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• 糖作为生物体的基本构建砌块和储能单元, 以糖缀合物的形态参与许多重要的生命过程^[1~5].其中, 糖蛋白在细胞信号识别、神经调控、信息传递及免疫调节等生命活动中扮演着重要角色.糖肽是由糖基与氨基酸或多肽链共价相连形成的缀合物, 具有与糖蛋白相似的多种生物功能, 同时又不具有糖蛋白巨大的分子量和复杂的结构, 因而糖肽作为研究糖蛋白的重要模型引起了人们的广泛关注^[6].目前, 采用固相合成法、选择性化学修饰法、酶催化糖基化法以及生物半合成法等有机化学合成手段构建天然糖蛋白/糖肽类似物的方法, 均存在合成步骤繁琐、产率较低等缺点, 限制了其进一步的发展和应用.近些年, 有机合成及聚合反应技术的发展为人工合成糖蛋白/糖肽类似物提供了新的思路和手段.将聚肽/聚氨基酸与糖类化合物偶联制备的糖聚肽, 作为天然糖蛋白/糖肽的合成类似物, 其具有分子结构规整、制备简单、易于设计和结构调控等优势, 为糖蛋白/糖肽活性与构效关系的研究提供了基础, 已发展成为探索、研究并阐明糖蛋白相关科学问题的有力工具.同时, 糖聚肽由于具有良好的生物相容性及独特的生物学性能, 在生物诊断、组织工程、细胞培养、药物输送等领域均显示出广泛的应用前景^[7~9].

  到目前为止, 糖聚肽合成的研究已有20多年历史, 且在最近几年呈现出蓬勃发展的趋势, 但大量制备结构规整的糖聚肽仍存在一定困难, 从而限制了糖聚肽在材料及生物医药领域的应用.点击化学(“Click” chemistry)具有高效、快速, 高选择性、反应条件温和及立体选择性好等优点, 在材料制备、药物合成等领域均得到了广泛应用^{[10, 11]}.除了传统的铜催化的叠氮/炔的1, 3-偶极环加成反应外, 目前巯基/烯、巯基/炔、巯基/马来酰亚胺、Diels-Alder以及卤代物与氮氧自由基偶联等新型点击反应也得到蓬勃发展, 这些合成技术为糖聚肽及其类似物的制备提供了便捷手段.本文对近些年点击反应在糖聚肽及其类似物合成中的应用进行了综述, 并对合成策略进行了简述与评价.

  1.   点击化学

  点击化学(“Click” chemistry)是由美国著名的化学家Sharpless于2001年首次提出的^[12], 它是继组合化学之后又一具有颠覆性的合成技术, 以其反应简单、快速、高效等优点得到化学研究者的广泛青睐.其中, 铜催化的叠氮-炔1, 3-偶极环加成反应(copper-catalyzed azide- alkyne cycloaddition, CuAAC)是其代表性反应^{[13, 14]}.近些年, 无金属催化的绿色点击反应更是成为研究的热点, 被成功应用于聚合物制备、药物合成、蛋白质组学和材料科学等领域^{[15, 16]}.

  目前点击反应的主要类型有^[17]: (1) Cu(I)催化的叠氮与炔基反应生成1, 2, 3-三唑五元环的反应(CuAAC); (2)环张力促进的叠氮与环炔的环加成反应(strain- promoted cycloaddition of alkynes and azides, SPAAC); (3)共轭双烯与亲双烯体的Diels-Alder (D-A)环加成反应; (4)巯基与各类官能团之间的反应, 包括巯基-烯/炔(Thiol-ene/yne)化学反应、巯基-卤素取代反应、巯基-环氧反应以及巯基和异氰酸酯的反应等(Scheme 1). CuAAC反应可以在多种质子和非质子溶剂中进行, 并且不受其它官能团的影响, 是研究最早且应用最广的点击反应类型.该反应采用Cu(I)为催化剂, 也可以通过Cu(II)或者Cu(0)在反应过程中原位还原/氧化制备.但是, 使用铜盐作为催化剂, 后处理较为繁琐, 且产物中残留的部分很难去除干净, 限制了其在药物合成和生物医药领域的应用.随后, 科研工作者经过探索研究发现, 环炔与叠氮的反应不需要金属催化剂, 仅依靠环炔的环张力即可促进两官能团之间的反应.该反应速率虽然没有CuAAC高, 但可以通过在环炔中引入强吸电子基团(如氟原子等)来改变环张力, 加速反应的进行. SPAAC的发展为生物体内蛋白质的荧光标记、分子示踪等提供了新途径. D-A环加成反应是指共轭双烯(diene)和亲双烯体(dienophile)之间进行[4+2]环加成反应形成稳定的六元环化合物的反应.该反应通常在较温和的条件下进行, 一般不需要催化剂, 且反应进行到一定温度时可以发生逆反应, 应用于聚合物制备中, 不仅有利于聚合物的降解、回收和利用, 还可以用于构建化学键动态变化的功能聚合物.巯基与各类官能团的反应分为两大类^[18]:一类是自由基加成反应, 包括巯基-烯(Thiol- ene)和巯基-炔(Thiol-yne)的自由基加成反应; 另一类是亲核加成反应, 包括巯基与环氧、异氰酸酯、卤素和缺电子双键的迈克尔加成反应.其中, 巯基-烯/炔化学反应是近年来发展出的一类新型的点击反应, 一般通过加热或紫外光照射产生自由基从而引发反应.该反应便捷、快速、立体选择性好, 可以在无金属催化剂和无溶剂的条件下进行, 被认为是最有发展前景的无金属催化点击反应^{[19, 20]}.

  图式 1

  

  图式 1.  常见点击反应类型示意图

  Scheme 1.  Schematic illustrations to show the typical "Click" reactions

  (a) Cu(I)-catalyzed cycloaddition of alkynes and azides (CuAAC), (b) strain-promoted cycloaddition of alkynes and azides (SPAAC), (c) Diels-Alder reaction and (d) thiol-involved reactions

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  由于点击反应效率高(产率一般高于90%), 反应条件温和, 催化剂高效稳定, 且所用单体中官能团均可以通过简单温和的化学反应转化得到, 因而符合聚合反应的要求, 被广泛应用于各种拓扑结构聚合物(包括线形、刷形、星形、环状及树枝状大分子等)材料的制备当中.除线形聚合物以外的拓扑结构聚合物都具有比较特殊的性质, 如溶解性好、粘度低、热稳定性高和可修饰官能团位点多, 且溶液自组装行为复杂, 因而在超分子与自组装领域、生物医药等领域均有广阔的应用前景, 日益受到大家的重视.相关的合成方法及应用进展已有综述报道^[21~32], 在此不再赘述.

  2.   点击反应在糖聚肽及其类似物合成中的应用

  糖聚肽(glycopolypeptides), 即糖苷化合成的聚氨基酸/多肽, 严格意义上是指含有侧挂糖基元的聚氨基酸/多肽.另外, 聚氨基酸/多肽与天然多糖或糖聚合物(采用化学合成方法制备的含有侧挂糖基元的高分子化合物)的化学偶联物, 包括线性、树枝状等各种拓扑结构的合成聚合物统称为糖聚肽类似物^[33].由于该领域最近几年才有较大发展, 尚未形成统一的表述, 因此, 很多文献中不严格区分糖聚肽和糖聚肽类似物.

  糖聚肽作为天然糖蛋白的合成类似物, 与糖蛋白相比, 具有制备简单、结构规整、易于批量化生产等优点.人工合成糖聚肽不仅有助于理解天然糖蛋白的物理化学性质及生物学特性, 同时为糖蛋白结构与功能之间构效关系的研究提供了模型^[8](图 1).糖聚肽高分子中聚氨基酸骨架具有良好的生物可降解性, 并依据分子结构的不同显示出α-螺旋、β-折叠等二级结构, 有利于通过自组装形成丰富形貌的聚集体^{[34, 35]}.另外, 已有大量研究表明, 糖缀合物是重要的生物信息分子, 在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用, 并可通过与蛋白质的特异性识别, 实现生物信息的有效传递^{[4, 36]}.将糖分子偶联到聚氨基酸侧链或末端, 可赋予糖聚肽高分子良好的亲水性和生物相容性, 以及生物分子识别和细胞粘附特性等.糖聚肽高分子自组装体系因其具有能仿生模拟表面含糖缀合物的细胞或细胞器结构的特性而引起了科研工作者深入的研究和探索. Lecommandoux等^[37]合成的葡聚糖和聚(γ-谷氨酸-L苄酯)(PBLG)的嵌段共聚物(dextran-b-PBLG)在水溶液中自组装成了类“病毒衣壳”结构的囊泡组装体; 糖基化聚(炔丙基甘氨酸)为亲水链段、PBLG为疏水链段的两亲糖聚肽(PBLG-b-PGG)依据亲疏水链段比例的不同, 在水溶液中自组装形成胶束、囊泡或蠕虫状聚集体, 且不同形貌聚集体均可特异性识别凝集素RCA₁₂₀^[38]. Deming等^[39]则研究了糖聚肽高分子的二级结构对自组装体的影响, 结果发现, 在具有相同疏水链结构的情况下, 亲水的糖聚肽嵌段若为无规结构, 则自组装成囊泡结构聚集体, 若为α-螺旋结构, 则形成无规则片状组装体.另外, 含糖聚肽的两亲杂化高分子也被应用于程序化分级自组装的研究及各种丰富形貌自组装聚集体的制备当中^[40~43].另一方面, 糖聚肽具有良好的生物相容性和独特的生理学性能, 在靶向药物输送、细胞组织培养、生物成像等领域均获得广泛关注. Wenz等^[44]合成了一种具有荧光分子标记的半乳糖侧挂修饰的聚赖氨酸, 并发现其具有靶向识别T淋巴细胞表面的L选择素CD26L的能力. Chen等^[45]制备的糖聚肽PPLG-b-PLGA溶液自组装形成纳米胶束, 高效同步负载抗肿瘤药物阿霉素(DOX); 该复合胶束具有pH响应性药物释放特性, 且能特异性靶向HepG2肝癌细胞.同时, 其制备所得PPLG-g-Man/HPPA共聚物, 通过溶液中酶催化的交联反应生成可注射(injectable)糖聚肽凝胶, 有望应用作为软骨组织工程中的三维仿生支架^[46].除此之外, 合成糖聚肽作为基因输送载体^[47]、细胞穿透材料^[48]、细胞的选择性吸附^[49]及活细胞膜的定点修饰材料^[50]等均有相关应用报道.糖聚肽的应用领域在图 2中表示.

  图 1

  

  图 1.  合成糖聚肽作为天然糖蛋白的仿生类似物^[8]

  Figure 1.  ynthetic glycopolypeptides as biomimetic analogues of natural glycoproteins

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  图 2

  

  图 2.  合成糖聚肽及其类似物在生物医药领域方面的应用

  Figure 2.  Biomedical applications for the synthesized glycopolypeptides and their analogues

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  糖聚肽在各个领域的应用也推动了科研工作者对其合成制备方法的深入研究.目前, 糖聚肽的合成方法主要有两种: (1)首先制备功能化的聚氨基酸前体, 再通过聚合后修饰法将糖分子引入到聚氨基酸侧链上; (2)首先合成糖苷化的α-氨基酸-N-羧酸酐(glyco-NCA)单体, 再通过NCA开环聚合高效制备结构规整的糖聚肽.另外, 也可以直接将含糖基元化学偶联到聚氨基酸链末端合成糖聚肽类似物, 示意图如图 3所示^{[9, 51]}.

  图 3

  

  图 3.  糖聚肽的制备策略示意图

  Figure 3.  Synthetic strategies of glycopolypeptides

  (a) Post-polymerization glycosylation of synthetic polypeptides, (b) polymerization of glycosylated N-carboxyanhydride (glycol-NCA) and (c) glycosylation at the end extremity of polypeptide

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  2.1   利用点击反应在聚氨基酸侧链键合糖分子

  人工合成聚氨基酸作为天然蛋白质或多肽的合成类似物, 具有优异的生物相容性和生物可降解性, 几十年前已被作为结构材料使用, 最近十几年随着生物材料的兴起而呈现出蓬勃发展的趋势, 被广泛应用于构筑精确有序的纳米组装体及作为基因/药物输送载体^[52].聚氨基酸的合成方法主要包括生物合成法、固相合成法以及α-氨基酸-N-羧酸酐(α-carboxyanhydrides, NCA)开环聚合法.其中, NCA开环聚合法具有操作简单、成本低、产率高、无消旋, 且聚合物分子量及分子量分布可控等优点, 目前已成为聚氨基酸制备的主要方法^[53].该方法通常是将α-氨基酸与(三)光气反应生成α-氨基酸-N-羧酸酐单体, 再通过亲核试剂或者有机碱(最为常见的是伯胺和醇盐负离子)及过渡金属配合物等引发NCA单体开环聚合, 高效可控制备得到结构规整的聚氨基酸(Scheme 2).同时, 该方法可以进一步制备嵌段、接枝及环状功能氨基酸聚合物. Deming等^[53~62]在该领域做出了许多开创性的工作, 并对NCA的活性/可控催化体系进行了较为深入的探索和有效的改进.经过60多年的发展, 到目前为止, 已有近200种不同的天然或非天然的NCA单体被制备出来, 用于聚氨基酸的合成.具体合成方法及聚合物的应用可参见相关综述报导^[63~72].

  图式 2

  

  图式 2.  NCA开环聚合法合成聚肽/氨基酸

  Scheme 2.  Synthesis of polypeptides via ROP of NCA

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  基于已有的聚氨基酸高分子骨架, 研究者首先联想到将糖基元通过化学偶联策略接枝到聚氨基酸侧链上制备糖聚肽.早期的合成方法是将糖分子通过酰胺键直接化学键合到天然氨基酸(如赖氨酸或谷氨酸)的活性侧基上(Scheme 3).由于较低的偶联反应活性及糖基的化学位阻作用, 糖基元接枝率大多低于60%.采用1-羟基苯并三唑(HOBt)或4-(4, 6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)偶联试剂, 接枝率最高可以达到90%左右, 但强烈依赖于糖基的化学结构或位阻^[73~77].最近, Heise等^[78]同样采用DMT-MM偶联试剂, 制备了系列具有精确序列结构的糖聚肽嵌段共聚物, 并研究了嵌段序列特异性的糖分子在溶液中的二级结构及对凝集素的特异性识别作用(Scheme 4).虽然半乳糖分子的接枝效率达到90%~93%, 但非定量的接枝反应仍会对后续糖聚肽分子的二级结构及生物活性的对比研究产生影响.除此之外, Roche^[79]和Li等^[80]采用异硫氰酸根功能化糖基试剂, 将糖分子通过硫脲键(Scheme 3c)偶联到聚氨基酸/多肽侧链上, 该反应即使采用过量的糖基化试剂, 接枝率仍不超过40%.

  图式 3

  

  图式 3.  采用非点击化学偶联策略在聚氨基酸上接枝糖基元

  Scheme 3.  Glycosylation onto polypeptide backbones via non- click chemical coupling approaches

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  图式 4

  

  图式 4.  系列具有可变一级结构的嵌段序列特异性糖聚肽的合成^[78]

  Scheme 4.  ynthesis of well-defined block-sequence-specific glycopolypeptides with systematically verified primary structure

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  近些年, 随着点击化学在高分子学科领域中的应用, 一系列具有可“点击”侧链的聚氨基酸被相继开发出来, 并应用于糖聚肽的制备中. Hammond等^[81]于2009年首次报道了将叠氮化的聚乙二醇(PEG-azides)通过Cu(I)催化的叠氮-炔环加成点击反应偶联到聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯) (PPLG)上, 以近乎定量的反应产率制备得到含有侧挂PEG的聚合物分子刷.随后, Chen等^[82]采用同样的聚氨基酸前体PPLG, 将三种叠氮基功能化糖分子通过CuAAC反应偶联到聚合物主链上, 分别制备得到含有侧挂葡萄糖、半乳糖和甘露糖分子的糖聚肽(Scheme 5), 拓展了合成糖聚肽的糖基多样性.该小组进一步利用此合成策略, 制备了含有侧挂糖基元和3-(4-羟苯基)-丙酰胺(HPPA)的共聚物作为仿生软骨组织工程支架^[46], 以及糖聚肽与聚谷氨酸(PLGA)的嵌段共聚物作为阿霉素(DOX)的高效输送载体^[83]. Brougham等^[84]以氧化铁纳米颗粒表面的氨基为引发剂, 引发γ-炔丙基-L-谷氨酸酯-NCA单体开环聚合, 再通过CuAAC反应高效偶联糖分子, 制备所得糖聚肽修饰磁纳米粒子具有良好的溶液分散性, 并具有生物识别及磁共振成像特性, 有望作为磁共振成像造影剂. Heise等^[85]采用CuAAC反应, 将半乳糖和二乙二醇单甲醚(mEO₂)同步偶联到PPLG侧链上, 制备了具有温敏特性的糖聚肽.有趣的是, 该糖聚肽对凝集素RCA₁₂₀的特异性识别能力与聚合物溶液的浊点温度有关, 且可以通过半乳糖和mEO₂的接枝比例进行调控.这为温度敏感的生物学响应功能材料的设计制备提供了新思路.除此之外, Gupta等^[86]制备了两亲均聚糖聚肽, 并研究了其自组装行为.但是, 上述采用PPLG后修饰糖基元的策略虽然可以高效定量得到功能糖聚肽, 但侧链中酯键在生理条件下会缓慢水解, 降低糖聚肽的生物活性.另外, 酯键在强酸和强碱溶液中均不稳定, 在多种官能团的脱保护基团反应条件下均会发生断裂, 从而限制了具有较复杂分子结构和多种功能的糖聚肽体系的进一步制备及应用.

  图式 5

  

  图式 5.  Chen等报道的利用点击反应对聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)的糖基化策略^[82]

  Scheme 5.  "Click" glycosylation of poly(γ-propargy-L-glutamate) by Chen et al.

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  基于上述酯键的不稳定性, 为了提高疏水侧链的水解稳定性, Heise和Lecommandoux等^[87~90]合成了炔丙基甘氨酸-NCA单体, 并通过一级胺引发的开环聚合反应制备了聚(炔丙基甘氨酸)均聚物及与PBLG的无规和嵌段共聚物.随后, 在三乙胺和催化量(PPh₃)₃CuBr的二甲基亚砜(DMSO)溶剂中, 与叠氮基功能化半乳糖高效反应, 获得具有水解稳定性的系列糖聚肽高分子.该糖聚肽均聚物PGG在溶液中呈现β-折叠结构, 并且与凝集素RCA₁₂₀具有特异性识别作用, 表现出良好的生物活性; 同时, 两亲嵌段共聚物PGG-b-PBLG通过“纳米沉淀法”自组装形成球状胶束、蠕虫状胶束和囊泡等多种形貌聚集体^[38].随后, Lecommandoux等^[91]采用更为廉价的天然氨基酸替代上述非天然氨基酸制备糖聚肽.该方法以ω-氨基叔丁氧羰基(Boc)保护的赖氨酸-NCA为前体, 经开环聚合制备聚氨基酸, 脱除Boc保护基后, 在碳二亚胺(DCC)的活化作用下, ω-氨基以近乎定量的产率偶联戊炔酸, 随后通过CuAAC反应高效接枝乳糖和半乳糖.

  另一种策略即是制备侧链含有叠氮基的聚氨基酸前体, 再与炔基功能化糖基元进行“Click”偶联. Zhang等^[92]于2010年首次合成了聚(γ-氯丙基-L-谷氨酸酯) (PCPLG), 经叠氮化钠处理, 侧链末端氯原子定量转化为叠氮基, 获得含有侧挂叠氮基的聚(γ-叠氮丙基-L-谷氨酸酯)(PAPLG), 再通过CuAAC反应键合1-炔丙基- α-D-甘露糖, 获得糖聚肽高分子.随后, Deming和Rhodes^[93]开发了一种新型的叠氮基功能化的聚氨基酸.该方法以苄氧羰基(CBz)保护的赖氨酸或鸟氨酸为前体, 首先将ω-氨基转变为叠氮基团, 再以(PMe₃)₄Co为引发剂, 引发叠氮基功能化的氨基酸-NCA单体开环聚合, 制备得到序列长度可控的均聚和共聚氨基酸, 进一步通过CuAAC点击反应与炔基功能化糖分子高效偶联生成糖聚肽(Scheme 6).该方法直接引发叠氮基功能化的NCA单体开环聚合, 避免了聚合反应后官能团转化不完全的缺陷; 并且, 侧链完全由亚甲基组成, 具有优异的水解稳定性.除此之外, Jiang等^[94]合成了γ-(2-叠氮乙基-L-谷氨酸酯)-NCA (AELG-NCA)单体, 并以含有二硫键的氨基封端聚己内酯PCL-SS-NH₂引发该NCA单体开环聚合, 后续通过CuAAC反应键合乳糖或半乳糖, 制备了具有细胞内还原响应性的两亲嵌段共聚物.

  图式 6

  

  图式 6.  采用叠氮基功能化聚氨基酸通过点击反应接枝糖基元制备糖聚肽^[93]

  Scheme 6.  Preparation of glycopolypeptide via "click" glycosylation with azide bearing polypeptide

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  除了CuAAC点击反应外, 近些年, 自由基介导的“巯基-烯(thiol-ene)”和“巯基-炔(thiol-yne)”反应也被报道应用于制备糖聚肽高分子. 2010年, Schlaad等^[95]首先合成了单分散(PDI＜1.10)的聚(烯丙基甘氨酸)及聚乙二醇-嵌段-聚(烯丙基甘氨酸), 并通过光或者热引发的“巯基-烯”点击化学反应, 以几乎定量的收率得到半乳糖接枝的糖聚肽高分子.该过程避免了繁琐的糖分子保护-脱保护反应, 并且反应过程中不需要使用金属催化剂^[96].随后, Schlaad等^{[97, 98]}进一步研究了通过“巯基-炔”反应将巯基功能化糖分子键合到聚(炔丙基甘氨酸)侧链上制备糖聚肽高分子.结果表明, 在炔基上键合第1个巯基功能化糖分子的效率高于90%, 但由于空间位阻的限制, 第2个糖分子接枝效率较低, 即使采用过量的巯基功能化糖分子, 最终偶联的糖分子与炔基物质的量之比不超过1.5.遗憾的是, 聚(烯丙基甘氨酸)和聚(炔丙基甘氨酸)在常用有机溶剂和水中溶解性均很差, 这限制了高分子量聚氨基酸的合成及后续糖分子接枝反应的效率.

  除此之外, Deming和Kramer^{[99, 100]}直接采用天然氨基酸——甲硫氨酸为原料制备聚(L-甲硫氨酸), 并在其侧链通过一种类似于“点击”反应的“甲硫氨酸烷基化”反应, 将含有碘基、三氟甲磺酸酯基或环氧基功能化的糖分子键合到聚氨基酸侧链上形成糖聚肽高分子.该反应直接采用廉价易得的天然氨基酸, 不需要侧链修饰及基团保护, 并且可以和其它氨基酸进行共聚, 其官能团对脱保护反应条件等均具有良好的兼容性.

  到目前为止, 已有数十种功能聚氨基酸被合成出来, 并通过后续“点击”反应制备得到糖聚肽, 具体分子结构在表 1中表示.继续丰富和发展可“点击”聚氨基酸和糖基元的种类, 简化合成步骤, 提高接枝反应的效率仍是目前研究的重点.

  表 1

  

  表 1  用于制备各种糖聚肽的可点击聚氨基酸及相应糖基元

  Table 1.  Clickable polypeptides and corresponding saccharide units for the synthesis of glycopolypeptides

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  Polypeptide	Saccharide unit

  2.2   利用点击反应制备含糖NCA单体, 再通过开环聚合制备糖聚肽

  糖聚肽高分子的另一种合成方法是直接利用含糖NCA单体开环聚合.含糖NCA单体的制备和应用可以追溯到19世纪60年代. Rüde等^[101]在1966年首次合成了含葡萄糖分子的丝氨酸NCA单体, 但受限于含糖NCA单体的纯度, 无法开环聚合得到高分子量糖聚肽.之后虽有含糖NCA单体合成方法的陆续报道, 但纯度问题始终未得到有效解决.直到2010年, Deming等^[102]报道了一种利用快速柱层析法(flash chromatography)对所制备的含糖赖氨酸-NCA单体进行纯化的方法, 首次解决了含糖NCA单体纯度较低的问题.随后, 才有一些含糖NCA单体被合成出来, 并应用到糖聚肽的制备当中.

  其中, 点击反应为含糖NCA单体的制备提供了新的思路. 2012年, Deming等^[103]报道了一种以L-半胱氨酸或L-高半胱氨酸为起始原料, 通过“巯基-烯”点击化学方法, 将全乙酰基保护半乳糖或葡萄糖分子高效地键合到氨基酸上形成氨基酸-糖缀合物(glyco-Cys NCA), 进一步通过Leuch反应进行环合, 快速柱层析分离后, 得到高纯度糖分子键合的NCA单体.该单体可以通过(PMe₃)₄Co引发开环聚合, 糖聚肽的链长随单体/引发剂比例线性增长, 聚合度最高可以达到200, 且分子量分布较窄(PDI＜1.2) (Scheme 7).之后, Schlaad等^[104]发展了一种通过“巯基-烯”反应直接将巯基功能化全乙酰基保护半乳糖分子键合到烯丙基甘氨酸NCA上, 原位合成含糖NCA单体(Scheme 8), 大大简化了含糖NCA单体的制备纯化步骤.通过控制巯基化糖分子的接枝比, 开环聚合后可以获得侧基同时含有烯丙基和糖基元的糖聚肽高分子.

  图式 7

  

  图式 7.  Deming等报道的糖基化-NCA单体的制备及聚合反应^[103]

  Scheme 7.  Preparation and polymerization of glycol-NCAs by Deming et al.^[103]

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  图式 8

  

  图式 8.  “一锅法”部分糖基化及其与烯丙基甘氨酸环内酸酐单体的共聚合反应^[104]

  Scheme 8.  "One-pot" partial glycosylation and copolymerization of AGly NCA^[104]

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  采用含糖NCA单体开环聚合制备糖聚肽的方法, 虽然能有效避免聚合后修饰带来的接枝反应不完全的问题, 但含糖NCA单体的制备和纯化是难点, 目前仅有为数不多的单体被合成出来并成功应用于后续糖聚肽制备当中, 具体结构如图 4所示.因此, 如何利用高效而便于操作的有机合成反应制备纯化含糖NCA单体, 并扩展含糖NCA单体的种类是目前研究的重点方向.

  图 4

  

  图 4.  糖基取代NCA单体的化学结构

  Figure 4.  Chemical structures of sugar-substituted NCA monomers

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  2.3   通过点击反应将糖基元与聚氨基酸/多肽链末端进行偶联制备糖聚肽类似物

  为克服上述两种聚糖肽合成制备中存在的步骤繁琐、纯化困难、单体种类有限等不足, 近些年, 科研工作者尝试通过点击反应将糖基元偶联到聚氨基酸/多肽链末端制备糖聚肽类似物, 以期进一步拓展糖聚肽及其类似物的种类.采用这种方法, 可以有效地将天然单糖^[105]、双糖^[106]、低聚糖、多糖^{[37, 107, 108]}以及人工合成糖聚合物^[109]偶联到聚氨基酸/多肽链末端, 制备线性、枝状等不同拓扑结构的聚合物.这些丰富结构的糖聚肽类似物, 为糖组学(Glycomics)的研究以及疾病的诊断和治疗提供了新途径.同时, 人工合成两亲糖聚肽类似物的结构和组成更易于进行聚合物亲疏水比例及理化性能的调控, 有利于进一步可控制备球形、纤维状及蠕虫状胶束和囊泡自组装体. Lecommandoux小组^{[37, 90, 107, 110~112]}首先采用3-叠氮丙胺引发γ-苄基-L-谷氨酸酯-NCA单体开环聚合, 得到末端具有叠氮基团的聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)(PBLG), 再通过CuAAC反应将末端炔基功能化的葡聚糖、透明质酸、半乳聚糖等键合到疏水的PBLG末端, 制备得到系列具有两亲性嵌段结构的糖聚肽类似物.其中PBLG的α-螺旋结构有利于层状结构聚集体的形成, 且DOX负载自组装纳米颗粒表面的透明质酸可以特异性靶向过表达CD44受体的癌细胞.

  Wang等^[109]运用可逆加成-断裂链转移(RAFT)活性自由基聚合、NCA开环聚合和“Click”偶联的组合合成方法, 制备了含有侧挂半乳糖基和PBLG的两亲嵌段共聚物PMAgala-SS-PBLG.首先制备了含有二硫键且末端叠氮基功能化的RAFT链转移剂, 并对丙酮保护的甲基丙烯酸半乳糖酯单体MAIpGP进行聚合, 制备得到叠氮基功能化的糖聚合物, 再通过CuAAC反应和末端炔基功能化的PBLG偶联, 脱除半乳糖保护基后得到目标聚合物.该合成策略可以有效调控糖聚合物以及聚氨基酸嵌段的长度, 在保留半乳糖嵌段生物活性和聚氨基酸嵌段α-螺旋结构的同时, 界面二硫键的引入可以实现两亲自组装胶束在HepG2肝肿瘤细胞内的还原响应性药物释放, 有望作为高生物相容性的肝靶向高效药物输送载体得到进一步应用(Scheme 9).

  图式 9

  

  图式 9.  还原响应性糖聚肽类似物的制备及其生物识别特性及作为药物输送载体的应用^[109]

  Scheme 9.  Schematic illustration of preparing redox-responsive glycopolypeptide analogues and their biological recognition and drug delivery applications

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  在具有不同拓扑结构的糖聚肽的制备方面, 也有点击反应的相关应用报道. Gu等^[113]通过CuAAC反应将三代精氨酸树状大分子成功偶联到乳糖酸修饰的普鲁兰多糖上, 制备了两亲树状糖聚肽LP-g-G3P, 其负载抗肿瘤药物DOX的自组装复合胶束能特异性抑制肝癌细胞的增殖. Lecommandoux等^[114]首先制备了聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-嵌段-聚(D/L-炔丙基甘氨酸)(PBLG-b-PPAG₅)共聚物, 继而在炔基末端通过“Click”策略偶联大分子葡聚糖, 制备了树枝状糖聚肽类似物, 并研究了其溶液自组装行为(图 5). Yan等^[115]采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)可控自由基聚合、N-羧基环丙酸酐(NCA)开环聚合和“Click”偶联组合方法, 制备了两亲多臂共聚物, 随后将近红外荧光探针和DOX共价偶联到聚氨基酸嵌段上.该大分子药物不仅具有pH响应性和近红外光成像特性, 同时表面接枝的半乳糖分子能通过受体靶向增强肝细胞的内吞能力. Chan-Park等^[116]采用类似的多反应组合策略, 制备了四臂星状糖聚肽类似物P(GlyEMA)- P(Lys) (Scheme 10).其中, 聚赖氨酸两臂有抗菌活性, 糖聚合物两臂在提高聚合物对哺乳动物细胞相容性的同时有效增强同靶向细菌的结合作用.因而, 采用该聚合物合成策略制备的四臂糖聚肽类似物, 能够有效利用糖分子和氨基酸独特的生物活性, 为抗菌材料的制备提供了新思路.

  图 5

  

  图 5.  通过CuAAC点击反应合成树枝状糖聚肽类似物^[114]

  Figure 5.  Synthesis of Oligosaccharide-based branched glycopolypeptide by CuAAC "Click" reaction

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  图式 10

  

  图式 10.  通过原子转移自由基聚合(ATRP)、开环聚合和点击化学制备四臂星状糖聚合物-聚肽轭合物P(GlyEMA)-P(Lys)^[116]

  Scheme 10.  Preparation of the four-arm star glycopolymer-polypeptide conjugates P(GlyEMA)-P(Lys) via controlled radical polymerization, ring-opening polymerization, and "Click"chemistry

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  3.   结语及展望

  关于糖聚肽合成策略及功能化应用的研究是目前化学、材料科学及生物医学领域重要的前沿研究方向.大部分有关糖聚肽合成方法的研究工作均发表于2010年以后, 且其在生物医用方面的应用也刚刚起步, 尚有大量未知的领域需要探索.例如, 利用人工合成糖聚肽深入研究糖蛋白的结构及功能, 仿生模拟天然层状结构蛋白(如胶原、角蛋白等), 利用糖聚肽对生物活性物质进行识别、检测、分离和提纯, 调控细胞黏附、诱导细胞增殖分化等.这些应用的推进均离不开糖聚肽合成技术的发展.

  点击反应的发展大大促进了糖聚肽的合成制备, 得益于其具有的反应条件温和、效率高、对功能性基团耐受性好和产物易于提纯等优点, 已被证实是一种高效实用的反应.但是, 采用聚合后修饰法及糖苷化-NCA单体开环聚合法制备糖聚肽的策略, 仍然存在接枝反应非定量、合成纯化步骤繁琐、单体种类有限等不足.未来, 在基于糖聚肽的合成方面还有很大的发展空间需要开拓, 主要包括以下几个方面: (1)简化制备路线, 缩短合成步骤, 发展高效提纯策略; (2)发展更加绿色的点击聚合反应, 如以水、离子液体作为溶剂, 且无金属催化(Metal Free)的点击聚合反应, 如光催化反应、有机催化反应和酶模型催化反应等; (3)开发更加高效、普适、功能化的(如智能响应和生物活性)单体和与单体相匹配的点击反应类型, 拓展糖聚肽高分子的种类; (4)合成序列结构精确可控的糖聚肽高分子; (5)继续制备具有丰富拓扑结构[如超支化结构、对称/不对称高级结构、大环结构以及特殊的3D结构(如Janus, Cubic, Origami和Inclusion)和理化与生物功能(如分子识别、受体靶向、膜通道模拟、信号传导和分子伴侣)的糖聚肽.在此基础上, 以上述功能糖聚肽作为组装基元, 进一步采用超分子组装和纳米聚集体可控合成方法, 制备得到基于功能糖聚肽的仿生纳米组装体, 为其后续的生物医学功能化应用提供基础.

  
  
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  图式 1  常见点击反应类型示意图

  Scheme 1  Schematic illustrations to show the typical "Click" reactions

  (a) Cu(I)-catalyzed cycloaddition of alkynes and azides (CuAAC), (b) strain-promoted cycloaddition of alkynes and azides (SPAAC), (c) Diels-Alder reaction and (d) thiol-involved reactions

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  图 1  合成糖聚肽作为天然糖蛋白的仿生类似物^[8]

  Figure 1  ynthetic glycopolypeptides as biomimetic analogues of natural glycoproteins

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  图 2  合成糖聚肽及其类似物在生物医药领域方面的应用

  Figure 2  Biomedical applications for the synthesized glycopolypeptides and their analogues

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  图 3  糖聚肽的制备策略示意图

  Figure 3  Synthetic strategies of glycopolypeptides

  (a) Post-polymerization glycosylation of synthetic polypeptides, (b) polymerization of glycosylated N-carboxyanhydride (glycol-NCA) and (c) glycosylation at the end extremity of polypeptide

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  图式 2  NCA开环聚合法合成聚肽/氨基酸

  Scheme 2  Synthesis of polypeptides via ROP of NCA

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  图式 3  采用非点击化学偶联策略在聚氨基酸上接枝糖基元

  Scheme 3  Glycosylation onto polypeptide backbones via non- click chemical coupling approaches

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  图式 4  系列具有可变一级结构的嵌段序列特异性糖聚肽的合成^[78]

  Scheme 4  ynthesis of well-defined block-sequence-specific glycopolypeptides with systematically verified primary structure

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  图式 5  Chen等报道的利用点击反应对聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)的糖基化策略^[82]

  Scheme 5  "Click" glycosylation of poly(γ-propargy-L-glutamate) by Chen et al.

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  图式 6  采用叠氮基功能化聚氨基酸通过点击反应接枝糖基元制备糖聚肽^[93]

  Scheme 6  Preparation of glycopolypeptide via "click" glycosylation with azide bearing polypeptide

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  图式 7  Deming等报道的糖基化-NCA单体的制备及聚合反应^[103]

  Scheme 7  Preparation and polymerization of glycol-NCAs by Deming et al.^[103]

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  图式 8  “一锅法”部分糖基化及其与烯丙基甘氨酸环内酸酐单体的共聚合反应^[104]

  Scheme 8  "One-pot" partial glycosylation and copolymerization of AGly NCA^[104]

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  图 4  糖基取代NCA单体的化学结构

  Figure 4  Chemical structures of sugar-substituted NCA monomers

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  图式 9  还原响应性糖聚肽类似物的制备及其生物识别特性及作为药物输送载体的应用^[109]

  Scheme 9  Schematic illustration of preparing redox-responsive glycopolypeptide analogues and their biological recognition and drug delivery applications

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  图 5  通过CuAAC点击反应合成树枝状糖聚肽类似物^[114]

  Figure 5  Synthesis of Oligosaccharide-based branched glycopolypeptide by CuAAC "Click" reaction

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  图式 10  通过原子转移自由基聚合(ATRP)、开环聚合和点击化学制备四臂星状糖聚合物-聚肽轭合物P(GlyEMA)-P(Lys)^[116]

  Scheme 10  Preparation of the four-arm star glycopolymer-polypeptide conjugates P(GlyEMA)-P(Lys) via controlled radical polymerization, ring-opening polymerization, and "Click"chemistry

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  表 1  用于制备各种糖聚肽的可点击聚氨基酸及相应糖基元

  Table 1.  Clickable polypeptides and corresponding saccharide units for the synthesis of glycopolypeptides

  Polypeptide	Saccharide unit

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