 mol/L, λ_ex ＝370 nm)滴加不同的氨基酸的荧光发射光谱(a)及在425 nm滴加不同胺基酸荧光强度柱状图(b)

  Figure 3  Fluorescence spectra of P1-Hg²⁺ (1.0×10^‒5 mol/L, λ_ex ＝370 nm) upon the addition of 10 equiv. of various amino acids in HEPES (10 mmol/L, pH＝7.4) solution (a) and the bar graph of relative fluorescence I/I₀ of P1-Hg²⁺ at 425 nm upon the addition of amino acids (b)

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  图 4  (a) HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) 溶液中P1-Hg²⁺ (1.0× 10^－5 mol/L)滴加不同量Cys (0~2.5 equiv.)的荧光变化图及(b) P1-Hg²⁺ 在425 nm处荧光强度与滴加Cys当量变化图

  Figure 4  (a) Emission spectra of P1-Hg^2＋ (1.0×10^－5 mol/L, λ_ex＝370 nm) upon addition various amount of Cys in HEPES solution and (b) the emission intensity of P1-Hg^2＋ at 425 nm versus the equiv. of Cys

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  图 5  P1-Hg²⁺(1.0×10^－5 mol/L, 激发波长370 nm)在不同pH条件下426 nm荧光强度变化

  Figure 5  Fluorescence intensity of P1-Hg^2＋ (1.0×10^－5 mol/L, λ_ex＝370 nm) at 426 nm under different pH conditions

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  图 6  在HEPES (10 mmol/L, pH 7.4) 溶液中P1-Hg²⁺(1.0× 10^－5 mol/L)滴加Cys(前)及其他氨基酸时在426 nm处荧光变化

  Figure 6  Competitive selectivity of P1-Hg^2＋ toward Cys (10 equiv.) in the presence of other amino acids (10 equiv.) in HEPES solution (10 mmol/L, pH＝7.4).

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  图 7  3-Hg²⁺ 配体物DFT计算最优构型

  Figure 7  Calculated structure (B3LYP/6-31G*) of 3-Hg²⁺ complex

  Selected bond length (Å): Hg—N(1) 2.51; Hg—N(2) 2.49; Hg—N(3) 2.68; Hg—N(4) 2.46

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  图 8  在氘代乙腈溶液中受体分子3滴加Hg(ClO₄)₂以及Cys时的核磁氢谱变化图

  Figure 8  Partial ¹H NMR spectrum of 3 upon addition of Hg(ClO₄)₂ and then addition of Cys in CD₃CN solution

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