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• 碱性磷酸酶(ALP)是一种哺乳动物组织中的重要酶, 具有催化磷酸酯的水解和磷酸化功能^{[1, 2]}.作为医疗诊断的关键生物标记物, ALP主要存在于肝脏、肾脏、肠道、骨骼和胎盘中, 健康成人血清中ALP浓度大小范围为46~190 mU/mL^[2~4].已经证实血清中ALP水平的异常与各种病理过程密切相关, 例如心力衰竭、肾功能恶化、肝功能障碍、胆汁淤积、血管钙化、骨病和乳腺癌等疾病.尽管人们对ALP进行了密切地研究, 但关于ALP的复杂生理功能尚未完全了解.因此, 开发能够用于人类血清或血液中快速、简便、灵敏检测ALP活性的方法是当前研究的热点^[5].

  最近, 大量用于ALP活性及浓度的测定分析方法被报道, 包括比色法^[6]、表面增强拉曼散射法^[7]、电化学分析法^[8]和色谱分析法^[9]等.在这些检测方法中, 荧光检测技术因其固有的优势, 如高灵敏度、实时检测和原位成像的特点而被广泛关注^{[10, 11]}.另外, 值得引起科学家注意的是荧光检测方法可用于生物系统中活性物质的检测^{[12, 13]}.目前, ALP及其类似物的检测在生物医学方面的研究逐渐成为热点, 尤其是内源性ALP的检测、识别和近红外荧光成像检测等方面的研究, 为疾病的诊断和治疗提供有力依据.本文综述了近年来国内外对ALP荧光探针的研究现状, 并对未来研究发展趋势进行展望.

  1.   基于ESIPT和ICT的传感体系

  激发态分子内质子转移(Excited State Intramolecular Proton Transfer, ESIPT)是激发态分子内部邻近的质子给体(如羟基)转移到受体(如羰基), 导致互变异构体的荧光发射存在较大的斯托克斯位移. ESIPT是一种重要的荧光发光现象, 化合物自身能够通过分子内的氢键诱导荧光的转变, 其过程能够以较快的速度发生^[14].在水溶液中, ESIPT荧光分子具有低背景荧光信号的优势.与其它一些荧光发光过程相比较, 较大的斯托克斯位移的存在, 使得其分子能够减少激发光的干扰.基于ESIPT的ALP荧光检测体系, 在水溶液和生命体系中都可以运行.分子内电荷转移型(Intermolecular Charge Transfer, ICT)是与ESIPT同等重要的荧光发光机制, 调节ICT过程, 导致紫外吸收和荧光发射光谱的比率型信号出现^[15].比率型荧光探针采用两种荧光发射作为荧光输出信号.由于其结果不受自身荧光发射的干扰, 因此可以方便通过发射强度得到待测物质浓度.近年来, ICT发光机制被用于ALP荧光探针的设计中, 由此实现了ALP的比率型荧光检测.

  2015年, 吴水珠等^[16]利用ESIPT发光机制, 构建了一种能够检测ALP的荧光探针1 (Eq. 1).该探针是通过将磷酸盐官能团偶联到黄酮结构的荧光团而得到.其磷酸基团既可以是ESIPT的阻断剂, 又是ALP的响应基团.由于羟基被磷酸基团所屏蔽, 所以结构本身没有ESIPT过程发生.当ALP存在的情况下, ALP劈开了磷酸基团, 羟基官能团的产生导致基于ESIPT的荧光发射的形成.该探针对ALP表现出高的灵敏度, 其检测限为0.032 U/L.该探针能够应用于血清中ALP的检测.通过细胞试验研究发现, 探针能够被用于内源性ALP的荧光成像.因此, 该探针在生物诊断和病例分析中具有潜在应用价值.

  (1)

  唐本忠等^[17]设计合成了一种基于ESIPT和AIE发光过程的比率型荧光探针2 (Scheme 1), 用于活细胞中ALP活性检测和成像研究.其结构通过修饰的2-羟基查尔酮得到.该探针能溶于水, 并在缓冲溶液中发射出黄绿色荧光.在ALP存在的情况下, 由于酶切产物的形成和聚集诱导效应的发生, 探针的荧光发射呈比率型荧光响应, 探针体系逐渐由绿色变为深红色.整个过程中荧光的产生涉及激发态分子内质子转移和分子内的聚集诱导发射机理, 其对ALP的活性范围为0~150 mU/mL, 检测限为0.15 mU/mL, 与同类结构相比较, 该结构检测性能优良.该探针具有良好的生物相容性, 可用于活细胞ALP荧光成像研究.此外, 该探针的红色荧光发射还能抑制血清样品的自身荧光干扰, 并且还可用于细胞间隙液中ALP的检测和相应活细胞的可视化研究.该分子设计策略为利用天然产物构建具有高灵敏度和聚集态的比率型荧光探针提供了新的思路.

  图式 1

  

  图式 1.  探针2与ALP反应机理

  Scheme 1.  Mechanism of probe 2 reaction with ALP

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  Kim等^[18]基于调控的ESIPT过程, 设计合成了一种能够快速定量分析ALP活性的荧光基质3 (Eq. 2).其检测机理为荧光turn-on型ESIPT机制.在ALP存在的水溶液环境中, 荧光化合物表现显著的荧光发射信号.该探针对ALP具有极高的灵敏性, 其检测限为0.25 nmol• L^－1.不同寻常的是在ALP的荧光检测信号中出现了明显的斯托克斯位移.该化合物可以成功应用于实时检测碱性磷酸酶的活性.体外荧光试验研究结果将加快ALP抑制剂和催化剂的研发.此外, 该工作有助于理解ALP在生命体系中的作用.

  (2)

  接着该课题组^[18]设计合成了两种基于苯并噻唑结构的荧光探针4和5, 用于活细胞中ALP的活性监测(Scheme 2).由于探针结构内部键旋转, 进而使荧光探针4和5显示出微弱的荧光发射.在ALP存在下, 探针4和5被ALP催化引起P—O键的断裂, 随后酚氧基团对腈基官能团的分子内亲核进攻导致亚氨基香豆素-苯并噻唑的环化(4-a1), 这些环化产物不溶于水, 在激发光下产生强的荧光发射可用于ALP检测.该探针适用于实时动态监测活体系统内源性ALP活性, 并可开发ALP抑制剂和激活剂, 进一步扩大了ALP检测荧光分子工具箱, 有助于其在活体系统中的生物学和病理学的研究.

  图式 2

  

  图式 2.  探针4和5与ALP反应机理

  Scheme 2.  Reaction mechanism of probes 4 and 5 with ALP

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  韩克利等^[19]利用腺苷一磷酸(AMP)/单磷酸鸟苷(GMP)类似物的亲和性, 合成了一种基于苯并噻唑结构的ESIPT荧光探针6, 可以在水溶液和生物体内进行ALP的实时监测(Eq. 3).在该结构设计中, 将AMP和GMP引入到基于2-(2-羟基苯基)-苯并噻唑的探针中, 使得所合成探针具有高选择性、高亲和力和低毒性等特点.在水溶液中, 该探针无荧光发射, 当加入ALP后, 由于ALP的水解作用使磷酸二酯被水解, 产生强的荧光发射.然而, 在ALP抑制剂的存在下, 荧光发射强度明显下降.在整个识别过程中, AMP和GMP被证明是实现识别ALP酶所必需的物质.该探针适用于生物系统(如活细胞和斑马鱼模型)中内源性ALP活性的实时动态监测.

  范春蕾等^[20]设计合成了一种基于2-(苯并咪唑-2-酰基)苯基磷酸的ESIPT比色荧光探针7, 用于ALP荧光检测(Eq. 4).其检测原理为2-(2-羟基苯基)苯并咪唑(HPBI)的ESIPT过程, 通过羟基保护/脱保护反应进行调节. HPBI与POCl₃磷酸化后, 由于ESIPT过程被阻止, 其在363 nm处只有一个发射峰.然而, ALP在Tris-HCl缓冲液中发生选择性酶解, 探针7返回到HPBI结构, 开启ESIPT过程, 导致荧光强度在363 nm处减弱, 而在430 nm处的新的荧光峰左右升高.且430和360 nm处的荧光强度比值(I₄₃₀/I₃₆₀)随ALP活性的增加呈线性增加, 最高可达0.050 U/mL, 检出限为0.0013 U/mL.该探针结构简单且灵敏度高, 可用于复杂样品的ALP分析检测.

  (4)

  吴加胜等^[21]设计合成了一种基于分子内电荷转移(ICT)特性的比率型荧光探针8, 用于ALP的检测(Eq. 5).在ALP存在的条件下, 探针的荧光光谱中出现了从550到650 nm明显的红移现象, 并产生比率的荧光信号.其荧光光谱的改变归因于探针的磷酸盐官能团裂解和水解作用, 进而产生分子内的电荷转移.其荧光强度随浓度的变化在50~200 U/L的范围内呈线性关系, 且呈比率型变化, 而其他竞争性生物物种不会引起明显的荧光变化.该探针具有较低的细胞毒性以及对ALP高选择性, 可应用于活细胞中内生ALP荧光成像研究.

  (5)

  2.   基于聚集诱导发光的传感体系

  聚集诱导发光(aggregation-induced emission, AIE)机制自从2001年由唐本忠课题组^{[22, 23]}报道以来, 已被广泛应用于各种离子和小分子的传感检测.研究发现, AIE分子在稀溶液时没有荧光发射, 在聚集状态时产生强的荧光发射, 其具有与传统的有机小分子的聚集荧光淬灭(aggregationcaused quenching, ACQ)效应相反的特性.其发光机理是由于聚集体的形成导致分子内的转动被限制(restriction of intramolecular motions, RIM)^[23].基于AIE效应的生物荧光探针具有各种优势, 如低的荧光背景、高的信噪比和优异的抵抗光漂白性.在诸多被开发的AIE分子中, 四苯乙烯结构(tetraphenylethene, TPE)因其发光性能优良及容易修饰合成等优点作为ALP荧光传感器的信号报告基团.

  唐本忠等^[24]设计合成了一种基于TPE荧光团的聚集诱导发光荧光探针9, 其能够应用于ALP的检测和其酶活性的评价(Eq. 6).其检测机理是探针与ALP的特异性反应(即利用ALP对含磷酸官能团的TPE结构进行脱磷酸化作用, 使产物分子内的旋转被限制).该探针具有良好的水溶性, 在水溶液中几乎无荧光发射, 在ALP存在情况下, 通过酶水解作用使磷酸基团裂解, 产物发生AIE效应表现出强的荧光.在Tris缓冲溶液中, 该探针对ALP具有高灵敏性和选择性, 其检测限为11.4 pmol•L^－1或0.2 U/L, 在3~526 U/L范围内, 具有很好的线性关系.该探针被成功应用于血清中ALP的检测, 其线性范围为30~135 U/L.此外, 该探针被成功应用于血清中ALP的检测, 表明其具有检测实际样品中ALP水平的潜在可能.该研究工作提出的策略可以推广到构建其他酶的分子探针的设计中, 为其它荧光探针的开发提供新的思路.

  (6)

  张德清等^[25]报道了一种甲氧基修饰的基于TPE结构的AIE荧光化合物10, 用于ALP活性检测和抑制剂筛选试验, 此试验方法可以测定低至18 mU/mL的ALP浓度(Scheme 3).化合物10可用于在细胞环境中ALP检测, 化合物能够进入细胞, 且当ALP存在时, 产生绿色的荧光.其测定ALP的原理为荧光化合物在ALP存在下, 通过脱磷酸化作用水解成溶解度低和容易聚集的TPE衍生物结构.与其它报道的ALP测定方法相比, 该荧光检测体系具有试验可在纯水溶液中进行、响应时间较短、适用于细胞中ALP的测定及化合物易于制备等优点.因此, 该ALP检测方法具有较强的实用性.

  图式 3

  

  图式 3.  探针10与ALP反应机理

  Scheme 3.  Mechanism of probe 10 reaction with ALP

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  李新明等^[26]开发了一种TPE分子结合酪氨酸-磷酸盐的AIE荧光探针11 (Eq. 7).在该探针结构中, 硌氨酸-磷酸盐和TPE结合生成新的两亲分子, 由于分子结构中含有两个磷酸基团, 其在pH＝7.4的水溶液环境中表现出良好的溶解性.在ALP存在的条件下, 发生脱磷酸化反应产生强的荧光发射信号来检测ALP的活性.此外, 探针在pH＝2.5的水溶液中, 通过自组装形成新颖的超分子水凝胶, 其荧光发射强度受到pH变化的影响.另外, 两亲分子自组装形成高度有序的胶束纳米结构作为一种有效的模板促进成核现象和磷酸钙的生长.氨基酸和多肽是一类重要的生物活性物质, 其具有生物分子识别和超分子自组装的能力, 使得该探针在氨基酸和多肽方面具有广泛的应用前景.该研究结果表明用TPE和氨基酸结合形成的分子结构具有潜在的多功能性质, 包括酶活性测定, 细胞成像或药物传递等.

  (7)

  吴水珠等^[27]设计合成了一种基于TPE结构的荧光探针12, 用于ALP的检测及细胞成像(Scheme 4).该结构中, 强吸电子的氰基处于化合物结构的中间位置, 亲水性的磷酸基识别基团处于结构的末端位置.该供体-受体-受体(D-A-A)型结构与TPE结构相比较具有长的激发和发射波长, 同时, 增加共轭长度时保持良好的水溶性.在水溶液中, 探针对ALP具有较高的灵敏度.在ALP存在的条件下, 磷酸盐基团被水解, 结构TPE-CN-OH产生聚集诱导效应导致水溶性降低, 并产生绿色荧光, 从而实现ALP的检测.该探针具有良好的生物相容性, 能够成功应用于细胞成像研究.其设计方法为其他酶检测策略提供了新的思路.

  图式 4

  

  图式 4.  探针12与ALP反应机理

  Scheme 4.  Mechanism of probe 12 reaction with ALP

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  韩宝航等^[28]设计合成了一种基于AIE效应的新型阳离子水溶性TPE衍生物荧光探针13 (Scheme 5).该探针是将氨基葡萄糖盐酸盐嫁接到TPE结构上, 不仅可以提高其水溶性和生物相容性, 而且为其它人工或天然聚阴离子之间的静电相互作用提供了许多带正电荷氨基结合位点.利用聚集诱导增强发光特性的优势, 开发出了这种便捷的检测ALP的方法.该探针聚集络合物与十二烷基磷酸单酯能够产生turn-on的光致发光现象.当ALP存在时, 探针的荧光逐渐降低, 其原因为酶引发的探针与十二烷基磷酸单酯聚集被破坏.该研究在生物大分子的检测及相关抑制剂筛选方面具有广泛的应用前景.

  图式 5

  

  图式 5.  探针13与ALP反应机理

  Scheme 5.  Mechanism of probe 13 reaction with ALP

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  最近, 赵娜等^[29]利用邻羟苄基与ALP的反应设计了一种具有AIE效应的荧光探针14, 其对ALP表现出高灵敏性, 可以用于检测ALP和监测其酶活性(Scheme 6).探针结构由磷酸基团和四苯乙烯衍生物组成.其在水溶液中的表现出良好的溶解性, 显示出较弱的荧光发射.在ALP存在的情况下, 探针通过脱磷酸化作用释放出TPE水解产物, 使荧光发射显著增强.该探针对ALP的检测限低至0.0077 U/L, 溶液中线性范围为0~30 mU/mL.其在稀释的血清样品中具有优异的适用性, 能够在血清样品中高灵敏度地检测ALP及其活性, 证明了其在临床诊断和生物医学研究中的潜在应用价值.此外, 该探针能够应用于ALP活性测定和ALP抑制剂筛选方面的研究.

  图式 6

  

  图式 6.  探针14与ALP反应机理

  Scheme 6.  Mechanism of probe 14 reaction with ALP

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  3.   基于降低给电子能力(D d-E)或扰乱共轭π电子的传感体系(D π-C)

  由于近红外(NIR)荧光传感器具有长的激发和发射波长(波长大于650 nm), 因此有较深的组织穿透性.此外其具有低能量、弱自荧光背景干扰、良好的光稳定性和对生物样品低的损伤性等特点^[30].基于以上一些特点, 近红外荧光传感器极大地促进了体内生理过程的成像研究, 因此其在生物医学领域具有很大需求.其中, 半花菁结构是理想的近红外成像荧光团, 已被用作ALP传感体系中的信号报告基团.其检测机理主要是降低化合物的给电子能力(Diminish the electron donating ability, D d-E)或扰乱共轭π电子体系(Disruption of the π-Conjugated Systems, D-π C).然而, 该类ALP荧光传感体系的研究报道稀少.

  半花菁结构是传统的近红外荧光染料, 具有高的量子产率、光稳定性以及良好的活体成像性能等, 适合于近红外荧光传感器的构筑.孙红燕等^[31]利用ALP与磷酸酶反应的特点设计了一种ALP近红外荧光探针15, 用于检测体内体外ALP的活性(Eq. 8).其结构包含一个半花菁荧光团和一个磷酸酶反应位点.该探针对ALP表现出高灵敏性, 当ALP存在时, 其荧光发射增强66倍, 检测限为0.07 U/L, 低于大多数先前报道的ALP荧光探针.此外, 该探针具有高的反应活性、良好的水溶性、强组织穿透能力及弱背景干扰等优势, 特别是探针具有在长波长区域产生荧光发射的特性, 使其成为细胞及生物组织成像的理想候选者.进一步研究发现, 该探针能够应用于细胞和小鼠中ALP活性的检测, 具有良好的生物相容性和细胞内成像性能.该探针为生物组织中ALP活性的检测提供有效的方法.

  (8)

  与上述工作同时, 李春艳等^[32]设计了一种类似结构的苯并半花菁近红外荧光探针16, 用于检测内源性ALP的活性(Eq. 9).其荧光变化的机理是在ALP催化作用下, 使得探针结构中的磷酸基团被劈裂, 实现荧光信号从turn-off到turn-on的转变.其荧光发射峰在近红外区738 nm.该探针具有结构简单、易合成且在近红外区能发光等特点.其在738 nm产生近红外荧光发射, 适用于活体生物成像.该近红外探针在ALP的识别性能方面实现了显著提升, 并对ALP具有高的灵敏性, 探针检测限为0.003 U/mL.该研究工作实现了各种生物样本中内源性ALP活性的近红外荧光检测.

  (9)

  最近, 张鹏等^[33]报道了一种基于花菁骨架的比率型近红外ALP荧光探针17.在结构设计中, 作者将掩蔽剂引入到内消旋氧原子的花菁骨架, 用于调节花菁染料共轭π电子体系, 磷酸基团作为ALP水解催化的官能团(Eq. 10).这种具有高选择性和高灵敏性的比率型ALP荧光探针的设计策略通过光谱研究和生物成像研究得到了证明. ALP存在的情况下, 探针具有高的灵敏性和选择性、响应时间短和低荧光背景的特点, 其最低检测限为0.16 mU•mL^－1.该探针可以成功应用于生物细胞中ALP的检测, 并具有高的光响应活性.该研究结果对探索生物体系中ALP的生理功能具有较大潜在应用价值.

  (10)

  王兴华等^[34]开发了一种能够在生物器官中监测ALP的近红外荧光探针18.该荧光分子具有长的发射波长, 且对ALP具有高灵敏性和高选择性(Eq. 11).在ALP存在的情况下, 探针在723 nm发射波长处表现出56倍的荧光信号增强, 其检测限为0.042 U•L^－1.该探针被成功应用于不同类型细胞内生和外生的ALP水平的测定.该研究结果确定该探针在肝脏和骨骼的临床诊断中具有潜在的应用价值.

  于法标等^[35]设计合成了一种基于对称半花菁结构的近红外荧光探针19, 用于检测不同细胞系和小鼠肿瘤模型中ALP的水平(Scheme 7).在该探针结构中, 七甲川花青素结构作为荧光调节器, 磷酸盐单酯作为ALP酶催化响应部分.其荧光检测机理为π电子共轭体系, 通过ALP催化磷酸盐单酯基团裂解引发off-on荧光转变.该探针对ALP表现出高的选择性和较好的灵敏度, 不但可以识别不同细胞系中ALP水平, 而且可以区分小鼠肝肿瘤模型和正常小鼠体内ALP水平的变化.在不存在其他酶、离子和蛋白相互作用的情况下, 对ALP有较好的选择性和敏感性.该探针分子为揭示ALP在生理和病理过程中的作用提供了可能, 具有潜在的实用性.

  图式 7

  

  图式 7.  探针19与ALP反应机理

  Scheme 7.  Mechanism of probe 19 reaction with ALP

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  (11)

  4.   基于荧光内滤效应(IFE)的传感体系

  功能纳米材料因可以混合多种成分, 表现出优异的光学、电学、磁性和生物活性等性能, 如今成为新材料研究领域的热点课题^[36].到目前为止, 纳米材料在大小、形状及可控合成方面已经得到很好的发展.研究发现, 纳米材料的尺寸和形状相关性质在高性能传感器的制备中尤为重要.此外, 纳米材料通常具有高的表面能量和相对体积比例, 从而可以捕获更多的标记目标且具有较高灵敏度.其中, 量子点材料和金属纳米粒子已作为ALP传感体系中的载体或信号报告基团.荧光内滤效应(IFE)是由于荧光物质的吸收光谱与激发或发射光谱重叠时, 导致检测系统吸收激发光或发射光的现象. IFE效应通过将分析吸收信号转换为荧光信号, 如今已经成为设计和开发新型传感器的一种有效策略.

  吴永宁等^[37]设计合成了一种基于IFE效应的探针20, 用于ALP的检测(Scheme 8).在合成过程中, 采用一锅合成法以高达49%的量子产率制备了N-掺杂碳量子点(CDs), 并将其作为IFE的荧光团.利用对硝基苯磷酸盐(PNPP)作为ALP底物, 其酶催化产物(对硝基苯酚)具有强大的吸附作用, 影响荧光团(CDs)的激发.在ALP存在的条件下, PNPP被转化对硝基苯酚, 诱导吸收带从310 nm过渡到405 nm, 导致对硝基苯酚的吸收与CDs的激发互补重叠.由于竞争性吸收的存在, CDs的荧光激发明显减弱, 最终导致CDs的荧光淬灭.该探针在0.01~20 U/L范围内有良好的线性关系(R²＝0.996), 检测限为0.001 U/L(信噪比为3).该方法可用于血清中ALP的检测和细胞成像研究.该研究结果提出的基于IFE的CDs荧光传感策略, 由于不需要受体与荧光团之间的结构修饰或连接, 为酶活性检测的荧光探针的发展提供了新的思路.

  图式 8

  

  图式 8.  探针20与ALP反应机理

  Scheme 8.  Mechanism of probe 20 reaction with ALP

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  最近, 何治柯等^[38]采用简单有效的方法开发了基于对硝基苯酚CdTe/CdS的荧光量子点ALP荧光探针21, 其具有明显的IFE效应(Scheme 9).在探针CdTe/CdS QDs的制备过程中, 采用Na₂TeO₃为Te源, 以二巯基化合物为S源和表面配体.该荧光探针具有良好的荧光性能、高量子产率(80%)以及化学/光稳定性.基于对硝基苯酚磷酸盐在ALP催化作用下的能够水解的特点, 可以有效地淬灭量子点的荧光.因此, 可以用于ALP的检测, 其在2.2~220 U/L的浓度范围内具有良好的线性关系, 检出限低至0.34 U/L.该方法成功应用于人血清中ALP的化验.由于QDs具有宽的吸收, CdTe/CdS QDs可以广泛应用于IFE化学或生物传感器中.

  图式 9

  

  图式 9.  探针21与ALP反应机理

  Scheme 9.  Mechanism of probe 21 reaction with ALP

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  任雪琴等^[39]设计合成了一种基于对硝基苯基磷酸盐(PNPP)的金纳米团簇(AuNCs)IFE传感器22, 其可以用于检测ALP (Scheme 10).采用一锅法合成, 其量子产率为12%, 可以直接作为荧光材料应用.当AuNCs与PNPP混合时, 由于PNPP的吸收光谱与AuNCs的激发光谱有重叠, 使得AuNCs的荧光内滤效应减弱进而发生明显荧光淬灭.而在ALP存在下, PNPP被催化水解成对硝基苯酚, 从而使AuNCs荧光得到恢复.这种新型的turn-on ALP荧光探针, 其检测限可低至0.002 U/L(信噪比为3).并且具有高灵敏度、高选择性、低背景信号及高信号输出等优点.此外, 该探针被成功应用于血清ALP抑制剂的检测和血清ALP的测定.在0.02~50 U/L范围内有良好的线性关系.这种非常简单的制备传感器方法将促进纳米化学和生物探针的发展.

  图式 10

  

  图式 10.  探针22与ALP反应机理

  Scheme 10.  Mechanism of probe 22 reaction with ALP

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  5.   其它类型的传感体系

  梁高林等^[40]利用溶胶-凝胶转变与荧光淬灭过程, 制备了一种定量检测体外和活细胞中ALP活性的荧光探针23 (Eq. 12).在ALP催化作用下, 探针自组装成纳米纤维, 进一步形成凝胶.伴随该溶胶-凝胶转变过程, 探针荧光发生淬灭.该检测方法能够检测0~2.8 U/mL范围内的ALP活性, 检测限(LOD)为0.06 U/mL.此外, 通过ALP抑制剂处理的细胞成像试验研究发现, 探针能够在细胞中检测ALP活性.该方法可用于实时和定量检测体外甚至活细胞中的ALP活性, 为ALP活性的实时与定量检测提供了一种新的方法.

  最近, 孔金明等^[41]设计合成了一种基于电荷转移诱导荧光淬灭的ALP活性荧光探针24, 该探针核心结构为铜配合物Cu(BCDS)₂ ^2－ (Scheme 11).在ALP存在下, 底物抗坏血酸2-磷酸水解释放出坏血酸(AA).随后, 在AA介质中存在的Cu(BCDS)₂^2-被还原, 在402 nm波长处呈现出强烈的光致发光带, 导致探针的荧光由于电荷的转移而被静态淬灭, 通过理论计算验证了荧光淬灭的机理.该探针具有较大的斯托克斯位移(86 nm), 对光漂白具有很强的免疫能力.该方法的优势在于不需要复杂的探针设计即可以实现ALP活性的实时检测.

  (12)

  图式 11

  

  图式 11.  探针24与ALP反应机理

  Scheme 11.  Mechanism of probe 24 reaction with ALP

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  李新明等^[42]设计合成了一种基于磷酸盐和对羟基苯衍生物反应的荧光探针25 (Scheme 12).该探针由磷酸基团、对羟基苯衍生物以及荧光基团组成.在ALP存在的条件下, 探针上的磷酸部分在ALP催化下发生脱磷酸化反应, 通过1, 6-消除反应对羟基苯衍生物发生自分解反应并释放适量的试卤灵(9-羟基-3-异吩噁嗪酮), 导致溶液由橙色变为紫色, 在585 nm激发光照射下产生强荧光发射, 与分析物相互作用后, 可通过肉眼观察到颜色的改变并容易通过荧光光谱检测.另一方面, 磷酸盐部分与试卤灵之间的自组装连接可以降低空间位阻, 提高探针对ALP的脱磷酸化反应.二甲醌残留物可以通过大多数介质(如H₂O)或细胞内靠近反应位点的其它亲核试剂淬灭.该探针可以通过裸眼和荧光检测的手段对溶液中ALP实现快速、灵敏的检测, 检测限可低至1.09 U/L, 并且具有良好的生物相容性以及实时监测活细胞内源性磷酸酶活性的潜力.

  图式 12

  

  图式 12.  探针25与ALP反应机理

  Scheme 12.  Mechanism of probe 25 reaction with ALP

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  于聪等^[43]利用季铵阳离子合成了一种基于苝四甲酸二酐结构的荧光探针26, 其可以用于实时检测ALP的活性以及抑制剂的筛选(Scheme 13).当溶液体系中存在三磷酸腺苷(ATP)时, 探针荧光被淬灭.在ALP存在的条件下, ATP或探针复合物被解离, 探针荧光发射被恢复, 而当加入ALP抑制剂后荧光发射下降.该探针基于荧光turn-on模式, 可大大降低与荧光“淬灭”检测相关的假阳性信号的干扰.其次, 该检测体系为快速、灵敏地检测ALP活性和抑制剂筛选提供了一种方便的“mix-and-detect”方法.利用普通分光光度计可以实时监测荧光强度的变化.此外, 该探针易于制备, 且底物ATP具有商业可利用性, 具有较高的经济效益.

  图式 13

  

  图式 13.  探针26与ALP反应机理

  Scheme 13.  Mechanism of probe 26 reaction with ALP

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  曾钫等^[44]采用类似识别官能团, 合成了一种比率型荧光探针27, 用于追踪ALP在体内的变化情况(Eq. 13).该探针结构包含一个磷酸基团和一个胺-N-氧化物基团取代的1, 8-萘酰亚胺衍生物.在ALP存在条件下, 1, 8-萘酰亚胺衍生物中的磷酸基团被裂解, 导致探针的荧光光谱发生显著改变, 从而实现对ALP的荧光检测.胺-N-氧化物基团的掺入使探针具有良好的水溶性和生物相容性, 在水介质中实现对ALP的比率检测.该探针检测限为0.38 U/L, 可以应用于人血清ALP的检测.此外, 该探针还可应用于斑马鱼中ALP水平的内源性变化监测和空间定位监测.

  最近, Maitra等^[45]报道了一种基于稀土Eu(III)金属离子和胆酸盐水凝胶的ALP荧光探针28 (Scheme 14), 其结构设计中将1-羟基芘的促敏剂加入到胆酸盐水凝胶中.在ALP的作用下, 人工合成的底物凝胶释放自由敏化剂, 导致荧光开启, 使其发出红色或洋红色的荧光.

  图式 14

  

  图式 14.  探针28与ALP反应机理

  Scheme 14.  Mechanism of probe 28 reaction with ALP

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  (13)

  通过HPLC分析表明, 在酶催化作用下促敏剂水解导致敏化剂的释放, 从而使胆酸盐水凝胶中的Eu(III)敏化.该凝胶法的测定在纸上完成, 使其具有制作简单、成本低和使用方便等优点.通过试验证实凝胶分析技术可用于抑制剂筛选, 该方法有望在临床上得到应用.

  6.   总结与展望

  经过科研工作者的不断努力, ALP荧光探针得到了初步发展.主要综述了ALP荧光探针的设计合成、检测以及生物应用方面的研究进展, 分别从ESIPT/ICT、AIE、降低给电子能力/扰乱共轭π电子体系和荧光内滤效应等发光机制方面综述.重点介绍了ALP的设计合成以及简单高效的传感检测方法.目前, 常见的有机小分子ALP荧光探针主要依据脱磷酸基团设计, 采用发射波长不同的发光基团.对其修饰得到不同荧光发射和生物性能的荧光探针.结构简单、操作方便和检测性能优异的ALP荧光探针是人们所期待的.但到目前为止, 大多数有机小分子荧光探针仍然存在合成繁琐、水溶性差和光稳定性不佳等问题.纳米材料因良好的生物兼容性, 适用于开发ALP荧光探针, 尤其是作为药物载体在临床上具有很大的应用前景.在ALP荧光传感器的生物应用方面, 尽管ALP荧光探针在细胞成像、抑制剂筛选以及实时监测方面取得了不错的研究成果, 但现阶段哺乳动物体内ALP的检测仅局限于人类血液和血清以及小鼠体内.在未来的一段时间里, 对于ALP荧光检测, 仍然是化学和生物科研工作者研究的热点.随着人们对高选择性, 高灵敏性ALP荧光探针的不断追求, 在不久的将来ALP荧光传感器必将会应用于人类疾病的诊断及治疗.

  
  
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  图式 1  探针2与ALP反应机理

  Scheme 1  Mechanism of probe 2 reaction with ALP

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  图式 2  探针4和5与ALP反应机理

  Scheme 2  Reaction mechanism of probes 4 and 5 with ALP

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  图式 3  探针10与ALP反应机理

  Scheme 3  Mechanism of probe 10 reaction with ALP

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  图式 4  探针12与ALP反应机理

  Scheme 4  Mechanism of probe 12 reaction with ALP

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  图式 5  探针13与ALP反应机理

  Scheme 5  Mechanism of probe 13 reaction with ALP

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  图式 6  探针14与ALP反应机理

  Scheme 6  Mechanism of probe 14 reaction with ALP

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  图式 7  探针19与ALP反应机理

  Scheme 7  Mechanism of probe 19 reaction with ALP

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  图式 8  探针20与ALP反应机理

  Scheme 8  Mechanism of probe 20 reaction with ALP

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  图式 9  探针21与ALP反应机理

  Scheme 9  Mechanism of probe 21 reaction with ALP

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  图式 10  探针22与ALP反应机理

  Scheme 10  Mechanism of probe 22 reaction with ALP

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  图式 11  探针24与ALP反应机理

  Scheme 11  Mechanism of probe 24 reaction with ALP

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  图式 12  探针25与ALP反应机理

  Scheme 12  Mechanism of probe 25 reaction with ALP

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  图式 13  探针26与ALP反应机理

  Scheme 13  Mechanism of probe 26 reaction with ALP

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  图式 14  探针28与ALP反应机理

  Scheme 14  Mechanism of probe 28 reaction with ALP

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