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• 杀菌剂的应用和杀虫剂及除草剂一样, 已在全球范围内成为保护农作物丰收不可缺少的手段之一, 在世界范围内杀菌剂新品种虽层出不穷, 然而, 植物病菌是极易产生抗性的一类微生物, 因此, 为了防止杀菌剂的抗性发展, 研发作用机理独特、广谱高效的杀菌剂己成为国际上研究开发的重点.在目前人们正在努力探索的杀菌剂靶标酶中, 丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex, PDHc)是一个令人关注的作用靶标. PDHc是连接糖酵解与三羧酸循环的关键酶, 也是生物体内能量代谢过程的关键酶^{[1, 2]}(图 1). PDHc主要是由三种酶高度组合而成, 其中包括丙酮酸脱羧酶E1组分^[3~6] (pyruvate dehydrogenase complex E1 component, PDHc-E1, EC 1.2.4.1), 二氢硫辛酸转乙酰基酶E2 (dihydrolipoyl transacetylase, PDHc-E2, EC 2.3.1.12)和二氢硫辛酸脱氢酶E3 (dihydrolipoyl dehydrogenase, PDHc-E3, EC 1.8.1.4).如果PDHc活性受到抑制, 将导致产生的乙酰辅酶A减少, 使三羧酸循环不能正常进行, 从而干扰生物体的正常代谢, 最终导致生物体死亡^[7], 其中丙酮酸脱羧酶(PDHc-E1)是PDHc催化反应的起始酶, 其催化的第一步反应是唯一的不可逆反应.前期的理论研究表明, 如果针对PDHc-E1设计抑制剂, 干扰第一步关键反应的正常进行, 将高效导致有害生物体的死亡^[8].杀菌剂克菌丹为目前唯一报道的对PDHc有抑制作用的广谱杀菌剂, 但无研究表明克菌丹是针对PDHc-E1的抑制剂^[9].由于温血动物中的PDHc与微生物中的PDHc的组成结构及同源性存在显著的差异性, 为设计合成高选择性PDHc抑制剂提供了可行性.因此, 针对国内外未见PDHc E1抑制剂类杀菌剂的研究空白, 开展以PDHc E1为靶标的杀菌剂的合理设计, 探索发现具有高效高选择的PDHc E1抑制剂或高效杀菌活性化合物, 具有很好的研究价值和应用价值.

  图 1

  

  图 1.  丙酮酸脱氢酶复合体的催化作用机制

  Figure 1.  Catalytic mechanism of pyruvate dehydrogenase complex

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  在PDHc-E1催化的过程中需要辅酶ThDP的参与才能进行, 因此目前获得PDHc-E1抑制剂的研究策略之一是通过设计辅酶ThDP的类似物来占据ThDP的活性空腔, 以达到抑制PDHc-E1活性的目的^{[10, 11]}.在20世纪80年代国外就已有通过对辅酶ThDP的结构修饰来获得PDHc-E1抑制剂的研究报道^[12~15], 但无PDHc-E1抑制剂作为杀菌剂研究应用的报道.对ThDP的结构修饰大部分是集中在噻唑环, 保留焦磷酸结构部分.该类抑制剂虽然对PDHc-E1具有很好的抑制活性, 但存在结构复杂、不易合成、选择性差以及焦磷酸结构部分的多电荷使细胞吸收和生物利用度差等诸多的问题, 导致实用性差^[16]. 2012年, 本课题组贺军波^[17]首次通过三步合成获得了对大肠杆菌(E. coli) PDHc-E1具有抑制活性的2-甲基-4-氨基-5-(取代-1H-1, 2, 3-三唑基)甲基嘧啶衍生物L, 但其杀菌活性却较差(图 2).本课题组长期致力于丙酮酸脱氢酶抑制剂的研究, 为本研究奠定了实验基础^[18~24].

  图 2

  

  图 2.  辅酶ThDP的结构修饰

  Figure 2.  Structural modification of coenzyme ThDP

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  腙类化合物是由肼与醛或酮缩合而成的一类Schiff碱类化合物, 许多此类化合物表现出良好的生物活性、较强的配位能力和多样的配位方式, 因此在医药、农药等方面具有广泛的应用^[25].例如许多腙类农药已实现商品化, 如杀菌剂醌肟腙(Benquiox)、嘧菌腙(Ferimzone)、玉米田苗后除草剂氟吡草腙(Diflufenzopyr)、肠内杀菌剂硝呋齐特(Nifuroxazide)、化合物A对立枯丝核菌具有很好的抑制活性等^[26].此类化合物共同的特点是含有NHN＝活性亚结构单元(图 3).

  图 3

  

  图 3.  含腙结构单元药物

  Figure 3.  Drugs containing structural units of hydrazone

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  分析了先导结构L在大肠杆菌PDHc-E1活性空腔中的作用模式(图 4), 分子模拟分析发现先导结构中的醚键(图 4红色方框所示)与周围氨基酸残基并无相互作用, 三唑环结构单元与活性空腔中的氨基酸残基His640和Glu522有较弱的相互作用, 基于N的电负性比O的电负性弱, 因此N比O对核外电子的束缚能力差, 这样有利于N核外电子与周围的氨基酸残基形成氢键, 因此本文利用含孤对电子对的活性亚结构单元——腙取代先导结构L中的桥键设计出了目标化合物I.期望获得以E. coli PDHc-E1为靶标具有杀菌活性的化合物, 同时考察桥键的结构变化对其E. coli PDHc-E1的抑制活性, 以及杀菌活性的影响.其设计思路如Scheme 1所示.合成路线见Scheme 2.

  图 4

  

  图 4.  抑制剂在大肠杆菌PDHc-E1中的结合模式

  Figure 4.  Optimal binding model for inhibitor into the active site of E. coli PDHc-E1

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  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物的设计

  Scheme 1.  Design of target compounds

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  图式 2

  

  图式 2.  目标化合物的合成路线

  Scheme 2.  Synthetic route of the target compound

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  1.   结果与讨论

  1.1   化合物的合成

  1.1.1   中间体2-甲基-4-氨基-5-甲醛嘧啶(M2)的合成

  目标化合物I的合成路线中, 化合物M2是最重要的中间体.为了高收率获得中间体M2, 在合成过程中需要注意以下几点: (1)制备乙醇钠时, 应该在冰浴下加入钠, 以免温度过高造成体系变黄, 影响下一步收率; (2)加入乙氧基亚甲基丙二腈时, 应该用机械搅拌, 并且保证有足够的乙醇, 因为反应开始后体系中有大量的固体析出产生凝固, 难以搅拌; (3)还原过程中使用的雷尼镍应该回收循环利用, 母液应该用水合肼进行中和后才能柱层析, 否则产物难以分离.中间体M2的氢谱显示, 嘧啶环上的氨基氢不是单峰, 而是裂分为两重峰, 原因是其中一个氢与羰基上氧成了氢键, 如Eq. 1所示.

  (1)

  1.1.2   目标化合物I的合成

  目标化合物I未见文献报道.根据含腙类似物合成的相关文献报道, 腙主要是肼与醛在加热条件下脱去一分子水而生成.利用此原理来合成目标化合物I过程中, 发现肼与醛的投料比对反应有很大的影响.本文合成目标化合物I所用到的醛为2-甲基-4-氨基-5-甲醛嘧啶(M2), 其在乙醇中的溶解性较好, 而肼在乙醇中溶解性较差.为了使肼反应完全, 本文采用醛与肼的投料比为1.1:1来合成I, 反应冷却后有白色固体直接析出, 未反应的醛溶解在乙醇中, 无杂质析出.反应完成后的体系可直接加水使目标化合物析出并抽滤, 并且杂质可通过简单的抽滤而除去, 得到的目标化合物再用适量的乙醇洗去未反应的醛或其它杂质, 即可得到较纯的目标化合物I.此方法操作简单, 无需复杂的后处理程序.

  1.2   目标化合物I对E. coli PDHc-E1酶抑制活性

  为了筛选发现具有高效杀菌活性的PDHc-E1抑制剂, 本文将重点考察所合成的目标化合物I对E. coli PDHc-E1的酶抑制活性及其杀菌活性, 总结目标化合物I的结构与活性之间的关系, 同时也可探讨目标化合物的设计思想的合理性.

  1.2.1   E. coli PDHc-E1酶抑制活性测试方法

  通过本课题组对测活方法及酶动力学条件的系统研究, 表明采用2, 6-二氯吲哚酚(DCIP)法^{[17, 18]}具有便于操作、实验数据相对稳定、且试剂价格便宜等优点, 因此选择DCIP法来测定化合物I对E. coli PDHc-E1 (Cx-ace)活性的影响.

  实验原理:丙酮酸在PDHc-E1的催化作用下生成的羟乙基-ThDP能够还原2, 6-DCIP, 而2, 6-DCIP在600 nm处有光的吸收, 因此可通过测定600 nm处吸光度值的减少量来反映2, 6-DCIP被还原的量, 进而表示酶活.吸光度值减少的量越少说明化合物对PDHc-E1的抑制活性越好.

  通过上述酶活测试原理来检测化合物对酶活的抑制作用, 由此来筛选高效的PDHc-E1抑制剂, 初筛待测化合物的终浓度设定为100 μmol/L.具体筛选方法如下.

  置95 μL反应混合液: 0.05 μg/μL PDHc-E1, 50 mmol/L K₃PO₄ (pH＝6.4), 50 μmol/L ThDP, 0.4 mmol/L DCIP, 100 μmol/L用DMSO溶解的待测化合物(对照组加等量的DMSO), 其余用水补齐, 共配置4倍量的反应液于2 mL的EP管中, 放置在37 ℃水浴锅中温育3 min.

  酶促反应:分别取95 μL温育后的反应液加入到96孔酶标板的3个孔中, 迅速加入5 μL 1 mmol/L的底物丙酮酸钠开启反应, 置于酶标仪中测600 nm处的吸光度值, 反应0 min时测定OD_{0 min}, 37 ℃酶标仪中反应5 min后, 测定OD_{5 min}.然后求5 min内的吸光度值改变量ΔOD₆₀₀＝OD_{0 min}－OD_{5 min}.每次测定均做溶剂DMSO的对照实验, 每组实验做3~5个平行.

  (3) 数据处理:化合物引起的吸光度值的改变需扣除溶剂DMSO的影响, 100 μmol/L待测化合物的抑制率的计算公式如下:

  抑制率(%)＝[(ΔOD对照－ΔOD实验)/ΔOD对照]×100%

  1.2.2   目标化合物I对E.coli PDHc-E1酶抑制活性

  如表 1所示, 部分化合物在100 μmol/L浓度下对E.coli PDHc-E1酶显示一定的抑制活性, 如化合物I-1、I-3、I-4、I-6、I-9、I-11的抑制率均大于60%, 选择部分化合物进一步测试了它们的抑制作用IC₅₀.如表 2所示, 除I-1的抑制活性优于相应的先导化合物L-1外, 其它化合物对E.coli PDHc-E1酶的抑制活性较相应的先导化合物L有所下降, 如化合物I-3、I-4、I-5.可能是结构修饰后I的分子链长过短, 造成苯环结构单元难以到达对应的活性位点, 虽然修饰后的目标化合物对E. coli PDHc-E1的抑制活性较对应的部分先导化合物L有所降低(表 2), 但此类化合物仍然是以E. coli PDHc-E1为靶标的抑制剂, 为后续发现高效PDHc-E1酶抑制剂奠定了实验基础.

  表 1

  

  表 1  目标化合物I对E. coli PDHc-E1的抑制率(%)

  Table 1.  Structure and inhibitory activity (%) of title compounds I

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  化合物	R	抑制率/%		化合物	R	抑制率a/%
  I-1	H	62.60			I-8	2, 4, 6-Cl3	37.10
  I-2	3-I	31.56		I-9	4-CF3	84.52
  I-3	4-NO2	68.25		I-10	3-Cl	34.00
  I-4	4-Cl	66.67		I-11	3-Br	76.89
  I-5	2, 4-Cl2	0		I-12	2-Br	39.78
  I-6	4-Br	70.93		I-13	3-NO2	31.44
  I-7	2, 4-F2	23.81		I-14	2-NO2	16.44

  表 2

  

  表 2  目标化合物I对E. coli PDHc-E1的IC₅₀

  Table 2.  IC₅₀ of title compounds I against E. coli PDHc-E1

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  化合物	R	IC50/(μmol•L－1)
  I-1	H	29.33
  L-1	H	55.15
  I-3	4-NO2	30.46
  L-3	4-NO2	8.80
  I-4	4-Cl	32.65
  L-4	4-Cl	26.44
  I-5	2, 4-Cl2	＞100
  L-5	2, 4-Cl2	18.74
  I-6	4-Br	26.45
  I-9	4-CF3	19.22
  I-11	3-Br	22.56

  1.3   目标化合物的分子模拟研究

  为了进一步从分子水平理解化合物I与E. coli PDHc-E1作用靶点的结合模式.本文借助计算机辅助药物设计软件Sybyl7.3进行了分子对接模拟研究.在此研究中是选取ThDP/PDHc-E1复合物的晶体结构(PDB:1L8A)^[27]作为研究的分子对接模型, E. coli PDHc-E1的辅因子ThDP分子占据的位点为分子对接活性腔.为了理解抑制剂与靶标PDHc-E1相互作用模式, 本文选择对E. coli PDHc-E1抑制活性最高的化合物I-9进行了分子对接研究.其分子对接的结果如图 5所示.

  图 5

  

  图 5.  抑制剂I-9在大肠杆菌PDHc-E1中的结合模式

  Figure 5.  Optimal binding model for inhibitor I-9 into the active site of E. coli PDHc-E1

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  如图 5所示, I-9在PDHc-E1活性腔处的结合方式与本课题组前期研究表明的先导化合物L或ThDP在PDHc-E1活性腔处的结合方式相似, 以“V”型构象结合, 可分为三部分进行分析.在“V”型构象的右半部分, I-9嘧啶环上的氨基与Val192形成一个氢键, 氨基嘧啶环上的两个氮分别与Met194和Glu571形成两个氢键. “V”型构象的中间部分, 腙结构单元上的氮可以与Glu522形成氢键作用.以上氢键作用与先导结构一样, 但是先导结构中的苯环上的取代基与氨基酸残基发生了氢键作用, 而本文化合物中的苯环上取代基与周围氨基酸残基无氢键作用, 有可能是碳链过短造成苯环部分不能到达活性位点, 这也很好地解释了本文设计的化合物中苯环上有取代基的抑制活性较先导差, 而苯环上无取代基的抑制活性较先导高.如I-3 (R＝4-NO₂), I-4(R＝4-Cl)和I-5 (R＝2, 4-Cl₂)对E. coli PDHc-E1的抑制活性均比对应的先导化合物L-3、L-4、L-5低, 而苯环上无取代的I-1 (R＝H)对E. coli PDHc-E1的抑制活性比对应的先导化合物L-1高.为进一步设计高效E. coli PDHc-E1抑制剂指明了方向.

  1.4   目标化合物的杀菌活性

  选择E. coli PDHc-E1为微生物的模式靶酶, 其研究目的是试图通过设计E. coli PDHc-E1的高效抑制剂, 并从中筛选发现对农业病害具有杀菌活性的化合物.上述研究结果表明所设计的部分化合物I对微生物大肠杆菌PDHc-E1具有不同程度的抑制作用, 但是否具有杀菌活性则成为本文关注的问题.因此, 本文选择了农业上常见的9种病害为测试靶标, 如代表性真菌:黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen)、花生褐斑病菌(Cercospora arachidicola Hori)、苹果轮纹病菌(Physalospora piricola Nose)、小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) deBary)、黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani).测试浓度为50 μg/mL, 用十字交叉法测量菌落直径, 每个培养基测量三次, 取其平均值为菌落的平均直径, 并通过以下公式计算抑制率, 测试结果如表 3所示[对照药剂为百菌清].

  表 3

  

  表 3  目标化合物I对真菌的抑制活性(%)

  Table 3.  Inhibition rate (%) of title compounds I against fungus

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  化合物	黄瓜枯萎病菌	花生褐斑病菌	苹果轮纹病菌	小麦赤霉病菌	油菜菌核病菌	黄瓜灰霉病菌	水稻纹枯病菌
  I-1	50.0	54.5	73.1	38.1	70.8	50.0	50.0
  I-2	38.9	18.2	42.3	71.4	77.1	50.0	87.5
  I-3	16.7	18.2	26.9	19.0	29.2	28.6	78.1
  I-4	61.1	63.6	73.1	76.2	83.3	64.3	84.4
  I-5	22.2	36.4	42.3	14.3	35.4	42.9	59.4
  I-6	66.7	100.0	100.0	76.2	91.7	85.7	81.3
  I-7	38.9	100.0	100.0	66.7	68.8	85.7	68.8
  I-8	27.8	36.4	42.3	71.4	35.4	42.9	56.3
  I-9	66.7	63.6	84.6	81.0	68.8	75.0	90.6
  I-10	50.0	72.7	76.9	81.0	70.8	60.7	84.4
  I-11	54.5	53.3	62.5	62.5	48.3	78.8	74.1
  I-12	22.2	36.4	38.5	47.6	33.3	42.9	65.6
  I-13	27.8	27.3	34.6	33.3	14.6	7.1	40.6
  I-14	11.1	18.2	19.2	28.6	35.4	7.1	12.5
  百菌清	83.3	75.0	92.3	73.1	96.4	96.1	96.1

  菌落扩散直径＝菌落平均直径－菌饼直径

  抑制率(%)＝(对照菌落扩散直径－处理菌落扩散直径)/(对照菌落扩散直径)×100%

  通过表 3可以看出, 在50 μg/mL浓度下, 部分I系列化合物对花生褐斑、苹果轮纹、小麦赤霉、油菜菌核与水稻纹枯表现出中等至较好的杀菌活性, 其中化合物I-6 (R＝4-Br)对小麦赤霉和油菜菌核病菌; I-9 (R＝4-CF₃)对小麦赤霉和水稻纹枯; I-10对小麦赤霉的抑制活性与商品化杀菌剂百菌清相当.而本课题组前期文献报道的先导化合物L对上述菌种显示较弱的抑制活性, 大部分化合物在100 μg/mL浓度下的抑制率小于60%^[17].

  特别是化合物I-6与I-7对花生褐斑与苹果轮纹抑制活性为100%, 优于百菌清的抑制活性, 具有进一步研究的价值.因此我们选择化合物I-6与I-7进一步测试了对花生褐斑与苹果轮纹的EC₅₀值, 结果总结如表 4和表 5所示.

  表 4

  

  表 4  I-6和I-7对花生褐斑病菌的EC₅₀^a

  Table 4.  EC₅₀ of I-6 and I-7 against Cercospora arachidicola Hori

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  化合物	y＝a+bx	EC50/(μg•mL－1)	R
  I-6	y＝1.1356x+3.6945	14.1125	0.9736
  I-7	y＝0.8014x+4.1105	12.8793	0.9937
  百菌清	y＝1.3220x+3.5711	12.0476	0.9565
  a杀菌活性数据由南开大学生测室提供.

  表 5

  

  表 5  I-6和I-7对苹果轮纹病菌的EC₅₀^a

  Table 5.  EC₅₀ of I-6 and I-7 against Physalospora piricola Nose

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  化合物	y＝a+bx	EC50/(μg•mL－1)	R
  I-6	y＝0.5755x+5.1106	0.6425	0.9884
  I-7	y＝0.7254x+5.0720	0.7956	0.9836
  百菌清	y＝1.3890x+3.7981	7.3342	0.9862
  a杀菌活性数据由南开大学生测室提供.

  通过对I-6和I-7以及对照药剂百菌清对花生褐斑病的毒力曲线测定, 结果发现, 化合物I-6和I-7对花生褐斑病菌的EC₅₀值分别为14.11和12.88 μg/mL, 化合物I-7对花生褐斑病菌的防治效果较I-6好, 并与对照药剂百菌清活性相当(EC₅₀值为12.05 μg/mL).

  通过对I-6和I-7以及对照药剂百菌清对花生褐斑病的毒力曲线测定, 结果发现, 化合物I-6和I-7对苹果轮纹病的EC₅₀值分别为0.64和0.80 μg/mL, 化合物I-6对花生褐斑病的防治效果较I-7好, 两者都显著优于百菌清.其活性是对照药剂百菌清活性(EC₅₀值为7.33 μg/mL)的9倍以上.

  综上结果, I系列的化合物不仅对E. coli PDHc-E1具有一定的抑制活性, 而且其杀真菌活性显著优于先导化合物L, 因此, 该结构I具有进一步优化的研究价值, 也表明本文通过设计以微生物中的PDHc-E1为靶标的抑制剂, 可以获得具有杀菌活性的化合物, 本文进一步测试了这类化合物的除草及杀虫活性.测试结果表明此类化合物完全无除草及杀虫活性, 化合物I对虫草菌中的菌具有特定的选择性抑制活性, 符合本文以大肠杆菌PDHc-E1为靶标设计杀菌活性化合物的预期设想.

  2.   结论

  以课题组前期发现的微生物PDHc-E1抑制剂L为先导化合物, 根据L在活性空腔中的作用模式, 在其嘧啶环与苯环之间引入腙结构单元替代三唑结构单元, 设计并合成了14个新型氨基嘧啶衍生物I.目标化合物均通过¹H NMR、¹³C NMR、质谱和元素分析进行了结构表征.丰富了丙酮酸脱氢酶抑制剂的结构物类型.

  生物活性研究发现I系列的化合物不仅对E. coli PDHc-E1具有一定的抑制活性, 而且杀真菌活性显著优于先导化合物, 如I-6 (R＝4-Br)与I-7 (R＝2, 4-F₂)对花生褐斑的EC₅₀值分别为14.11, 12.88 μg/mL, 与商品化杀菌剂百菌清(12.05 μg/mL)相近或相当, 对苹果轮纹的EC₅₀值分别为0.64和0.80 μg/mL, 是商品化杀菌剂百菌清抑制效果(7.33 μg/mL)的9倍以上.特别是I-6不仅对E. coli PDHc-E1显示较好的抑制活性(IC₅₀＝26.45 μmol/L), 同时对真菌花生褐斑和苹果轮纹显示高效活性, 具有进一步研究的价值.以上结果表明通过修饰先导结构L中的桥键可以获得不仅对E. coli PDHc-E1靶酶具有抑制作用, 而且对农业中的有害真菌靶标也具有显著抑制活性(显著优于先导化合物)的化合物, 达到了结构优化的目的.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  ¹H NMR和¹³C NMR谱用Varian VNMR 400 MHz核磁共振仪(氘代二甲亚砜为溶剂); 质谱用QTRAP液质联用仪或Finnigan Trace Ms质谱仪; 元素分析用Vario ELIII CHNSO型元素分析仪; 熔点采用上海精密科学仪器有限公司的WRS-IB型熔点仪测定(温度未经校正).德国Heidolph公司生产的MR3001型恒温磁力搅拌器, Buchi R-200型旋转蒸发仪, Sartotuis电子天平, ZF-200暗箱式紫外分析仪, DLSB低温冷却循环泵, 70-1型远红外干燥箱等仪器.

  盐酸乙脒、雷尼镍、取代苯胺、无水乙醇、氯化亚锡均为分析纯.

  3.2   实验方法

  3.2.1   中间体2-甲基-4-氨基-5-甲醛嘧啶(M2)的合成

  参照文献方法^[28].在100 mL单口瓶中加入50 mL乙醇, 冰盐浴下加入钠(4.6 g, 0.2 mol)、盐酸乙脒(18.8 g, 0.2 mol)、乙氧基亚甲基丙二腈(24.4 g, 0.2 mol), 反应0.5 h过滤得2-甲基-4-氨基-5-甲腈嘧啶M1.

  在250 mL三口瓶中加入M1 (20.1 g, 0.15 mol), 冰乙酸75 mL, 雷尼镍5 g, 加热反应, 薄层色谱(TLC)跟踪反应直至反应完全, 过滤除去雷尼镍, 减压蒸馏除去乙酸, 柱层析(洗脱剂为:石油醚/乙酸乙酯, V:V＝1:1)以75%收率得到黄色固体M2. m.p. 197~198 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.41 (s, 3H, CH₃), 7.91 (s, 1H, NH), 8.17 (s, 1H, NH), 8.65 (s, 1H, py-H), 9.82 (s, 1H, CHOH).

  3.2.2   中间体取代苯肼(M3)的合成

  参照文献方法^[29], 以苯肼M3-1的合成为例.在100 mL三口瓶中加入30%的盐酸3 mL、水2 mL、对硝基苯胺(1.38 g, 0.01 mol), 降温至0~5 ℃, 从液面下的导管滴加亚硝酸钠(0.70 g, 0.0101 mol)和2 mL水配成的溶液.加完搅拌30 min得橙黄色透明重氮液.在8 ℃以下, 将氯化亚锡的盐酸溶液滴加到上述重氮液中, 继续反应2 h.将反应混合物进行抽滤, 得到淡粉色固体对硝基苯肼盐酸盐.在100 mL的烧杯中加入上述对硝基苯肼盐酸盐, 适量水, 搅拌30 min, 滴加30%的氢氧化钠溶液至pH＝7得苯肼M3-1.直接用于下一步.用同样的方法可以制备M3其余的中间体.

  3.2.3   目标化合物I的合成通法

  25 mL的单颈圆底烧瓶中分别加入中间体M2 (0.29 g, 2.2 mmol)和各种取代苯肼M3 (2 mmol)并溶于10 mL无水乙醇.油浴加热至回流3 h, 有白色固体析出, TLC检测反应完全, 将反应液倒入冷水中, 搅拌有固体析出.抽滤, 滤饼用少量二氯甲烷洗, 干燥即得目标化合物I.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基苯腙)-嘧啶(I-1):淡黄色固体, 产率85%, m.p. 249~251 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.37 (s, 3H, CH₃), 6.75 (s, 1H, ArH), 6.91 (d, J＝7.1 Hz, 2H, ArH), 7.22 (s, 2H, ArH), 7.75 (s, 2H, NH₂), 7.90 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.16 (s, 1H, CH＝N), 11.22 (s, 1H, NH); ¹³C NMR(100 MHz, DMSO-d₆)δ: 164.95, 163.16, 159.19, 155.65, 144.85, 136.37, 129.35, 119.04, 108.45, 25.42; ESI-MS m/z: 228.2 [M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₃N₅: C 63.42, H 5.77, N 30.82; found C 63.35, H 5.69, N 30.59.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-3-碘苯腙)-嘧啶(I-2):淡黄色固体, 产率79%. m.p. 242~243 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.37 (s, 3H, CH₃), 6.95~7.10 (m, 3H, ArH), 7.25 (d, J＝1.8 Hz, 1H, ArH), 7.73 (s, 2H, NH₂), 7.95 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.20 (s, 1H, CH＝N), 10.59 (s, 1H, NH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 165.33, 159.19, 156.20, 146.28, 137.77, 131.33, 127.27, 119.87, 111.19, 108.15, 95.58, 25.50; ESI-MS m/z: 354.1 [M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₂IN₅: C 40.81, H 3.42, N 19.83; found C 40.81, H 3.52, N 19.91.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-4-硝基苯腙)-嘧啶(I-3):红色固体, 产率76%. m.p＞260 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)δ: 2.37 (s, 3H, CH₃), 7.01 (d, J＝8.4 Hz, 2H, ArH), 7.70 (s, 2H, NH₂), 8.03 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.09 (d, J＝8.8 Hz, 2H, ArH), 8.23 (s, 1H, CH＝N), 11.22 (s, 1H, NH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 166.24, 159.31, 157.50, 149.94, 141.71, 138.45, 126.29, 111.05, 107.48, 25.55; ESI-MS m/z: 273.4 [M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₂N₆O₂: C 52.94, H 4.44, N 30.87; found C 52.63, H 4.31, N 30.71.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-4-氯苯腙)-嘧啶(I-4):黄色固体, 产率71%. m.p. 240~241 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.37 (s, 3H, CH₃), 6.93 (d, J＝8.7 Hz, 2H, Ar-H), 7.27 (d, J＝8.6 Hz, 2H, ArH), 7.73 (s, 2H, NH₂), 7.92 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.20 (s, 1H, CH＝N), 10.49 (s, 1H, NH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 165.27, 159.20, 156.13, 143.79, 137.36, 129.14, 122.24, 113.22, 108.24, 25.49; ESI-MS m/z: 262.3[M+1]⁺. Anal. Calcd for C₁₂H₁₂ClN₅: C 55.07, H 4.62, N 26.76; found C 55.00, H 4.41, N 26.37.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-2, 4-二氯苯腙)-嘧啶(I-5):淡黄色固体, 产率69%. m.p. 239~241 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.38 (s, 3H, CH₃), 7.26 (s, 1H, ArH), 7.31 (s, 1H, Ar-H), 7.47 (s, 1H, ArH), 7.73 (s, 2H, NH₂), 8.17 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.37 (s, 1H, CH＝N), 10.03 (s, 1H, NH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆)δ: 165.86, 159.34, 156.81, 141.39, 140.15, 128.83, 128.22, 122.44, 117.02, 114.28, 107.89, 25.53; ESI-MS m/z: 296.3 [M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₁Cl₂N₅: C 48.67, H 3.74, N 23.65; found C 48.75, H 3.85, N 23.61.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-4-溴苯腙)-嘧啶(I-6):黄色固体, 产率77%. m.p. 237~238 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.37 (s, 3H, CH₃), 6.89 (d, J＝7.8 Hz, 2H, Ar-H), 7.38 (d, J＝7.8 Hz, 2H, ArH), 7.75 (s, 2H, NH₂), 7.93 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.20 (s, 1H, CH＝N), 10.51 (s, 1H, NH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 165.14, 163.29, 159.27, 155.80, 144.14, 137.35, 131.96, 113.75, 108.29, 25.38; ESI-MS m/z: 306.2[M+1]⁺. Anal. Calcd for C₁₂H₁₂BrN₅: C 47.08, H 3.95, N 22.87; found C 47.00, H 4.15, N 22.55.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-2, 4-二氟苯腙)-嘧啶(I-7):黄色固体, 产率71%. m.p. 222~224 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.37 (s, 3H, CH₃), 7.02(s, 1H, ArH), 7.22 (d, 2H, ArH, J＝8.7 Hz), 7.74 (s, 2H, NH₂), 8.15 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.15 (s, 1H, CH＝N), 10.20 (s, 1H, NH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 165.40, 163.15, 159.28, 156.15, 139.45, 130.07, 113.73, 111.67, 111.47, 108.12, 104.40, 104.16, 103.90, 25.43; ESI-MS m/z: 264.1 [M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₁F₂N₅: C 54.75, H 4.21, N 26.60; found C 54.41, H 4.39, N 26.84.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-2, 4, 6-三氯苯腙)-嘧啶(I-8):淡黄色固体, 产率79%. m.p＞260 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.35 (s, 3H, CH₃), 7.64 (s, 2H, Ar-H), 7.72 (s, 2H, NH₂), 8.13 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.20 (s, 1H, CH＝N), 9.69 (s, 1H, NH); ESI-MS m/z: 330.1 [M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₀Cl₃N₅: C 43.60, H 3.05, N 21.18; found C 43.73, H 2.96, N 21.31.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-4-三氟甲基苯腙)-嘧啶(I-9):淡黄色固体, 产率84%. m.p. 252~254 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.38 (s, 3H, CH₃), 7.06 (d, J＝8.4 Hz, 2H, ArH), 7.56 (d, J＝8.5 Hz, 2H, ArH, ), 7.75 (s, 2H, NH₂), 8.00 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.24 (s, 1H, CH＝N), 10.83 (s, 1H, NH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 165.67, 159.31, 156.67, 147.77, 138.99, 126.68, 123.72, 119.17, 118.86, 118.54, 118.22, 111.48, 107.99, 25.50; ESI-MS 295.9 [M+1]⁺ Anal. Calcd for C₁₃H₁₂F₃N₅: C 52.88, H 4.10, N 23.72; found C 52.63, H 4.32, N 23.53.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-3-氯苯腙)-嘧啶(I-10):淡黄色固体, 产率80%. m.p. 246~248 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.37 (s, 3H, CH₃), 6.78 (d, J＝7.7 Hz, 1H, ArH), 6.87 (d, J＝8.3 Hz, 1H, ArH), 7.24 (t, J＝8.0 Hz, 1H, ArH), 7.74 (s, 2H, NH₂), 7.94 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.22 (s, 1H, CH＝N), 10.56 (s, 1H, NH); ESI-MS m/z: 262.3 [M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₂ClN₅: C 55.07, H 4.62, N 26.76; found C 55.04, H 4.44, N 26.54.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-3-溴苯腙)-嘧啶(I-11):黄色固体, 产率79%. m.p＞260 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.37 (s, 3H, CH₃), 6.92 (dd, J＝8.0, 2.0 Hz, 2H, ArH), 7.06 (t, J＝2.0 Hz, 2H, ArH), 7.19 (t, J＝8.0 Hz, 1H, ArH), 7.74 (s, 2H, NH₂), 7.94 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.22 (s, 1H, CH＝N), 10.55 (s, 1H, NH); ESI-MS m/z: 306.2 [M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₂BrN₅: C 47.08, H 3.95, N 22.87; found C 47.30, H 4.00, N 22.69.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-2-溴苯腙)-嘧啶(I-12):绿色固体, 产率82%. m.p＞260 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.38 (s, 3H, CH₃), 6.77 (t, J＝7.5 Hz, 1H, ArH), 7.23 (d, J＝8.0 Hz, 1H, ArH), 7.33 (t, J＝7.7 Hz, 1H, ArH), 7.52 (d, J＝7.9 Hz, 1H, ArH), 7.77 (s, 2H, NH₂), 8.17 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.38 (s, 1H, CH＝N), 9.66 (s, 1H, NH); ESI-MS m/z: 306.0 [M+1]⁺. Anal. Calcd for C₁₂H₁₂BrN₅: C 47.08, H 3.95, N 22.87; found C 47.03, H 3.88, N 22.97.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-3-硝基苯腙)-嘧啶(I-13):淡黄色固体, 产率84%. m.p. 255~257 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.38 (s, 3H, CH₃), 7.35 (d, J＝7.9 Hz, 1H, ArH), 7.50 (t, 1H, Ar-H, J＝8.0 Hz), 7.58 (d, 1H, Ar-H, J＝8.0 Hz), 7.68 (s, 1H, Ar-H), 7.76 (s, 2H, NH₂), 8.00 (s, 1H, pyrimidine-H), 8.26 (s, 1H, CH＝N), 10.89 (s, 1H, NH); ESI-MS m/z: 273.1 [M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₂N₆O₂: C 52.94, H 4.44, N 30.87; found C 52.57, H 4.42, N 30.53.

  2-甲基-4-氨基-5-(甲基-2-硝基苯腙)-嘧啶(I-14):淡黄色固体, 产率56%. m.p. 220~222 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 2.57 (s, 3H, CH₃), 7.00 (s, 1H, ArH), 7.73 (dd, J＝6.6, 8.0 Hz, 2H, ArH), 8.12 (d, J＝8.1 Hz, 1H, ArH), 8.57 (d, J＝6.6, 15.2 Hz, 2H, NH₂), 8.69 (s, 1H, pyrimidine-H), 9.68 (s, 1H, CH＝N), 11.28 (s, 1H, NH); ESI-MS m/z: 273.1[M+1]⁺. Anal. calcd for C₁₂H₁₂N₆O₂: C 52.94, H 4.44, N 30.87; found C 52.84, H 4.55, N 30.67.

  辅助材料(Supporting Information)   产物的核磁共振(氢谱、碳谱)谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图 1  丙酮酸脱氢酶复合体的催化作用机制

  Figure 1  Catalytic mechanism of pyruvate dehydrogenase complex

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  图 2  辅酶ThDP的结构修饰

  Figure 2  Structural modification of coenzyme ThDP

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  图 3  含腙结构单元药物

  Figure 3  Drugs containing structural units of hydrazone

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  图 4  抑制剂在大肠杆菌PDHc-E1中的结合模式

  Figure 4  Optimal binding model for inhibitor into the active site of E. coli PDHc-E1

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  图式 1  目标化合物的设计

  Scheme 1  Design of target compounds

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  图式 2  目标化合物的合成路线

  Scheme 2  Synthetic route of the target compound

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  图 5  抑制剂I-9在大肠杆菌PDHc-E1中的结合模式

  Figure 5  Optimal binding model for inhibitor I-9 into the active site of E. coli PDHc-E1

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  表 1  目标化合物I对E. coli PDHc-E1的抑制率(%)

  Table 1.  Structure and inhibitory activity (%) of title compounds I

  化合物	R	抑制率/%		化合物	R	抑制率a/%
  I-1	H	62.60			I-8	2, 4, 6-Cl3	37.10
  I-2	3-I	31.56		I-9	4-CF3	84.52
  I-3	4-NO2	68.25		I-10	3-Cl	34.00
  I-4	4-Cl	66.67		I-11	3-Br	76.89
  I-5	2, 4-Cl2	0		I-12	2-Br	39.78
  I-6	4-Br	70.93		I-13	3-NO2	31.44
  I-7	2, 4-F2	23.81		I-14	2-NO2	16.44

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  表 2  目标化合物I对E. coli PDHc-E1的IC₅₀

  Table 2.  IC₅₀ of title compounds I against E. coli PDHc-E1

  化合物	R	IC50/(μmol•L－1)
  I-1	H	29.33
  L-1	H	55.15
  I-3	4-NO2	30.46
  L-3	4-NO2	8.80
  I-4	4-Cl	32.65
  L-4	4-Cl	26.44
  I-5	2, 4-Cl2	＞100
  L-5	2, 4-Cl2	18.74
  I-6	4-Br	26.45
  I-9	4-CF3	19.22
  I-11	3-Br	22.56

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  表 3  目标化合物I对真菌的抑制活性(%)

  Table 3.  Inhibition rate (%) of title compounds I against fungus

  化合物	黄瓜枯萎病菌	花生褐斑病菌	苹果轮纹病菌	小麦赤霉病菌	油菜菌核病菌	黄瓜灰霉病菌	水稻纹枯病菌
  I-1	50.0	54.5	73.1	38.1	70.8	50.0	50.0
  I-2	38.9	18.2	42.3	71.4	77.1	50.0	87.5
  I-3	16.7	18.2	26.9	19.0	29.2	28.6	78.1
  I-4	61.1	63.6	73.1	76.2	83.3	64.3	84.4
  I-5	22.2	36.4	42.3	14.3	35.4	42.9	59.4
  I-6	66.7	100.0	100.0	76.2	91.7	85.7	81.3
  I-7	38.9	100.0	100.0	66.7	68.8	85.7	68.8
  I-8	27.8	36.4	42.3	71.4	35.4	42.9	56.3
  I-9	66.7	63.6	84.6	81.0	68.8	75.0	90.6
  I-10	50.0	72.7	76.9	81.0	70.8	60.7	84.4
  I-11	54.5	53.3	62.5	62.5	48.3	78.8	74.1
  I-12	22.2	36.4	38.5	47.6	33.3	42.9	65.6
  I-13	27.8	27.3	34.6	33.3	14.6	7.1	40.6
  I-14	11.1	18.2	19.2	28.6	35.4	7.1	12.5
  百菌清	83.3	75.0	92.3	73.1	96.4	96.1	96.1

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  表 4  I-6和I-7对花生褐斑病菌的EC₅₀^a

  Table 4.  EC₅₀ of I-6 and I-7 against Cercospora arachidicola Hori

  化合物	y＝a+bx	EC50/(μg•mL－1)	R
  I-6	y＝1.1356x+3.6945	14.1125	0.9736
  I-7	y＝0.8014x+4.1105	12.8793	0.9937
  百菌清	y＝1.3220x+3.5711	12.0476	0.9565
  a杀菌活性数据由南开大学生测室提供.

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  表 5  I-6和I-7对苹果轮纹病菌的EC₅₀^a

  Table 5.  EC₅₀ of I-6 and I-7 against Physalospora piricola Nose

  化合物	y＝a+bx	EC50/(μg•mL－1)	R
  I-6	y＝0.5755x+5.1106	0.6425	0.9884
  I-7	y＝0.7254x+5.0720	0.7956	0.9836
  百菌清	y＝1.3890x+3.7981	7.3342	0.9862
  a杀菌活性数据由南开大学生测室提供.

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