English

• 流行性感冒(流感)是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染疾病，主要通过空气飞沫传播，具有爆发突然、蔓延迅速、传播面广的特点^[1]。目前对于流感的预防和治疗主要采用接种疫苗预防为主和抗病毒药物防治并重的应对手段^[2]。临床上目前用于治疗流感病毒感染的药物主要为M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶(NA)抑制剂两大类^[3]。

  M2离子通道抑制剂由于只对A型流感有效，对B型流感无效，且往往会造成严重的中枢神经系统的副作用，因此该类药物目前已不再作为流感防治的一线药物使用^[4]。神经氨酸酶抑制剂对多种亚型的流感病毒均有效，具有较高的疗效和较好的安全性，是目前临床上预防和治疗流感的首选药物，如奥司他韦(Oseltamavir)、扎那米韦(Zanamivir)、帕拉米韦(Paremivir)以及拉尼米韦(Laninamivir)等^[5]。但是，随着这些药物的大量使用，它们在体内外已经诱生出大量的耐药毒株，使得流感病毒对目前已上市药物的耐药性越来越强，因此设计开发新型抗流感病毒药物迫在眉睫。

  核蛋白是流感病毒的一种重要结构蛋白，其主要作用是使流感病毒的RNA节段壳体化，并与聚合酶结合，形成核糖核蛋白复合体，以进行RNA的转录、复制和装配。核蛋白具有高度的保守性，是目前抗流感病毒药物的理想作用靶点^[6]。针对核蛋白抑制剂的研究起步较晚，随着2010年靶向于核蛋白的小分子化合物Nucleozin(图式 1)的发现，针对核蛋白抑制剂的研发才逐渐增多起来^[7]。如图 1所示，目前针对Nucleozin的构效关系研究主要集中在B和C两个区域，对A区域的研究较少^[8]，因此本文通过钯催化偶联的方法将不同取代的芳环以及芳杂环(1)与N-Boc哌嗪(2)连接，制备得到了一系列A区域的构建模块3，进一步合成得到不同结构的Nucleozin衍生物9(图式 2)，通过对这些衍生物进行抗流感病毒(H1N1)的活性测试，明确A区域结构对药物分子抗病毒活性的影响。

  图式 1

  

  图式 1.  Nucleozin的化学结构

  Scheme 1.  The structure of Nucleozin

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  图式 2

  

  图式 2.  Nucleozin衍生物的设计合成

  Scheme 2.  The design and synthesis of derivatives of Nucleozin

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  Bruker Plus 400M型核磁共振谱仪，Waters 3100 Mass Detctor质谱仪，WRX-4显微熔点仪。96孔细胞培养板(Nunc)；MTT试剂盒(南京凯基生物公司)；腔肠素底物(Nanolight)；DMEM培养基(Hyclone)；血清(BI)；青链霉素(南京凯基生物公司)。实验所用柱层析硅胶(200~300目)及薄层层析硅胶板购自青岛海洋化工厂。其他试剂均为国产或进口分析纯级，无水溶剂用常规方法干燥处理，氮气为高纯氮。

  1.2   合成方法

  1-叔丁氧羰基-4-(2-甲基-4-硝基苯基)哌嗪(3a)的合成：将150mg(0.81mmol)N-Boc哌嗪(2)、260mg(1.21mmol)2-溴-5-硝基甲苯(1a)、370mg(1.13mmol)Cs₂CO₃、55mg(0.09mmol)(±)-2，2′-双(二苯膦基)-1，1′-联萘(BINAP)和18mg(0.08mmol)Pd(OAc)₂加入到50mL两口瓶中，用隔膜真空泵进行气体交换，氮气保护，将5mL无水甲苯注入体系中，保持无水无氧状态，加热100℃回流反应10h，TLC检测(二氯甲烷/甲醇体积比50:1)反应完全，抽滤，滤液经减压浓缩除去溶剂，经硅胶柱进行纯化，得到220mg黄色固体3a，收率86%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：8.03~8.06 (m，2H)，6.99(d，J = 8.7Hz，1H)，3.60(t，J = 5.0Hz，4H)，2.96(t，J = 4.7Hz，4H)，2.37(s，3H)，1.49(s，9H)。ESI-MS m/z：C₁₁H₁₄N₃O₂Na₂ [M-Boc+2Na]⁺：理论值266.23，实测值266.00。

  1-叔丁氧羰基-4-(4-硝基苯基)哌嗪(3b)：橙黄色固体，收率81%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：8.11~8.15 (m，2H)，6.77~6.84(m，2H)，3.60(t，J = 5.3Hz，4H)，3.42(t，J = 5.3Hz，4H)，1.49(s，9H)。ESI-MS m/z：C₁₀H₁₂N₃O₂Na₂，理论值252.21，实测值252.22 [M-Boc+2Na]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(4-甲基苯基)哌嗪(3c)：褐色固体，收率87%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.05~7.10(m，2H)，6.81~6.86(m，2H)，3.57(t，J = 5.2Hz，4H)，3.07(t，J = 5.1Hz，4H)，2.28(s，3H)，1.48(s，9H)。ESI-MS m/z：C₁₆H₂₅N₂O₂，理论值277.38，实测值277.34 [M+H]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(4-氯苯基)哌嗪(3d)：浅粉色固体，收率88%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.20~7.23(m，2H)，6.82~6.86(m，2H)，3.57(t，J = 5.2Hz，4H)，3.09(t，J = 5.1Hz，4H)，1.48(s，9H)；ESI-MS m/z：C₁₅H₂₂ClN₂O₂，理论值297.80，实测值297.27[M+H]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-苯基哌嗪(3e)：白色固体，收率95%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.28(dd，J = 8.6、7.2 Hz，2H)，6.92~6.95(m，2H)，6.89(t，J = 7.2Hz，1H)，3.58(t，J = 5.2Hz，4H)，3.13(t，J = 5.1Hz，4H)，1.48(s，9H)。ESI-MS：C₁₅H₂₃N₂O，理论值263.35，实测值263.31 [M+H]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(4-甲氧基苯基)哌嗪(3f)：粉色固体，收率75%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：6.88~6.93(m，2H)，6.83~6.86(m，2H)，3.77(s，3H)，3.57(t，J = 5.1Hz，4H)，3.00(t，J = 5.1Hz，4H)，1.48(s，9H)。ESI-MS m/z：C₁₆H₂₅N₂O₃，理论值293.38，实测值293.36[M+H]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-([1, 1'-联苯]-4-基)哌嗪(3g)：白色固体，收率95%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：7.51~7.57(m，4H)，7.39~7.43(m，2H)，7.27~7.31(m，1H)，6.98~7.01(m，2H)，3.60(t，J = 5.2Hz，4H)，3.19(t，J = 5.1Hz，4H)，1.50(s，9H)。ESI-MS：C₂₁H₂₇N₂O₂，理论值339.45，实测值339.42 [M+H]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(4-三氟甲基苯基)哌嗪(3h)：白色固体，收率92%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.50(d，J = 8.5Hz，2H)，6.94(d，J = 8.5Hz，2H)，3.60(t，J = 5.1Hz，4H)，3.24(t，J = 5.1Hz，4H)，1.49(s，9H)。ESI-MS m/z：C₁₁H₁₂F₃N₂Na₂，理论值275.21，实测值275.23 [M-Boc+2Na]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(2-甲基苯基)哌嗪(3i)：黄棕色油状物，收率82%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.15~7.21(m，2H)，6.97~7.01(m，2H)，3.57(t，J = 5.0Hz，4H)，2.85(t，J = 5.1Hz，4H)，2.31(s，3H)，1.49(s，9H)。ESI-MS m/z：C₁₆H₂₅N₂O₂，理论值277.38，实测值277.38 [M+H]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(2-氯苯基)哌嗪(3j)：白色固体，收率80%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.37(dd，J = 7.9、1.6 Hz，1H)，7.21~7.24(m，1H)，6.97~7.02(m，2H)，3.60(t，J = 4.9Hz，4H)，2.99(t，J = 4.9Hz，4H)，1.49(s，9H)。ESI-MS m/z：C₁₅H₂₂ClN₂O₂，理论值297.80，实测值297.32 [M+H]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(2-甲基-4-甲基苯基)哌嗪(3k)：白色固体，收率65%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：7.01(d，J = 2.1Hz，1H)，6.97(dd，J = 8.1、2.1 Hz，1H)，6.89(d，J = 8.0Hz，1H)，3.55(t，J = 4.8Hz，4H)，2.81(t，J = 4.8Hz，4H)，2.28(d，J = 2.6Hz，6H)，1.49(s，9H)。ESI-MS m/z：C₁₇H₂₇N₂O₂，理论值291.41，实测值291.53 [M+H]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(2-甲基-4-氯苯基)哌嗪(3l)：白色固体，收率82%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：7.16(dd，J = 2.6、0.8 Hz，1H)，7.10~7.13(m，1H)，6.90(d，J = 8.5Hz，1H)，3.55(t，J = 5.0Hz，4H)，2.80(t，J = 5.0Hz，4H)，2.28(s，3H)，1.48(s，9H)。ESI-MS m/z：C₁₁H₁₄ClN₂Na₂，理论值255.68，实测值255.37 [M-Boc+2Na]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(2-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪(3m)：橙黄色固体，收率95%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.86(dd，J = 8.8、2.5 Hz，1H)，7.72(d，J = 2.5Hz，1H)，6.87(d，J = 8.8Hz，1H)，3.95(s，3H)，3.60(t，J = 5.1Hz，4H)，3.16(t，J = 5.2Hz，4H)，1.48(s，9H)；ESI-MS m/z：C₁₁H₁₄N₃O₃Na₂，理论值282.23，实测值282.38 [M-Boc+2Na]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(2-甲基-5-硝基苯基)哌嗪(3n)：橙黄色固体，收率84%。¹H NMR(400MHz，CDCl₃) δ：7.82~7.88(m，2H)，7.32(d，J = 8.2Hz，1H)，3.57~3.64(m，4H)，2.84~2.93(m，4H)，2.40(s，3H)，1.49(s，9H)；ESI-MS m/z：C₁₁H₁₄N₃O₂Na₂：理论值226.23，实测值266.40 [M-Boc+2Na]⁺。

  1-叔丁氧羰基-4-(嘧啶-2-基)哌嗪(3o)：白色固体，收率94%。¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：8.33(d，J = 4.8Hz，2H)，6.53(t，J = 4.7Hz，1H)，3.82(t，J = 5.4Hz，4H)，3.51(t，J = 5.2Hz，4H)，1.51(s，9H)。ESI-MS m/z：C₈H₁₁N₄Na₂，理论值209.18，实测值209.53 [M-Boc+2Na]⁺。

  化合物9a的合成：将200mg(0.98mmol)化合物8溶于10mL无水二氯甲烷中，加入470mg(2.46mmol)EDCI，330mg(2.46mmol) 1-羟基苯并三唑(HOBT)，搅拌几分钟后，加入化合物4a(260mg，1.18mmol)，体系呈深黄色透明状，室温搅拌过夜，TLC检测(二氯甲烷/甲醇体积比40:1)反应完全。减压浓缩除去溶剂，加入30mL乙酸乙酯重新溶解，分别用1mol/L HCl溶液、饱和NaHCO₃溶液、饱和NaCl溶液洗涤，保留有机相，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩除去溶剂，经硅胶柱进行纯化，得到橙黄色固体9a(350mg)，收率87%，熔点158.5~160.0℃；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.97~8.05(m，2H)，7.67(dd，J = 7.4、2.2 Hz，2H)，7.46~7.51(m，3H)，6.77(d，J = 8.7Hz，1H)，3.89(s，2H)，3.25(s，2H)，2.92(s，2H)，2.55(s，3H)，2.40(s，2H)，2.29(s，3H)。¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：169.97，162.56，159.99，156.33，143.09，132.71，130.40，129.12，128.35，127.88，126.65，122.62，118.56，110.99，50.71，50.54，47.11，42.09，18.51，11.88。MS(ESI) m/z：C₂₂H₂₃N₄O₄，理论值407.44，实测值407.20[M+H]⁺。

  化合物9b：黄色固体，收率85%，熔点242.2~243.5℃；¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：8.06~8.11(m，2H)，7.62~7.68(m，2H)，7.44~7.47(m，3H)，6.68~6.72(m，2H)，3.87(s，2H)，3.38(s，2H)，3.21(s，2H)，2.78(s，2H)，2.55(s，3H)。¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：170.39，162.58，159.94，154.16，139.30，130.52，129.13，128.27，127.76，125.86，113.23，110.76，46.76，46.68，46.09，41.45，11.91。MS(ESI) m/z：C₂₁H₂₁N₄O₄，理论值393.42，实测值393.00[M+H]⁺。

  化合物9c：褐色油状物，收率86%；¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：7.63~7.68(m，2H)，7.42~7.46(m，3H)，7.03~7.07(m，2H)，6.68~6.74(m，2H)，3.87(s，2H)，3.22(s，2H)，3.07(s，2H)，2.53(s，5H)，2.26(s，3H)。¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：169.72，162.39，160.04，148.55，130.40，130.35，129.75，129.05，128.33，127.76，117.08，111.14，49.89，49.74，46.93，41.97，20.44，11.85。MS(ESI) m/z：C₂₂H₂₄N₃O₂，理论值362.45，实测值362.00 [M+H]⁺。

  化合物9d：浅黄色油状物，收率84%，熔点147.6~149.0 ℃；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.61~7.68(m，2H)，7.43~7.46(m，3H)，7.16~7.20(m，2H)，6.68~6.72(m，2H)，3.86(s，2H)，3.21(s，2H)，3.08(s，2H)，2.53(s，5H)。¹³C NMR(151MHz，CDCl₃)δ：169.92，162.40，160.01，149.26，130.39，129.09，129.08，128.30，127.77，125.64，117.94，111.01，49.26，49.14，46.70，41.77，11.88。MS(ESI) m/z：C₂₁H₂₁ClN₃O₂，理论值382.86，实测值382.00[M+H]⁺。

  化合物9e：橙黄色油状物，收率88%；¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：7.62~7.68(m，2H)，7.42~7.47(m，3H)，7.22~7.26(m，2H)，6.87~6.90(m，1H)，6.78~6.81(m，2H)，3.88(s，2H)，3.23(s，2H)，3.13(s，2H)，2.54(s，5H)；¹³C NMR(151MHz，CDCl₃)δ：169.81，162.43，160.04，150.65，130.38，129.24，129.07，128.31，127.76，120.77，116.75，111.09，49.33，49.20，46.87，41.93，11.87。MS(ESI) m/z：C₂₁H₂₂N₃O₂，理论值348.42，实测值348.00 [M+H]⁺。

  化合物9f：褐色固体，收率86%，熔点80.8~82.4℃；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.64~7.69(m，2H)，7.44(dd，J = 5.1、2.0Hz，3H)，6.73~6.82(m，4H)，3.87(s，2H)，3.75(s，3H)，3.22(s，2H)，3.00(s，2H)，2.53(s，3H)，2.47(s，2H)。¹³C NMR(151MHz，CDCl₃)δ：169.70，162.37，160.04，154.50，144.93，130.33，129.06，128.34，127.77，118.98，114.48，111.15，55.52，50.81，50.61，47.04，42.06，11.86。MS(ESI) m/z：C₂₂H₂₄N₃O₃，理论值378.44，实测值378.00 [M+H]⁺。

  化合物9g：浅黄色固体，收率85%，熔点73.9~75.1℃；¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：7.65~7.69 (m，2H)，7.52~7.55 (m，2H)，7.49 (d，J = 8.7 Hz，2H)，7.44~7.47 (m，3H)，7.40 (t，J = 7.7 Hz，2H)，7.28~7.31 (m，1H)，6.85~6.88(m，2H)，3.90(s，2H)，3.25(s，2H)，3.19(s，2H)，2.64(s，2H)，2.55(s，3H)。¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：169.86，162.45，160.06，149.85，140.57，133.40，130.43，129.10，128.76，128.32，127.84，127.78，126.71，126.56，116.78，111.09，49.12，49.00，46.82，41.88，11.90；MS(ESI) m/z：C₂₇H₂₆N₃O₂，理论值424.52，实测值424.70[M+H]⁺。

  化合物9h：白色固体，收率83%，熔点203.4~205.0℃；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.62~7.68(m，2H)，7.42~7.48(m，5H)，6.79(d，J = 8.6Hz，2H)，3.87(s，2H)，3.22(s，4H)，2.65(s，2H)，2.55(s，3H)。¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：170.08，162.48，160.00，152.65，130.44，129.09，128.30，127.77，126.50(q，J = 3.7Hz)，123.59，121.64(q，J = 32.8Hz)，115.20，110.93，47.97，47.94，46.48，41.62，11.87；MS(ESI) m/z：C₂₂H₂₁F₃N₃O₂，理论值416.42，实测值415.73 [M+H]⁺。

  化合物9i：浅黄色油状物，收率85%；¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：7.66~7.71(m，2H)，7.45~7.51(m，3H)，7.10~7.17(m，2H)，6.98~7.00(m，1H)，6.77(dd，J = 7.9、1.2 Hz，1H)，3.87(s，2H)，3.24(s，2H)，2.84(s，2H)，2.54(s，3H)，2.34(s，2H)，2.24(s，3H)。¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：169.48，162.49，160.04，150.54，132.69，131.17，130.30，129.06，128.40，127.84，126.65，123.90，119.06，111.30，51.45，51.37，47.58，42.53，17.71，11.84。MS(ESI) m/z：C₂₂H₂₄N₃O₂，理论值362.45，实测值362.00 [M+H]⁺。

  化合物9j：白色油状物，收率90%；¹H NMR (600MHz，DMSO-d₆)δ：7.61~7.64(m，2H)，7.55(dd，J = 5.0、2.0Hz，3H)，7.41 (dd，J = 7.9、1.5 Hz，1H)，7.28~7.31(m，1H)，7.01~7.09(m，2H)，3.79(s，2H)，3.35(s，2H)，2.97 (s，2H)，2.50 (s，5H)；¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：169.58，162.49，160.03，148.33，130.71，130.30，129.06，128.91，128.38，127.83，127.66，124.41，120.38，111.21，50.82，47.29，42.23，11.85。MS(ESI) m/z：C₂₁H₂₁ClN₃O₂，理论值382.86，实测值382.00[M+H]⁺。

  化合物9k：白色油状物，收率84%；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.67~7.70(m，2H)，7.45~7.50(m，3H)，6.97(d，J = 2.1Hz，1H)，6.93(dd，J = 8.0、2.1 Hz，1H)，6.67(d，J = 8.0Hz，1H)，3.86(s，2H)，3.23(s，2H)，2.81(d，J = 5.7Hz，2H)，2.54(s，3H)，2.25(s，5H)，2.20 (s，6H)。¹³C NMR(151MHz，CDCl₃)δ：169.43，162.47，160.05，148.10，133.42，132.58，131.88，130.28，129.05，128.40，127.84，127.10，118.99，111.31，51.63，51.56，47.63，42.58，20.69，17.54，11.83；MS(ESI) m/z：C₂₃H₂₆N₃O₂，理论值376.47，实测值376.65[M+H]⁺。

  化合物9l：白色油状物，收率95%；¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：7.65~7.69(m，2H)，7.46~7.49(m，3H)，7.11~7.14(m，1H)，7.05~7.09(m，1H)，6.67(d，J = 8.5Hz，1H)，3.85(s，2H)，3.22(s，2H)，2.78(s，2H)，2.54(s，3H)，2.25(s，2H)，2.20(s，3H)。¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：169.62，162.49，160.02，149.12，134.67，130.91，130.31，129.07，129.04，128.38，127.86，126.52，120.39，111.19 m/z，51.44，51.33，47.45，42.42，17.57，11.84。MS(ESI) m/z：C₂₂H₂₃ClN₃O₂，理论值396.89，实测值396.57[M+H]⁺。

  化合物9m：黄色固体，收率90%，熔点62.8~64.0℃；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：7.82 (dd，J = 8.9、2.5 Hz，1H)，7.65~7.69 (m，3H)，7.46 (dd，J = 5.1、1.9 Hz，3H)，6.68(d，J = 8.8Hz，1H)，3.90(s，5H)，3.25(s，2H)，3.14(s，2H)，2.54(s，5H)。¹³C NMR(151MHz，CDCl₃)δ：169.94，162.47，159.99，151.30，146.30，142.72，130.38，129.09，128.34，127.82，117.57，116.88，110.96，106.56，56.02，49.47，46.87，41.85，11.87；MS(ESI) m/z：C₂₂H₂₃N₄O₅，理论值423.44，实测值423.63 [M+H]⁺。

  化合物9n：黄色固体，收率84%，熔点129.0~130.5 ℃；¹H NMR(600MHz，CDCl₃) δ：7.85(dd，J = 8.3、2.3Hz，1H)，7.65~7.69(m，2H)，7.58(d，J = 2.4Hz，1H)，7.49~7.56(m，3H)，7.27~7.30(m，1H)，3.88(s，2H)，3.25(t，J = 5.0Hz，2H)，2.83(s，2H)，2.55(s，3H)，2.32(s，5H)。¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：169.89，162.49，160.07，151.31，146.94，140.77，131.61，130.54，129.19，128.36，127.99，118.85，114.41，111.12，51.36，50.76，47.23，42.23，18.13，11.87。MS(ESI) m/z：C₂₂H₂₃N₄O₄，理论值407.44，实测值407.56 [M+H]⁺。

  化合物9o：白色固体，收率85%，熔点142.0~143.6℃；¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：8.36(d，J = 4.7Hz，2H)，7.58~7.63(m，2H)，7.49~7.53(m，3H)，6.56~6.66 (m，1H)，3.70 (s，6H)，3.28 (s，2H)，2.48(s，3H)；¹³C NMR(151MHz，CDCl₃)δ：162.63，161.21，160.05，157.75，130.39，129.07，128.30，127.73，111.14，110.54，46.81，43.23，43.11，41.89，11.86；MS(ESI) m/z：C₁₉H₂₀N₅O₂，理论值350.39，实测值350.58 [M+H]⁺。

  1.3   生物活性评价

  (a) 将100μL MDCK细胞按照1×10⁵个/mL接种于96孔细胞培养板中，于37℃ 5% CO₂条件下培养至细胞丰度为90%左右。

  (b) 病毒稀释液的配制：从-80℃冷柜内取出A/PR/08/34(H1N1)-Gaussia Luciferase重组流感病毒株，置于冰上解冻，随后用病毒生长液按感染复数MOI = 0.1将其稀释约340倍，混匀后置于4℃冰箱待用。

  (c) 待测化合物的配制：将待测化合物和Nucleozin溶解于95%DMSO中，配制成10mmol/L储液，然后用上述病毒稀释液将化合物依次稀释成100，33.3，11.1，3.70，1.23，0.41，0.14，0.046，0.015，0.0051 μmol/L等10个浓度。

  (d) 将96孔细胞培养板中上清弃去，用PBS清洗细胞2~3次，依次将上述配制完成的不同浓度的化合物加入96孔板中，同一个浓度的化合物设置3个重复对照，并同时设置细胞对照和病毒对照，在另一个96孔板中加入Nucleozin设定为阳性对照。

  (e) 将上述96孔细胞培养板置于37℃，5%CO₂条件下培养24h，进行荧光素酶活性检测。具体步骤如下：依次吸取30μL 96孔细胞培养板中的细胞上清至白色酶标板中，然后每孔加入30μL腔肠素底物，利用化学发光仪在相应的程序下，读取发光值，利用GraphPad Prism5分析数据，计算得到EC₅₀值。

  2.   结果与讨论

  通过Nucleozin与流感病毒核蛋白的晶体复合物结构^[8b]可以看到，Nucleozin分子B区域酰胺键上的羰基与周边蛋白的氨基酸残基有氢键相互作用，A区域的芳基与邻近蛋白氨基酸上的苯基有面对面的π-π相互作用，苯基上面的硝基与周边氨基酸残基有一定的电荷作用，而硝基邻位氯原子的作用则不明确。因此首先设计将氯原子替换为甲基，期望通过甲基的引入改变分子构象以及改善蛋白-配体的相互作用，进一步提高药效，并以此为切入点研究区域A的结构对整体分子抑制活性的影响。

  2.1   芳基溴代物与N-Boc哌嗪偶联反应条件的优化

  以过渡金属催化的偶联反应来构建中间体3中的C-N键，首先以化合物1a与N-Boc哌嗪2的偶联反应为模板进行反应条件的优化。当以Pd₂(dba)₃为催化剂时，反应以19%的低收率得到目标产物，而碘化亚酮几乎无法催化反应进行(表 1，entry 1，2)。当以碳酸铯为碱时，反应收率可以大幅度提高至62%(表 1，entry 3)，当以叔丁醇钠为碱时，反应收率可以进一步提高至80%(表 1，entry 4)。当将配体由BINAP替换为4, 5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)时，反应收率大幅下降至35%(表 1，entry 5)。

  表 1

  

  表 1  偶联反应条件的优化^a

  Table 1.  Conditions optimization of the coupling reaction

  下载: 导出CSV

  Entry	Cat.	Ligand	Base	Solvent	Yield/% b
  1	CuI	TMEDA	tBuONa	toluene	trace
  2	Pd2dba3	BINAP	K2CO3	toluene	19
  3	Pd2dba3	BINAP	Cs2CO3	toluene	62
  4	Pd2dba3	BINAP	tBuONa	toluene	80
  5	Pd2dba3	Xantphos	tBuONa	toluene	35
  6	Pd(OAc)2	BINAP	tBuONa	toluene	54
  7	Pd(OAc)2	SPhos	tBuONa	toluene	27
  8	Pd(OAc)2	Xantphos	tBuONa	toluene	28
  9	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	toluene	86
  10	Pd(OAc)2	—	Cs2CO3	toluene	NR e
  11	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	dioxane	12
  12	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	DMF	80
  13	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	toluene	78 c
  14	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	toluene	70 d
  a反应条件：将150mg化合物2以及1.5eq化合物1a置于5mL无水甲苯中，加入10(mol)%的催化剂、11(mol)%的配体以及1.4eq碱，氮气保护，100℃反应10h；b硅胶柱分离收率；c反应温度为80℃；d催化剂的加入量为5(mol)%，配体的加入量为6(mol)%；e NR：不反应

  为了探索反应收率进一步提高的可能性，将Pd₂(dba)₃替换为Pd(OAc)₂来催化反应进行，考察不同的配体和碱对反应的影响(表 1，entry 6~9)。结果发现，当以BINAP为配体、碳酸铯为碱进行偶联反应时，反应收率可以提高至86%(表 1，entry 9)；而无配体存在时，反应得不到产物(表 1，entry 10)。将反应溶剂替换为1, 4-二氧六环时，反应收率大幅下降至12%(表 1，entry 11)；当以DMF为溶剂时，反应收率下降至80%(表 1，entry 12)。降低反应温度以及降低催化剂和配体的负载量，均对反应不利(表 1，entry 13，14)。因此，以过渡金属催化的偶联反应来构建中间体3的优化条件为，以10(mol)%的Pd(OAc)₂为催化剂，11(mol)%的BINAP为配体，1.4当量的碳酸铯为碱，甲苯为溶剂，100℃进行反应。

  2.2   芳基溴代物与N-Boc哌嗪偶联反应的底物拓展

  在确立优化反应条件后，对反应底物进行拓展，合成不同结构化合物3(表 2)。首先考察当R²为氢原子时，不同取代类型的R¹对反应产率的影响(表 2，entry 1~7)。从反应结果可以看出，当R¹处在溴原子的对位时，电荷因素以及位阻因素对反应收率影响并不显著，反应可以75%~95%的收率得到相应的产物。值得注意的是，当R¹为强给电子基甲氧基时，反应收率降低至75%(表 2，entry 5)。而当R¹变为弱给电子基甲基时，反应收率上升至87%(表 2，entry 2)。当R¹为吸电子基团时，反应收率均相对较高，其中当R¹为强吸电子基三氟甲基时，反应收率可达92%(表 2，entry 7)。有趣的是当R¹为氢原子或大位阻的苯环时，反应的收率最高，可达95%(表 2，entry 4，6)。

  表 2

  

  表 2  钯催化偶联反应的底物拓展^a

  Table 2.  Substrate scope of the Pd-catalyzed coupling reaction

  下载: 导出CSV

  Entry	R1	R2	Products	Yield/% b
  1	4-NO2	H	3b	81
  2	4-CH3	H	3c	87
  3	4-Cl	H	3d	88
  4	H	H	3e	95
  5	4-OCH3	H	3f	75
  6	4-Ph	H	3g	95
  7	4-CF3	H	3h	92
  8	H	2-CH3	3i	82
  9	H	2-Cl	3j	80
  10	4-CH3	2-CH3	3k	65
  11	4-Cl	2-CH3	3l	82
  12	4-NO2	2-OCH3	3m	95
  13	5-NO2	2-CH3	3n	84
  a反应条件：将150mg化合物2以及1.5eq化合物1置于5mL无水甲苯中，加入10(mol)%的Pd(OAc)2、11(mol)%的BINAP以及1.4eq Cs2CO3，氮气保护，100℃反应10h；b硅胶柱分离收率

  接下来考察不同类型R²取代基对反应的影响。当R¹为氢原子、R²分别为甲基或氯原子时，反应可以分别以82%和80%的较高收率得到产物(表 2，entry 8，9)。当R¹和R²同为给电子取代基甲基时，反应收率下降至65%(表 2，entry 10)，而当R¹和R²互为不同类型取代基时，即R¹和R²分别为氯原子和甲基时，反应又能以82%的较好收率进行(表 2，entry 11)。特别是，当R¹为强吸电子取代基硝基、R²为给电子取代基甲氧基时，反应收率可提高至95%(表 2，entry 12)。当R¹处于溴原子间位时，反应收率几乎不受影响(表 2，entry 13)。此外，在该反应条件下利用2-溴嘧啶1o与N-Boc哌嗪进行偶联反应依旧可以高达94%的收率得到偶联产物3o(图式 3)。

  图式 3

  

  图式 3.  钯催化的2-溴嘧啶和N-Boc哌嗪的偶联反应

  Scheme 3.  Pd-catalyzed coupling reaction of 2-bromopyrimidine and N-Boc piperazine

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  在底物拓展的基础上，将偶联产物3的叔丁氧羰基保护基脱去并与化合物8缩合，以高收率制备得到了一系列Nucleozin衍生物(表 3)，并测试了其对流感病毒H1N1的抑制活性。为了方便对照，在表 3中列出了Nucleozin对流感病毒H1N1的EC₅₀值(表 3，entry 1)。首先测定了化合物9a流感病毒的抑制活性，其EC₅₀值为0.042μmol/L(表 3，entry 2)。接下来，考察了取代基R¹与R²对抑制活性的影响，首先考察了当取代基R²为氢、R¹单独存在时对抑制活性的影响(表 3，entry 3~9)。当R¹为强吸电子基团，如硝基以及三氟甲基时，化合物在初始浓度下对流感病毒几乎没有抑制作用(表 3，entry 3，9)；当R¹为氢原子时，化合物也没有抑制活性(表 3，entry 6)；当R¹为供电子取代基，如甲基以及甲氧基时，相应化合物可以分别以35.34μmol/L以及35.71μmol/L的EC₅₀值对流感病毒产生抑制(表 3，entry 4，7)；当R¹为大位阻基团，如苯基时，化合物也没有抑制活性(表 3，entry 8)。值得注意的是当R¹为卤素原子时，化合物对流感病毒抑制活性较高，EC₅₀值为5.54μmol/L(表 3，entry 5)。

  表 3

  

  表 3  Nucleozin衍生物的合成及抑制活性的测定^a

  Table 3.  The synthesis of nucleozin derivatives and determination of their inhibitory activities

  下载: 导出CSV

  Entry	R1	R2	Products	Yield/% b	EC50 /(μmol/L) c
  1	4-NO2	2-Cl	Nucleozin	—	0.077
  2	4-NO2	2-CH3	9a	87	0.042
  3	4-NO2	H	9b	85	> 100 c
  4	4-CH3	H	9c	86	35.34
  5	4-Cl	H	9d	84	5.54
  6	H	H	9e	88	> 100 c
  7	4-OCH3	H	9f	86	35.71
  8	4-Ph	H	9j	85	> 100 c
  9	4-CF3	H	9h	83	> 100 c
  10	H	2-CH3	9i	85	40.04
  11	H	2-Cl	9j	90	33.47
  12	4-CH3	2-CH3	9k	84	22.29
  13	4-Cl	2-CH3	9l	95	2.75
  14	4-NO2	2-OCH3	9m	90	4.9
  15	5-NO2	2-CH3	9n	84	> 100 c
  a反应条件：将200mg化合物8溶于10mL无水二氯甲烷中，加入2.5eq EDCI、2.5eq HOBT以及1.2eq化合物4，室温搅拌过夜；b硅胶柱分离收率；c化合物稀释的初始浓度为100μmol/L

  进一步考察当取代基R¹为氢时，R²基团改变对抑制活性的影响。研究发现，当R²为甲基或氯原子时，相应化合物可分别以40.04和33.47 μmol/L的EC₅₀值对流感病毒产生抑制(表 3，entry 10，11)；当取代基R¹和R²都存在且相对位置为间位时，相应的化合物均有较好的抑制活性(表 3，entry 2，12~14)。研究发现，当R²为甲基或甲氧基、R¹为吸电子取代基时，相应化合物的抑制活性往往较高(表 3，entry 13, 14)。相比之下当R²为甲基、R¹为强吸电子基硝基时，化合物的抑制活性最高(表 3，entry 2)。最后考察当取代基R¹和R²都存在且相对位置为对位时的抑制活性，发现相应化合物在初始浓度下对流感病毒几乎没有抑制作用(表 3，entry 15)；同时考察含有嘧啶杂环的化合物9o的抑制活性，发现其在初始浓度下对流感病毒几乎没有抑制作用(图式 4)。

  图式 4

  

  图式 4.  化合物9o的合成及其抑制活性测定

  Scheme 4.  The synthesis of compound 9o and its inhibitory activity

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.   结论

  小分子化合物Nucleozin作为靶向流感病毒核蛋白的抑制剂，针对目前流感病毒日益严重的耐药性问题具有独特的优势，有着良好的开发前景。本文围绕Nucleozin分子中与哌嗪直接相连的芳环部分进行研究，通过钯催化偶联反应合成了一系列衍生物，初步明确了该部分的构效关系，并且将氯原子替换为甲基，发现与Nucleozin相比，在相同实验条件下，其抑制活性得到了较大提高，EC₅₀值由0.077μmol/L提高到0.042μmol/L。由于甲基的空间电子效应，使得其能够不同程度地改变生物活性分子的药物活性以及改善药物分子的代谢动力学性质，并且改善药物分子在生物体内的分布。研究结果表明，甲基的引入可能改变分子构象并且改善蛋白-配体的相互作用，从而进一步提高抑制活性，对该类分子成药性的提高具有积极的意义。

• 1. [1]

     (a) A Loregian, B Mercorelli, G Nannetti et al. Cell. Mol. Life Sci., 2014, 71; 3659~3683; (b) A S Monto. Clin. Infect. Dis., 2009, 48:20~25.

  2. [2]

     E Quigley. Drug Discov. Today, 2006, 11:478~480. doi: 10.1016/j.drudis.2006.04.010

  3. [3]

     B Pang, N N Cheung, W Zhang et al. Sci. Rep., 2016, 6:29684. doi: 10.1038/srep29684

  4. [4]

     (a) C E De. Nat. Rev. Drug Dis., 2006, 5:1015~1025; (b) S D Cady, K Schmidt-Rohr, J Wang et al. Nature, 2010, 463:689~692. doi: 10.1038/nrd2175

  5. [5]

     (a) P J P Adabala, E B Legresley, N Bance et al. J. Org. Chem., 2013, 78:10867~10877; (b) K Das. J. Med. Chem. 2012, 55:6263~6277. doi: 10.1021/jo401854w

  6. [6]

     A Portela, P Digard. J. Gen. Virol., 2002, 83:723~734. doi: 10.1099/0022-1317-83-4-723

  7. [7]

     R Y Kao, D Yang, L S Lau et al. Nat. Biotechnol., 2010, 28:600~605. doi: 10.1038/nbt.1638

  8. [8]

     (a)张姝, 屈博毅, 海俐 等. 中国药物化学杂志, 2016, 1:1~9; (b) S W Gerritz, C Christopher, K Sean et al. PNAS, 2011, 108:15366~15371; (c) C Y Su, T J Cheng, M I Lin et al. PNAS, 2010, 10:19151~19156. (d) H Cheng, J Wan, M Lin et al. J. Med. Chem., 2012, 55:2144~2153.

• 

  图式 1  Nucleozin的化学结构

  Scheme 1  The structure of Nucleozin

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图式 2  Nucleozin衍生物的设计合成

  Scheme 2  The design and synthesis of derivatives of Nucleozin

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图式 3  钯催化的2-溴嘧啶和N-Boc哌嗪的偶联反应

  Scheme 3  Pd-catalyzed coupling reaction of 2-bromopyrimidine and N-Boc piperazine

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图式 4  化合物9o的合成及其抑制活性测定

  Scheme 4  The synthesis of compound 9o and its inhibitory activity

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  表 1  偶联反应条件的优化^a

  Table 1.  Conditions optimization of the coupling reaction

  Entry	Cat.	Ligand	Base	Solvent	Yield/% b
  1	CuI	TMEDA	tBuONa	toluene	trace
  2	Pd2dba3	BINAP	K2CO3	toluene	19
  3	Pd2dba3	BINAP	Cs2CO3	toluene	62
  4	Pd2dba3	BINAP	tBuONa	toluene	80
  5	Pd2dba3	Xantphos	tBuONa	toluene	35
  6	Pd(OAc)2	BINAP	tBuONa	toluene	54
  7	Pd(OAc)2	SPhos	tBuONa	toluene	27
  8	Pd(OAc)2	Xantphos	tBuONa	toluene	28
  9	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	toluene	86
  10	Pd(OAc)2	—	Cs2CO3	toluene	NR e
  11	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	dioxane	12
  12	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	DMF	80
  13	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	toluene	78 c
  14	Pd(OAc)2	BINAP	Cs2CO3	toluene	70 d
  a反应条件：将150mg化合物2以及1.5eq化合物1a置于5mL无水甲苯中，加入10(mol)%的催化剂、11(mol)%的配体以及1.4eq碱，氮气保护，100℃反应10h；b硅胶柱分离收率；c反应温度为80℃；d催化剂的加入量为5(mol)%，配体的加入量为6(mol)%；e NR：不反应

  下载: 导出CSV

  表 2  钯催化偶联反应的底物拓展^a

  Table 2.  Substrate scope of the Pd-catalyzed coupling reaction

  Entry	R1	R2	Products	Yield/% b
  1	4-NO2	H	3b	81
  2	4-CH3	H	3c	87
  3	4-Cl	H	3d	88
  4	H	H	3e	95
  5	4-OCH3	H	3f	75
  6	4-Ph	H	3g	95
  7	4-CF3	H	3h	92
  8	H	2-CH3	3i	82
  9	H	2-Cl	3j	80
  10	4-CH3	2-CH3	3k	65
  11	4-Cl	2-CH3	3l	82
  12	4-NO2	2-OCH3	3m	95
  13	5-NO2	2-CH3	3n	84
  a反应条件：将150mg化合物2以及1.5eq化合物1置于5mL无水甲苯中，加入10(mol)%的Pd(OAc)2、11(mol)%的BINAP以及1.4eq Cs2CO3，氮气保护，100℃反应10h；b硅胶柱分离收率

  下载: 导出CSV

  表 3  Nucleozin衍生物的合成及抑制活性的测定^a

  Table 3.  The synthesis of nucleozin derivatives and determination of their inhibitory activities

  Entry	R1	R2	Products	Yield/% b	EC50 /(μmol/L) c
  1	4-NO2	2-Cl	Nucleozin	—	0.077
  2	4-NO2	2-CH3	9a	87	0.042
  3	4-NO2	H	9b	85	> 100 c
  4	4-CH3	H	9c	86	35.34
  5	4-Cl	H	9d	84	5.54
  6	H	H	9e	88	> 100 c
  7	4-OCH3	H	9f	86	35.71
  8	4-Ph	H	9j	85	> 100 c
  9	4-CF3	H	9h	83	> 100 c
  10	H	2-CH3	9i	85	40.04
  11	H	2-Cl	9j	90	33.47
  12	4-CH3	2-CH3	9k	84	22.29
  13	4-Cl	2-CH3	9l	95	2.75
  14	4-NO2	2-OCH3	9m	90	4.9
  15	5-NO2	2-CH3	9n	84	> 100 c
  a反应条件：将200mg化合物8溶于10mL无水二氯甲烷中，加入2.5eq EDCI、2.5eq HOBT以及1.2eq化合物4，室温搅拌过夜；b硅胶柱分离收率；c化合物稀释的初始浓度为100μmol/L

  下载: 导出CSV
•