卤代查尔酮氨基硫脲席夫碱的合成及生物活性研究

引用本文: 刘进兵, 唐君源. 卤代查尔酮氨基硫脲席夫碱的合成及生物活性研究[J]. 化学通报, 2017, 80(1): 77-83. shu

Citation: Liu Jinbing, Tang Junyuan. Bioactivities of Chalcones with Halogen Atom and Their Thiosemicarbazide Derivatives[J]. Chemistry, 2017, 80(1): 77-83. shu

卤代查尔酮氨基硫脲席夫碱的合成及生物活性研究

刘进兵 ,
唐君源

邵阳学院邵阳 422000

作者简介: 刘进兵, 男, 博士, 副教授, E-mail:syuliujb@163.com;

基金项目:
湖南省教育厅重点项目 15A172

摘要: 本文合成了一系列卤代查尔酮及其氨基硫脲席夫碱，并考察了所合成化合物的酪氨酸酶抑制活性及抗氧化活性。结果表明，部分化合物具有较好的酪氨酸酶抑制活性，其中3个化合物的抑制活性强于阳性对照曲酸，4-溴代查尔酮氨基硫脲席夫碱（化合物9）表现出最好的抑制活性，其IC₅₀值为2.02μmol/L；部分化合物还具有一定的抗氧化活性。抑制机理研究表明，化合物9属于不可逆抑制剂。优选化合物9进行了分子对接探讨，初步构效关系分析为进一步研究具有酪氨酸酶抑制活性的类似化合物提供了参考。

关键词:

English

Bioactivities of Chalcones with Halogen Atom and Their Thiosemicarbazide Derivatives

Department of Biology and Chemical Engineering, Shaoyang University, Shaoyang 422100
Received Date: 21 May 2016
Accepted Date: 15 August 2016

Abstract: A series of halogen atom substituted chalcones and their derivatives were synthesized. All of them were evaluated for their antioxidant activities and inhibitory activities against mushroom tyrosinase. The results showed that some of them exhibit significant tyrosinase inhibitory activities, three compounds exhibit more potent inhibitory activities than the reference standard inhibitor. Especially, the thiosemicarbazide Schiff base of 4-bromochalcone (compound 9) has the most potent tyrosinase inhibitory activity with an IC₅₀ value of 2.02 μmol/L. In addition, some compounds showed certain antioxidant activities. The inhibition mechanism analysis of compound 9 showed that the inhibitory effect of the compound on the tyrosinase was irreversible. Preliminary structure activity relationships' (SARs) analysis suggested that further development of such compounds might be of interest. Docking studies showed sulfur atom and phenyl ring B could form π bond with residue of the tyrosinase, and the amino could form hydrogen bond with HIS295.

Key words:

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一种多酚氧化酶，在其分子结构中存在两个铜离子活性中心，广泛分布于微生物、动物、植物中^{[1, 2]}。酪氨酸酶是黑色素生物合成的关键酶，影响着人和哺乳动物的毛发、皮肤、眼睛的颜色^[3]。酪氨酸酶的过量表达会造成黑色素堆积，引起色素沉着性疾病，如雀斑、黄褐斑、老年斑以及恶性黑色素瘤等。最近有报道指出，酪氨酸酶与帕金森病及其他神经衰弱症也有重要的关联，通过调节酪氨酸酶的催化活性可以促进或抑制其表达，达到治疗相关神经衰弱疾病的效果^[4]。酪氨酸酶还和果蔬褐变、昆虫蜕皮及伤口愈合有着重要的联系，酪氨酸酶抑制剂可以作为食品保鲜剂来延长食品货架期，同时也逐渐成为了研究生物杀虫剂的一个方向^{[5, 6]}。鉴于酪氨酸酶抑制剂在医药、农业、食品工业及化妆品领域有重要应用，已经引起了相关领域研究者的广泛关注，然而由于抑制活性不理想及毒副作用的原因，到目前为止，只有曲酸、熊果苷、苯基硫脲等少数几种酪氨酸酶抑制剂得到了应用，因此开发高效低毒的酪氨酸酶抑制剂已成为市场需求。

查尔酮类化合物具有α, β-不饱和酮结构，是一类重要的天然来源化合物，具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗惊厥、抗肿瘤等生物活性，目前认为双键与羰基构成的共轭体系是查尔酮具有多种生物活性的主要原因^[7]。最近有研究者报道从天然产物中提取或者化学合成的查尔酮化合物具有酪氨酸酶抑制活性^[8]。此外，还有研究人员报道了一些具有酪氨酸酶抑制活性的醛酮氨基硫脲席夫碱和香豆素类氨基硫脲席夫碱^{[9, 10]}。为了获得高效低毒的酪氨酸酶抑制剂，在已有的研究基础上，本文采用活性片段组合方式，合成了一类卤代查尔酮氨基硫脲席夫碱，并考察了其酪氨酸酶抑制活性和抗氧化活性，初步讨论了构效关系及抑制机理，为进一步研究查尔酮席夫碱类酪氨酸酶抑制剂提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

醛、酮购置于上海达瑞试剂有限公司，酪氨酸酶、L-多巴、曲酸从Sigma-Aldrich公司购得，其他试剂及溶剂均为市售分析纯级，使用前未进一步纯化。

SGW X-4熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)，温度未校正；Bruker 400或300型核磁共振谱仪(德国Bruker公司)；LCMS-2010A型质谱仪(日本岛津)；VECTOR 22型红外光谱仪(德国Bruker公司)；Vario EL型元素分析仪(德国Elementar公司)；UV-2100型紫外分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)。

1.2 化合物合成^[11]

图图式 1 取代查尔酮及其席夫碱的合成 Figure 图式 1. Synthesis of the substituted chalcones and their thiosemicarbazide Schiff bases

图选项

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1.3 活性测试

1.2.1 卤代查尔酮的合成

分别将5mmol芳基取代甲基酮和5mmol芳香醛加入到50mL反应瓶中，加入20mL无水乙醇，搅拌溶解，缓慢加入1mL 30%氢氧化钠溶液。于室温下搅拌反应，TLC (乙酸乙酯/石油醚=1/8，体积比)跟踪反应。反应完成后，以10%的稀盐酸中和至沉淀产生，经抽滤，水洗得粗产品。粗品以95%乙醇重结晶得查尔酮。

3-(4-氯苯基)-1-苯丙-2-烯-1-酮(1)，收率89.2%，黄色固体，熔点119.8~121.3℃；IR (KBr) ν/cm^-1：1653，1602，1488，1443，1403，1331，1219，1090，1014，986，823，775；¹H NMR (300MHz，CDCl₃) δ：7.89 (d，J=12.9Hz，1H，=CH)，7.63(d，J=8.4Hz，2H，Ph-H)，7.60(d，J=6.9Hz，2H，Ph-H)，7.39(d，J=7.2Hz，2H，Ph-H)，7.31~7.22(m，3H，Ph-H、=CH)；¹³C NMR (75MHz，CDCl₃)δ：189.1，145.6，138.7，134.7，133.8，133.2，129.6，129.1，128.7，128.3，121.1；MS (ESI)：m/z(100%) 243 (M⁺)；元素分析：C₁₅H₁₁ClO，实测值(计算值)/%：C 74.21(74.23)，H 4.53(4.57)。

3-(4-溴苯基)-1-苯丙-2-烯-1-酮(2)，收率85.7%，黄色固体，熔点190.5~192.8℃；IR (KBr) ν/cm^-1：1656，1606，1482，1446，1395，1328，1222，1070，1031，975，821，770；¹H NMR (300MHz，DMSO-d₆)：δ：7.94(d，J=8.6Hz，1H，=CH)，7.91~7.34(m，9H，Ph-H)，7.01(d，J=8.4Hz，1H、=CH)；¹³C NMR (75MHz，DMSO-d₆)δ：189.7，145.6，137.8，134.7，134.2，131.8，129.3，128.9，128.4，122.5，121.5；元素分析：C₁₅H₁₁BrO，实测值(计算值)/%：C 62.73(62.74)，H 3.85(3.86)。

1-(4-氟苯基)-3-苯丙-2-烯-1-酮(3)，收率56.5%，黄色固体，熔点76.2~78.3℃；IR (KBr)ν/cm^-1：1742，1644，1536，1333，1217，1151，1035，981，836，761；¹H NMR (400MHz，CDCl₃)δ：8.10(d，J=7.6Hz，2H，Ph-H)，7.85(d，J=15.6Hz，1H、=CH)，7.65~7.62(m，2H，Ph-H)，7.66~7.64(m，2H，Ph-H)，7.54(d，J=15.6Hz，1H、=CH)，7.44(d，J=7.6Hz，2H，Ph-H)，7.21~7.17(m，4H，Ph-H)；¹³C NMR (100MHz，CDCl₃)δ：188.9，145.1，134.8，134.6，131.2，131.0，130.6，129.0，128.5，121.6，115.8，115.6；MS (ESI)：m/z(100%) 227 (M⁺)；元素分析：C₁₅H₁₁FO，实测值(计算值)/%：C 79.62(79.63)，H 4.87(4.90)。

1-(4-氯苯基)-3-苯丙-2-烯-1-酮(4)，收率50.9%，黄色固体，熔点97.1~98.3℃；IR (KBr)ν/cm^-1：1736，1653，1549，1333，1217，1151，1084，1030，977，827，761；¹H NMR (300MHz，DMSO-d₆)δ：7.98(d，2H，J=8.4Hz，Ph-H)，7.84(d，1H，J=15.6Hz，=CH)，7.66~7.63(m，2H，Ph-H)，7.50(d，1H，J=15.6Hz，=CH)，7.49(d，2H，J=8.4Hz，Ph-H)，7.43~7.42(m，3H，Ph-H)；¹³C NMR (75MHz，DMSO-d₆)δ：189.2，145.3，139.2，136.5，134.7，130.7，129.9，129.1，128.9，128.5，121.5；MS (ESI)：m/z(100%) 243 (M⁺)；元素分析：C₁₅H₁₁ClO，实测值(计算值)/%：C 74.24(74.23)，H 4.55(4.57)。

1-(4-溴苯基)-3-苯丙-2-烯-1-酮(5)，收率75.4%，黄色固体，熔点100.5~102.7℃；IR (KBr) ν/cm^-1：1736，1648，1557，1391，1337，1213，1155，1072，1030，977，827，761；¹H NMR (400MHz，CDCl₃)δ：7.89(d，J=8.8Hz，2H，Ph-H)，7.83(d，J=15.6Hz，1H，=CH)，7.65~7.63(m，4H，Ph-H)，7.49(d，J=15.6Hz，1H，=CH)，7.43~7.41(m，3H，Ph-H)；¹³C NMR (100MHz，CDCl₃)δ：189.3，145.4，136.9，134.6，131.9，130.7，130.0，129.0，128.5，127.9，121.4；元素分析：C₁₅H₁₁BrO，实测值(计算值)/%：C 62.75(62.74)，H 3.83(3.86)。

1, 3-双(4-溴苯基)丙-2-烯-1-酮(6)，收率74.6%，黄色固体，熔点190.5~192.8℃；IR (KBr) ν/cm^-1：1653，1600，1479，1395，1325，1216，1070，1030，1006，983，812，739；¹H NMR (300MHz，DMSO-d₆)δ：7.92(d，J=8.8Hz，2H，Ph-H)，7.94(d，J=15.6Hz，1H，=CH)，7.69(d，J=9.2Hz，2H，Ph-H)，7.60~7.46(m，5H，Ph-H，=CH)；¹³C NMR (75MHz，DMSO-d₆)δ：189.1，144.0，136.7，133.6，132.3，132.0，130.0，129.9，128.1，125.1，121.9；MS (ESI)：m/z(100%)367 (M⁺)；元素分析：C₁₅H₁₀Br₂O，实测值(计算值)/%：C 49.21(49.22)，H 2.74(2.75)。

1-(4-溴苯基)-3-(4-氯苯基)丙-2-烯-1-酮(7)，收率67.8%，黄色固体，熔点89.5~90.2℃；IR (KBr)ν/cm^-1：1648，1488，1401，1336，1213，1098，1030，980，812，739；¹HNMR (300MHz，DMSO-d₆)δ：7.84~7.79(m，3H，Ph-H，=CH)，7.74(d，J=8.7Hz，2H，Ph-H)，7.50~7.44(m，4H，Ph-H)；¹³C NMR (75MHz，DMSO-d₆)δ：189.5，146.3，136.1，134.6，133.8，132.0，131.2，130.9，128.8，127.6，122.6，119.5；元素分析：C₁₅H₁₀BrClO，实测值(计算值)/%：C 56.01(56.02)，H 3.15(3.13)。

1.2.2 卤代查尔酮氨基硫脲席夫碱的合成

将5mmol卤代查尔酮和5mmol氨基硫脲加入到50mL反应瓶中，加入20mL无水乙醇，搅拌下加入催化量醋酸。于80℃回流反应8~24 h，TLC (乙酸乙酯/石油醚=1/6，体积比)跟踪反应。反应完成后将反应体系冷至室温，有沉淀产生，抽滤，滤饼以5mL乙醇洗涤。粗产品经无水以乙醇重结晶得卤代查尔酮氨基硫脲席夫碱。

3-(4-氯苯基)-1-苯丙-2-烯-1-酮氨基硫脲席夫碱(8)，收率54.3%，黄色固体，熔点131.6~132.8℃；IR (KBr)ν/cm^-1：1633，1601，1552，1487，1403，1325，1224，1161，1089，1013，859，819，736；¹H NMR (300MHz，DMSO-d₆)δ：11.41(s，1H，NH)，7.84~7.76(m，5H，Ph-H，NH₂，=CH)，7.65(d，J=8.7Hz，2H，Ph-H)，7.50~7.40(m，4H，Ph-H)，6.80(d，J=16.2Hz，1H，=CH)；¹³C NMR (75MHz，DMSO-d₆)δ：178.8，147.7，138.0，136.7，134.8，133.7，131.9，130.6，129.8，128.9，122.6，119.4；MS (ESI)：m/z(100%) 316 (M⁺)；元素分析：C₁₆H₁₄ClN₃S，实测值(计算值)/%：C 60.83(60.85)，H 4.46(4.47)，N 13.32(13.31)。

3-(4-溴苯基)-1-苯丙-2-烯-1-酮氨基硫脲席夫碱(9)，收率60.8%，黄色固体，熔点137.5~140.1℃；IR (KBr)ν/cm^-1：1708，1599，1488，1398，1322，1246，1120，1069，1005，870，814，713；¹H NMR (300MHz，DMSO-d₆)δ：11.14(s，1H，NH)，7.86(d，J=16.2Hz，1H，=CH)，7.72(d，J=8.7Hz，2H，Ph-H)，7.64~7.59(m，5H，Ph-H，NH₂)，7.46~7.44(m，4H，Ph-H)，6.78(d，J=16.2Hz，1H，=CH)；¹³C NMR (75MHz，DMSO-d₆)δ：178.8，147.7，138.0，136.7，134.8，133.7，131.9，130.6，129.8，128.9，122.6，119.4；元素分析：C₁₆H₁₄BrN₃S，实测值(计算值)/%：C 53.35(53.34)，H 3.95(3.92)，N 11.63(11.66)。

1-(4-氟苯基)-3-苯丙-2-烯-1-酮氨基硫脲席夫碱(10)，收率32.9%，黄色固体，熔点168.9~171.0℃；IR (KBr)ν/cm^-1：1603，1487，1333，1279，1221，1159，1122，1075，964，873，761；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：11.09(s，1H，NH)，8.86(s，1H，NH)，8.32(s，1H，NH)，7.82(d，J=15.6Hz，1H，=CH)，7.75(d，J=7.5Hz，2H，Ph-H)，7.71~7.68(m，2H，Ph-H)，7.49~7.47(m，2H，Ph-H)，7.47(d，J=15.6Hz，1H，=CH)，7.39~7.25(m，3H，Ph-H)；¹³C NMR (100MHz，DMSO-d₆)δ：196.4，179.4，147.6，140.1，136.3，131.9，129.8，129.1，128.5，121.6，119.2，115.7；MS (ESI)：m/z(100%)300(M⁺)；元素分析：C₁₆H₁₄FN₃S，实测值(计算值)/%：C 64.16(64.19)，H 4.73(4.71)，N 14.02(14.04)。

1-(4-氯苯基)-3-苯丙-2-烯-1-酮氨基硫脲席夫碱(11)，收率56.4%，黄色固体，熔点℃；IR (KBr)ν/cm^-1：1601，1483，1328，1279，1221，1159，1125，1075，873，761；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：11.09(s，1H，NH)，7.82(d，J=15.6Hz，1H，=CH)，7.75(d，J=7.5Hz，2H，Ph-H)，7.71~7.68(m，4H，NH₂，Ph-H)，7.49~7.47(m，2H，Ph-H)，7.47(d，J=15.6Hz，1H，=CH)，7.39~7.25(m，3H，Ph-H)；¹³C NMR (100MHz，DMSO-d₆)δ：196.4，179.4，147.6，140.1，136.3，131.9，129.8，129.1，128.5，121.6，119.2，115.7；MS (ESI)：m/z(100%) 317 (M⁺)；元素分析：C₁₆H₁₄ClN₃S，实测值(计算值)/%：C 60.83(60.85)，H 4.48(4.47)，N 13.30(13.31)。

1-(4-溴苯基)-3-苯丙-2-烯-1-酮氨基硫脲席夫碱(12)，收率52.5%，黄色固体，熔点159.2~161.0℃；IR (KBr) ν/cm^-1：1596，1473，1398，1324，1277，1218，1125，1089，1008，867，822，716；¹H NMR (300MHz，DMSO-d₆)δ：11.11(s，1H，NH)，7.87~7.73(m，5H，Ph-H，NH₂，=CH)，7.67~7.60(m，2H，Ph-H)，7.44~7.37(m，5H，Ph-H)，6.78(d，1H，J=16.2Hz，=CH)；¹³CNMR (75MHz，DMSO-d₆)δ：178.9，146.4，139.5，135.7，131.8，130.2，129.3，128.9，128.0，126.9，121.8，118.5；元素分析：C₁₆H₁₄BrN₃S，实测值(计算值)/%：C 53.36(53.34)，H 3.91(3.92)，N 11.65(11.66)。

1, 3-双(4-溴苯基)丙-2-烯-1-酮氨基硫脲席夫碱(13)，收率57.9%，黄色固体，熔点101.2~103.7℃；IR (KBr)ν/cm^-1：1726，1585，1476，1392，1316，1237，1120，1069，1005，870，805，735cm^-1；¹H NMR (300MHz，DMSO-d₆)δ：11.18(s，1H，NH)，7.84(d，J=15.9Hz，1H，=CH)，7.30(d，J=8.7Hz，2H，Ph-H)，7.65~7.58(m，8H，Ph-H，NH₂)，6.80(d，J=15.9Hz，1H，=CH)；¹³CNMR (75MHz，DMSO-d₆)δ：178.9，146.5，138.2，135.9，135.1，132.6，131.8，130.7，129.9，128.8，122.5，119.1；MS (ESI)：m/z(100%) 440 (M⁺)；元素分析：C₁₆H₁₃Br₂N₃S，实测值(计算值)/%：C 43.77(43.76)，H 2.96(2.98)，N 9.55(9.57)。

1-(4-溴苯基)-3-(4-氯苯基)丙-2-烯-1-酮氨基硫脲席夫碱(14)，收率55.1%，黄色固体，熔点175.0~177.4℃；IR (KBr)ν/cm^-1：1675，1582，1389，1280，1123，1092，1008，876，814cm^-1；¹H NMR (300MHz，DMSO-d₆)δ：11.16(s，1H，NH)，7.83~7.71(m，5H，Ph-H，NH₂_，=CH)，7.64(d，J=8.7Hz，2H，Ph-H)，7.49~7.44(m，4H，Ph-H)，6.82(d，J=15.9Hz，1H，=CH)；¹³C NMR (75MHz，DMSO-d₆)δ：178.9，146.5，138.2，135.9，134.8，133.7，131.9，131.2，130.7，128.6，127.9，122.5，119.1；元素分析：C₁₆H₁₃BrClN₃S，实测值(计算值)/%：C 48.66(48.69)，H 3.31(3.32)，N 10.63(10.65)。

1.3.3 分子对接

参照李慕紫等的方法^[15]，分别采用AutoDock4.2对化合物9进行了分子对接，结果见图 1。

图 1 分子对接图 Figure 1. The docking simulation between tyrosinase and inhibitor compound 9

图选项

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1.3.2 抗氧化活性测试

为了初步考察所合成化合物的抗氧化活性，参照Blois^[12]的方法进行了DPPH·清除能力的测试，参照Pellegrini等^[13]的方法进行了ABTS_·⁺清除能力的测试，参照Apak等^[14]的方法对所合成化合物进行铜离子还原能力测试，2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，α-生育酚作为阳性对照，测试结果如表 2。

表 2 卤代查尔酮及其席夫碱抗氧化活性 Table 2. Antioxidant activity of the substituted chalcones and their thiosemicarbazide Schiff bases

表选项

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Compound	DPPH·scavengingAbility (IC₅₀ (μmol/L)±SD)	ABTS_·⁺ scavenging activity (IC₅₀ (μmol/L)±SD)	cupric reducing antioxidant capacity A_0.50 (μmol/L)±SD
1	> 200	> 200	> 200
2	> 200	> 200	> 200
3	> 200	192.35±1.78	> 200
4	198.68±3.25	176.39±2.69	> 200
5	191.55±2.97	194.27±2.36	> 200
6	> 200	> 200	> 200
7	> 200	> 200	> 200
8	109.26±1.38	126.56±2.09	122.56±1.49
9	64.96±0.16	83.48±0.12	73.05±0.09
10	75.58±0.67	102.08±0.42	103.19±0.36
11	132.09±2.09	168.32±1.87	126.67±1.06
12	156.68±3.56	174.32±1.69	85.08±0.69
13	118.26±1.86	137.87±0.78	76.65±1.37
14	109.87±1.46	153.58±1.16	62.83±0.98
BHT	56.08±0.82	2.88±0.36	4.07±0.11
α-tocopherol	13.16±0.12	5.39±0.08	2.65±0.02

1.3.1 酪氨酸酶抑制活性

采用笔者课题组之前建立的酪氨酸酶抑制活性测试方法^[9]对所合成卤代查尔酮及其氨基硫脲席夫碱进行了酪氨酸酶抑制活性测试。曲酸是常用的酪氨酸酶抑制剂，所以采用曲酸为阳性对照，结果如表 1。

表 1 所合成化合物的酪氨酸酶抑制活性 Table 1. Tyrosinase inhibitory activities of the synthesized compounds

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Compounds	CLog P ^d	IC₅₀_/(μmol/L) ^a
1	4.337	NA ^b
2	4.487	NA ^b
3	3.843	40.20% ^c
4	4.413	40.25% ^c
5	4.563	37.22% ^c
6	5.426	NA ^b
7	5.276	NA ^b
8	4.297	14.10
9	4.447	2.02
10	3.811	7.56
11	4.381	117.18
12	4.531	140.50
13	5.394	49.25
14	5.244	50.65
Kojic acid		23.67
a：三次实验平均值；b：在200μmol/L无抑制活性；c：在200μmol/L的抑制率；d：CLog P来源于ChemBioDraw Ultra 12.0

2 结果与讨论

2.1 合成部分

以卤原子取代或未取代的芳香醛和芳香酮为起始原料，经Claisen-Schmidt缩合得到含有卤原子的查尔酮粗品，再经95%乙醇进行重结晶得到卤代查尔酮，收率中等(50.9%~89.2%)。为了增加羰基的反应活性，以醋酸为催化剂，将卤代查尔酮与氨基硫脲在乙醇中回流反应得到相应的氨基硫脲席夫碱粗品，以乙醇重结晶得产品，收率在32.9%到60.8%之间。

2.2 酪氨酸酶抑制活性

以L多巴为底物，检测化合物对酪氨酸酶的抑制活性，结果见图 2和表 1。图 2表示化合物9对酪氨酸酶抑制作用曲线，随着抑制剂浓度的加大，酪氨酸酶的活性迅速下降，表明该化合物对酪氨酸酶具有明显的抑制活性。表 1中所列IC₅₀值是通过三次试验后所得平均值。如表 1所示，大多数卤代查尔酮及其氨基硫脲席夫碱具有一定的酪氨酸酶抑制活性，IC₅₀值在2.02~140.5 μmol/L之间，从测试结果来看，卤代查尔酮氨基硫脲席夫碱(8~14)对酪氨酸酶的抑制活性比相应的查尔酮(1~7)强，说明氨基硫脲席夫碱片段对提高此类化合物酪氨酸酶抑制活性是有利的。化合物8~10具有比阳性对照(曲酸)更强的抑制活性，其中化合物9的活性最高，其IC₅₀值为2.02μmol/L。化合物8比化合物11的抑制活性强，化合物9比化合物12的抑制活性强，这4个化合物在结构上的区别就是卤原子所处苯环不同，因此卤原子的来源对查尔酮氨基硫脲席夫碱酪氨酸酶的抑制活性存在一定影响，卤原子来源于醛对提高酪氨酸酶抑制活性更有利。然而，对比查尔酮化合物1~7的抑制活性，卤原子来源于醛的查尔酮没有抑制活性，而当卤原子只来源于酮时所得的查尔酮(3~5)具有一定的酪氨酸酶抑制活性，但活性不高，同样说明卤原子的来源对酪氨酸酶的抑制活性有影响。对比化合物10~12的抑制活性可以发现，含氟原子的化合物(10)的抑制活性比其他的活性要高，原因可能与氟原子体积小而电负性大的特点有关。随着化合物12~14的CLog P值的变化，其酪氨酸酶抑制活性也发生相应的变化，所以这些化合物的抑制活性与其脂溶性也存在一定的关系。

图 2 化合物9对酪氨酸酶的抑制作用 Figure 2. Inhibitory effect of compound 9 on tyrosinase

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2.3 抗氧化活性

为了初步考察所合成的抗氧化活性，以2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和α-生育酚为阳性对照，分别评价了14个化合物对DPPH·清除能力、ABTS_·⁺清除能力以及铜离子还原能力，结果见表 2。从表 2可以发现，部分化合物具有一定的抗氧化活性，但是活性都弱于阳性对照BHT和α-生育酚。

2.4 抑制机理

化合物9是所有化合物中酪氨酸酶抑制活性最好的，故优选化合物9进行了抑制机理探讨，结果见图 3。图中显示的是一组平行线，因此化合物9属于不可逆抑制剂，也就是该化合物与酪氨酸酶活性位点结合是不可逆的。这个可能与酪氨酸酶的分子结构有关，化合物9能够与酪氨酸酶形成一种结构稳定的不可逆的络合物。

图 3 化合物9对酪氨酸酶的抑制机理 Figure 3. Effect of concentrations of tyrosinase on its activity for the catalysis of L-DOPA at different concentration of compound 9

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2.5 分子对接

采用AutoDock4.2对化合物9进行了分子对接研究。通过分子对接计算出化合物9与酪氨酸酶的结合能是-7.13 kcal/mol，这就说明化合物9与酪氨酸酶具有相互作用力。从图 1可以发现，化合物9中的氨基可以与酪氨酸酶HIS295形成氢键，其键长为2.28Å；苯环B可以PHE90残基形成π键，其键长为4.04Å；硫原子与HIS259残基以及TYR97残基也存在π键，其键长为4.56Å和5.07Å。这说明氨基硫脲席夫碱中的硫原子和氨基对抑制酪氨酸酶活性起着重要作用，但并不是和酪氨酸酶中铜离子活性中心形成络合物。

3 结论

本文考察了一系列卤代查尔酮及其氨基硫脲席夫碱的酪氨酸酶抑制活性，其中化合物9对酪氨酸酶抑制活性最好，其IC₅₀值为2.02μmol/L，优于阳性对照曲酸的抑制活性。初步构效关系分析表明, 卤原子的来源对卤代查尔酮及卤代查尔酮氨基硫脲席夫碱的抑制活性有重要影响；而氨基硫脲席夫碱片段对酪氨酸酶抑制活性起决定性作用；此外，酪氨酸酶抑制活性与其脂溶性也存在一定关系。部分化合物具有一定的抗氧化活性，但都不如阳性对照。优选化合物9进行了抑制机理探讨，该化合物是不可逆抑制剂，分子对接表明化合物9的硫原子可以与酪氨酸酶氨基酸残基形成π键，氨基能够与HIS295形成氢键，化合物9能够与酪氨酸酶形成稳定的不可逆络合物。

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图式 1 取代查尔酮及其席夫碱的合成

Scheme 1 Synthesis of the substituted chalcones and their thiosemicarbazide Schiff bases

1: R₁=H, R₂=Cl; 2: R₁=H, R₂=Br; 3: R₁=F, R₂=H; 4: R₁=Cl, R₂=H; 5: R₁=Br, R₂=H; 6: R₁=Br, R₂=Br; 7: R₁=Br, R₂=Cl; 8: R₁=H, R₂=Cl; 9: R₁=H, R₂=Br; 10: R₁=F, R₂=H; 11: R₁=Cl, R_V=H; 12: R₁=Br, R₂=H; 13: R₁=Br, R₂=Br; 14: R₁=Br, R₂=Cl

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图 1 分子对接图

Figure 1 The docking simulation between tyrosinase and inhibitor compound 9

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图 2 化合物9对酪氨酸酶的抑制作用

Figure 2 Inhibitory effect of compound 9 on tyrosinase

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图 3 化合物9对酪氨酸酶的抑制机理

Figure 3 Effect of concentrations of tyrosinase on its activity for the catalysis of L-DOPA at different concentration of compound 9

直线1~4所对应的浓度分别是0，1，2和3μmol/L

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表 1 所合成化合物的酪氨酸酶抑制活性

Table 1. Tyrosinase inhibitory activities of the synthesized compounds

Compounds	CLog P ^d	IC₅₀_/(μmol/L) ^a
1	4.337	NA ^b
2	4.487	NA ^b
3	3.843	40.20% ^c
4	4.413	40.25% ^c
5	4.563	37.22% ^c
6	5.426	NA ^b
7	5.276	NA ^b
8	4.297	14.10
9	4.447	2.02
10	3.811	7.56
11	4.381	117.18
12	4.531	140.50
13	5.394	49.25
14	5.244	50.65
Kojic acid		23.67
a：三次实验平均值；b：在200μmol/L无抑制活性；c：在200μmol/L的抑制率；d：CLog P来源于ChemBioDraw Ultra 12.0

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表 2 卤代查尔酮及其席夫碱抗氧化活性

Table 2. Antioxidant activity of the substituted chalcones and their thiosemicarbazide Schiff bases

Compound	DPPH·scavengingAbility (IC₅₀ (μmol/L)±SD)	ABTS_·⁺ scavenging activity (IC₅₀ (μmol/L)±SD)	cupric reducing antioxidant capacity A_0.50 (μmol/L)±SD
1	> 200	> 200	> 200
2	> 200	> 200	> 200
3	> 200	192.35±1.78	> 200
4	198.68±3.25	176.39±2.69	> 200
5	191.55±2.97	194.27±2.36	> 200
6	> 200	> 200	> 200
7	> 200	> 200	> 200
8	109.26±1.38	126.56±2.09	122.56±1.49
9	64.96±0.16	83.48±0.12	73.05±0.09
10	75.58±0.67	102.08±0.42	103.19±0.36
11	132.09±2.09	168.32±1.87	126.67±1.06
12	156.68±3.56	174.32±1.69	85.08±0.69
13	118.26±1.86	137.87±0.78	76.65±1.37
14	109.87±1.46	153.58±1.16	62.83±0.98
BHT	56.08±0.82	2.88±0.36	4.07±0.11
α-tocopherol	13.16±0.12	5.39±0.08	2.65±0.02

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142