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• 生物膜广泛存在于自然界，尤其在城镇给排水管网系统及水处理构筑物中，其工程材料表面易被细菌粘附并自发形成生物膜^[1]。在生物膜形成过程中，细菌自身分泌产生的胞外聚合物(extracellular polymeric substance，EPS)是生物膜形成的基础性物质^[2]，具有分层分布的特征，对于细菌粘附及聚集特性起到了关键作用。从化学组成而言，EPS主要由蛋白质、多聚糖、胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)等构成，分布于EPS各层中的组分决定了EPS的重要性质，如带电性及疏水性等^{[2, 3]}。新近研究表明^[4]，eDNA对于EPS结构的完整性及生物膜的三维结构起到关键作用，不仅影响EPS关键组分的空间分布，而且直接决定了生物膜的最初形成过程^{[5, 6]}。因而，明确eDNA的释放机制以及eDNA对于细菌粘附及聚集的影响，对于实际工程中调控生物膜具有重要的指导意义。

  1.   EPS分类及eDNA的分布

  尽管针对微生物聚集体中EPS的研究经历了许多年，EPS的分离及提取仍没有标准方法。图 1显示了前期研究者对EPS的主要分类及其分层结构。由图可见，EPS主要分为：(1)溶解性EPS(soluble EPS，S-EPS)(也称为溶解性微生物代谢产物，soluble microbial product，SMP)及结合型EPS(bound EPS，B-EPS)^[7]；(2) B-EPS具有类似于双电层结构，可分为松散的EPS(LB-EPS)及紧缚的EPS(TB-EPS)^[7]；(3)鉴于LB-EPS与本体溶液中的相交换，在LB-EPS外层存在粘液层，EPS可细化为S-EPS、粘液层、LB-EPS及TB-EPS^{[8, 9]}；(4)从菌胶团内部与外部EPS空间分布的差异，EPS可分为菌胶团外聚合物(extra-microcolony polymers，EMP)和菌胶团内细胞外聚合物(extra-cellular polymers，ECP)两部分^[10]；(5) EMP具有松散及紧缚的空间结构，因而从菌胶团在生物聚集体分布角度，EPS分为LB-EMP、TB-EMP及ECP三部分^[11]。针对EPS的分层，目前大多数研究者将其分为SMP、LB-EPS及TB-EPS三层^{[7, 12, 13]}。尽管不同研究者对上述EPS分类采用了“操作性定义”，致使许多实验结果存在争议甚至相互矛盾，但研究者针对EPS及生物聚集体等开展的基础性研究，有助于揭示生物膜的形成机理。

  图 1

  

  图 1  EPS分类及其分层结构

  Figure 1.  The classification and layered structure of EPS

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  早期研究者通过不同的分离手段提取EPS，为避免对细胞破碎的影响，通常采用DNA指标评价提取方法^[14]。随着eDNA在EPS完整性及生物膜形成过程中的重要作用的发现，有关eDNA在EPS中分布的研究受到了研究者的关注。Liao等^[14]研究发现，eDNA在EPS中的含量大约为2%~15%之间；袁冬琴等^[15]的研究证实，与LB-EPS相比，更多的eDNA分布在TB-EPS中；Lü等^[8]进一步细化eDNA在EPS中的分布，实验结果表明，eDNA在S-EPS、粘液层、LB-EPS和TB-EPS中所占比例分别为0.2%、0.01%、0.1%和26.2%。总结上述研究发现，eDNA更倾向分布于EPS内层。Wang等^[10]通过分析EMP及ECP中成分组成发现，eDNA在ECP中的含量高于EMP，这也证实了eDNA主要分布在生物聚集体的内部。另外，eDNA在EPS中的分布也受到运行条件的影响，何培培等^[16]研究表明，eDNA主要分布在B-EPS外层，可能是好氧微生物在厌氧条件下引发溶胞行为，导致高浓度的eDNA存在于粘液层中。关于运行条件，如曝气强度、有机负荷等，对eDNA分布影响方面的研究非常有限，此领域的研究有待进一步深入。

  2.   群体感应系统调控eDNA的机制

  eDNA是指生物膜中存在于菌体细胞外的核酸成分^[17]，目前eDNA的来源主要有以下三种方式。

  一是菌膜中部分细菌裂解。Thomas等^[18]认为，生物膜中的部分细菌通过细胞死亡发生自裂解，释放eDNA，或者部分细菌通过释放杀伤因子导致目标菌裂解，而其自身可表达特异性的免疫蛋白进行自我保护。

  其次是细菌释放含有DNA的小囊泡。Kuramitsu等^[19]研究发现，铜绿假单胞菌活菌可分泌含有DNA的小囊泡，自溶素裂解囊泡释放eDNA。

  再是活细胞的主动分泌。Hamilton等^[20]研究发现，在淋病奈瑟菌中，通过编码的蛋白所构成的一种特殊Ⅳ型分泌系统能够分泌DNA。

  前期研究已证实^[4]，eDNA在胞外组分的数量直接受群体感应系统(quorum sensing，QS)调控。QS是细菌相互交流并对周围环境变化不断作出反应的一种细胞间的交流、调节机制，调控细菌的诸多生理功能，如共生、竞争、毒性因子的释放、EPS的合成与分泌、细菌聚集以及生物膜形成等^[21]。针对上述QS的功能，Das等^[4]对QS调控eDNA机制进行了总结，认为eDNA的释放主要受QS-独立机制和QS-依赖机制调节。其中，QS-独立机制是eDNA释放的基础水平原因，QS-依赖机制通过控制前噬菌体、吩嗪、蛋白质的产生，进一步促进细菌eDNA释放。

  基于QS-依赖机制，eDNA的释放主要源于QS信号分子调节机制。结合前期文献[22]，QS信号分子类型可分为革兰阴性菌的N-乙酰高丝氨酸环内酯(N-acylhomoserine lactone，AHLs)信号分子、革兰阳性菌的寡肽类(autoinducer peptides，AIPs)信号分子和自诱导物Ⅱ(autoinducer-2，AI-2)种间信号分子。在革兰氏阴性菌中，QS系统通过调节AHL浓度，促进细菌释放吩嗪和前噬菌体，从而诱导eDNA的释放^[4]。Allesen等^[23]研究发现，吩嗪类物质可以诱导分子氧还原成活性氧物种(ROS)，ROS浓度升高，促使细胞破裂，产生溶胞行为，同时释放eDNA。Gödeke等^[24]研究发现，在希瓦氏菌属细胞中，前噬菌体有能力诱导细胞溶解，引发eDNA的释放。此外，铜绿假单胞菌喹诺酮信号(pseudomonas quinolone signal，PQS)也被发现可以调控细胞的溶解行为^[4]。对于革兰氏阳性细菌，QS依赖机制通过调控AIP产生蛋白质、酶和多肽类物质，诱发eDNA释放^[25]。Das等^[25]研究表皮葡萄球菌发现，自溶素AtlE的活性决定eDNA的浓度；Thomas等^[26]研究发现，在粪肠球菌生物膜发展中，肽内酯(FsrD)诱导明胶酶(GelE)和丝氨酸蛋白酶(SprE)释放，其活性使细菌自溶并释放大量eDNA。此外，除上述基于微生物自身调节机制，外界环境因素，如抗生素、洗涤剂和化肥等化学药品等，也会引发细菌溶胞，亦将促进eDNA的释放^{[27, 28]}。

  3.   eDNA对细菌粘附性能的影响

  众多研究表明^{[25, 29~34]}，eDNA浓度直接关系到细菌的粘附性能。Mann等^[35]研究发现，在金黄色葡萄球菌生物膜形成的初期阶段，抑制eDNA的生成或去除已存在的eDNA，会造成细菌粘附性能下降，从而抑制生物膜的形成。Lappann等^[36]对表皮葡萄球菌株进行研究，结果显示，缺少eDNA会抑制细菌的初期粘附，从而导致生物膜无法形成。目前，很多研究者利用接触角测量验证eDNA对细菌粘附性能的影响^{[29, 37, 38]}。其中Das等^[25]在用脱氧核糖核酸酶处理葡萄球菌的实验中，分别用水、甲酰胺、二碘甲烷和溴代萘对脱氧核糖核酸酶处理前后的菌株样品进行接触角测量，结果显示，eDNA的存在使细菌表面具有高度疏水性，从而促进细菌的粘附作用。Das等^[39]通过原子力显微镜观察发现，在eDNA存在时有更强的粘附力和更多的粘附峰值，直接证实了eDNA会强化生物膜的形成。

  细菌的初期粘附是非特异性的可逆过程，最初细菌在载体表面的结合是松散的^[40]，随着时间延长，粘附作用逐渐加强，使得细菌和表面的粘附转化为不可逆的过程^[41~43]，这种不可逆的粘附导致细菌达到一个相对高的密度并生成菌落^{[41, 42, 44]}，菌落被EPS包裹而形成生物膜。基于生物膜的形成是源于细菌的短程迁移行为和微界面过程，研究者采用XDLVO理论解析生物膜形成机制。热力学分析表明，当相互作用的分子之间的距离很短(小于5nm)时^{[45, 46]}，生物膜的形成主要取决于细胞之间和细胞与非生物表面之间的极性作用力^{[25, 29]}；细菌与载体表面相距较远时，范德华力和静电力起主导作用。长链的eDNA会穿透相邻细胞之间的屏障，这时细胞之间的相互作用主要是静电排斥力^[47]。Das等^[29]研究表明，极性作用力是以表面基质、细胞和eDNA上的电子-接受和电子-供给基团之间的相互作用为基础，电子转移促进相互作用的细菌和表面基质之间化学键的生成。Azeredo等^[48]研究表明，极性作用力对细菌表面疏水性起着决定性作用，细菌和表面的粘附主要是受极性作用力的控制，极性作用力的增加使细菌和表面的粘附加强的同时，促进细菌初期的可逆粘附向不可逆粘附过程转换。

  4.   eDNA对生物膜稳定性的影响

  eDNA作为EPS的关键组分，对于维系生物膜的空间稳定性具有十分重要的作用^[49]。Harmsen等^[50]对单核细胞增多性李斯特氏菌生物膜进行处理，结果表明，用脱氧核糖核酸酶处理会降低细胞附着，对已经形成的生物膜也具有一定的分散作用；而加入核糖核酸酶不产生任何影响，说明eDNA的存在对于生物膜的结构及其稳定性具有重要作用。Whitchurch等^[32]也发现在铜绿假单胞菌形成的生物膜中，eDNA使得成熟生物膜结构更加稳定。Rice等^[51]发现，在粪肠球菌形成生物膜过程中eDNA促进细胞间的聚集作用。Liu等^[52]通过将DNA加入到大肠杆菌悬浮液中来验证eDNA对于细菌聚集的影响，结果显示，eDNA能强化细菌聚集作用，eDNA浓度越高，细菌聚集效果越好。eDNA在生物膜形成过程中强化了细胞聚集^{[4, 53]}，与蛋白质、多聚糖等相互结合缠绕，起到了“脚手架”的作用^[50]，进一步促进生物膜的结构完整性^[4]。

  在生物膜基质中，eDNA与蛋白质是交链连接的。Goodman等^[54]研究发现，在大肠杆菌菌株U93中，DNABII类蛋白在胞外与eDNA紧密结合，产生一种能够增强螺旋的特定结构，这种结构有助于生物膜基质中eDNA纤维网状的形成，并且对维持生物膜完整性起关键作用。Petersen等^[55]研究发现，在链球菌中，感受态刺激因子和DNA之间相互作用之后，与蛋白质ComGB结合，能够增加细胞之间的附着作用，进一步形成聚集体，最终促进生物膜的发展。Huseby等^[56]研究表皮葡萄球菌发现，β-毒素酶通过与eDNA结合形成核蛋白质复合物，DNA能建立一个骨骼的框架，促使葡萄球菌生物膜形成。

  在生物膜胞外基质中，eDNA与多聚糖也具有很强的结合能力，eDNA-多聚糖相互作用是普遍存在的。Liao等^[57]研究发现，在链球菌生物膜中存在一个细丝状的结构，这些结构能被脱氧核糖核酸酶完全去除，而葡聚糖酶和甲酸能显著降低这些细丝结构的数量，表明在链球菌生物膜中的细丝状结构是eDNA和多聚糖结合物。Hu等^[58]研究证实，在黄色粘球菌生物膜基质中，eDNA与胞外多聚糖结合具有很强的粘性强度，同时可加强生物膜的稳定性。Harmsen等^[50]研究单核细胞增多性李斯特氏菌时发现，eDNA可与肽聚糖(特别是N-乙酰氨基葡萄糖)结合，表明eDNA与多聚糖结合对细菌聚集作用是必不可少的。

  5.   结语

  生物膜的形成是缓慢的、自发的过程，其形成机制备受关注，尤其是eDNA在生物膜构建的作用是该领域的研究热点。目前的研究共识是：细菌通过QS机制调节eDNA的释放，eDNA浓度的增加强化了细菌之间的聚集能力及细菌与载体表面的粘附能力，对于最初生物膜的形成起到了关键的作用；eDNA可与蛋白质、多聚糖等相互缠绕结合，发挥了“脚手架”的作用，对于EPS空间完整性及生物膜稳定性发挥了重要作用。尽管前期针对eDNA的大量研究有助于揭示生物膜形成机制，然而目前此领域仍有不足之处。(1)前期研究中关于eDNA对生物膜的影响主要集中在纯菌体系，在复杂的混合菌属环境中，如生物膜法，eDNA在生物膜形成、生长、成熟及脱落过程中起到的作用，有待进一步明确；(2)针对生物膜法水处理工艺，操作运行条件(水力条件、溶解氧、有机负荷、基质种类等)对生物膜中eDNA含量及其在EPS空间分布的影响，有待进一步深入；(3)在膜法水处理中，膜表面生物的形成是生物膜污染的重要形式，考察eDNA在具有通透性的膜表面生物膜形成中的作用，对于揭示生物膜污染机制，具有重要意义。

  全面深入研究eDNA在生物膜构建中的作用，深入解析在混合菌属环境中eDNA对生物膜发展过程的影响，综合考察运行条件对eDNA浓度及其在EPS中分布的影响，运用XDLVO理论定量揭示eDNA在微距离尺度范围内对膜表面生物膜形成机制，这些都是此领域今后值得深入研究的课题。

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  图 1  EPS分类及其分层结构

  Figure 1  The classification and layered structure of EPS

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