English

• 青蒿素(Artemisinin)是我国学者发现的一种含有内酯环和过氧键的倍半萜类新型抗疟药物^[1].研究表明^[2], 青蒿素的抗疟作用与疟原虫宿主红细胞中的血红素息息相关.在血红素催化作用下, 青蒿素过氧桥断裂, 形成活性中间体.这些中间体与疟原虫蛋白络合, 发生烷基化作用, 从而杀伤疟原虫.多年来, 研究人员以青蒿素的10-位的酮羰基进行结构衍生合成出了多种药物, 如双氢青蒿素、蒿甲醚及青蒿琥酯等^[3].这些第一代药物具有良好疟疾治疗效果, 然而也存在不足:分子中缩醛内酯键抗水解稳定性差, 口服给药生物利用度低; 此外, 东南亚地区近年来出现对第一代青蒿素药物耐药病例.因此开发新型青蒿素药物极为迫切^[4].基于此, 人们尝试对青蒿素其它位点进行衍生, 如Singh等^[5]对11位点进行修饰, 合成多种含N-腙键的11-氮杂青蒿素衍生物, 对多药耐药性约氏疟原虫感染的小鼠展现出了良好体内抗疟疾活性.此外, 该系列分子合成较为简单, 具有良好成药前景, 然而腙键在酸性条件下易水解性, 药物半衰期短, 血浆清除率高等不足是成药性研究中不得不面对的问题.

  与腙键相比, 水杨醛腙键因其C=N键可与邻位OH形成分子内氢键, 稳定性得以极大提高.另外, 孪药(Twin drugs, 由两种相(不)同的药物经价键连接后而成的新化合物)的设计思路也可以用来提高药物稳定性和疗效^[6].基于以上两点, 本文合成了含N-水杨醛腙键的11-氮杂青蒿素及其二聚体孪药, 研究了它们与血红素靶点的识别及结合能力.针对二聚体孪药水溶性差等缺点, 研究了杯[4]咔唑^[7]对其增溶性能.这些分子水平的研究为这类新型青蒿素衍生物的活性测试奠定了基础.

  1.   结果与讨论

  1.1   化合物的合成及构型分析

  含水杨醛腙键的青蒿素及其去氧衍生物的合成路线如Scheme 1所示.首先, 参照文献[5]的方法合成了中间体a和b, 然后合成目标化合物1~4.工艺条件为:以苯为溶剂, Amberlyst-15为催化剂, 室温下反应4 h.加入二氯甲烷后离心, 取上清液, 减压旋转蒸发除去溶剂, 最后采用硅胶柱进行分离得到.其中, 化合物3和4的收率较低(分别为12%和13%), 推测可能的原因是由于这两个二聚体化合物溶解度差, 二氯甲烷不能良好溶解, 造成损失.化合物1~4的结构均通过¹H NMR、¹³C NMR和HRMS表征确认.

  图式 1

  

  图式 1.  化合物1~4合成路线

  Scheme 1.  Synthetic routes of the target compounds 1~4

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  众所周知, 席夫碱类化合物存在顺反异构体.本文研究了含水杨醛腙键的青蒿素二聚体3的分子构型, 其可能的构型列于图 1中. 3的局部¹H NMR谱图(图 2a)表明, 该分子具有C₂对称性, 因此排除了构型A.其二维NOESY谱图(局部谱见图 2b)表明: H_a和H_b存在明显的NOE相关信号, 因此可排除构型B的可能性.所以, c是化合物3的可能构型:即水杨醛腙键的OH与席夫碱N原子之间形成分子内氢键.采用Spatan'14分子软件的半经验力场PM₃水平进行结构优化, 优化后3的最低能量构像也表明(图 3):水杨醛腙键中的OH与席夫碱N原子之间形成了分子内的氢键.这一分子模拟结果与核磁结果吻合.除此之外, 从该图还可以看出, 3呈现出一种类似于分子钳的构像, 这促使我们进一步研究了该分子对血红素的结合性能.

  图 1

  

  图 1.  化合物3的可能构型

  Figure 1.  Possible configuration of 3S

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  图 2

  

  图 2.  化合物3局部¹H NMR谱图(a)及其NOESY的部分放大谱图(b)

  Figure 2.  Partial ¹H NMR (a) and partial NOESY (b) of 3

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  图 3

  

  图 3.  优化的化合物3能量最低构象

  Figure 3.  Optimized conformation of 3 with the lowest energy

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  1.2   青蒿素衍生物与血红素的分子识别研究

  紫外吸收光谱是研究主客体相互作用一种廉价、便捷的常见测试方法.一般说来, 主客体相互作用结果往往会使吸收谱带的强度发生改变, 同时伴随有红移或蓝移现象的发生.主客体发生有规律的结合时, 紫外吸收图谱上会出现“等吸收点”(又称等消光点).因此, 通过紫外吸收光谱可以推测主客体结合模式、比例以及强度等相关信息.本文首先利用紫外滴定法研究3与血红素(图 4)之间的相互作用(图 5).结果表明, 滴加3对血红素的紫外光谱产生了影响: 390 nm处的吸收峰发生减色红移, 405 nm处出现明显等消光点, 表明3与血红素存在特异性结合模式.采用1:1模型对这一变化进行拟合, 相关系数为0.97, 证明该模型的有效性. JOB曲线也证实了两者的1:1结合模式(图S14).根据拟合结果, 求出两者结合常数为K_a=1.02×10⁵ L•mol^-1.

  图 4

  

  图 4.  血红素分子结构

  Figure 4.  Molecular structure of hemin

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  图 5

  

  图 5.  血红素(10 µmol/L)与3的紫外滴定图谱(a)及拟合曲线(b)

  Figure 5.  UV-vis spectra (a) and the fitted curve (b) of hemin (10 µmol/L) upon addition of 3

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  为深入研究3与血红素的结合模式, 我们尝试了血红素与1, 2, 4的结合实验, 以作为对照.然而, 去氧青蒿素在水中溶解度要比青蒿素差很多, 在上述溶剂环境中, 2和4都不能溶解, 因此无法测定与血红素的紫外滴定. 图 6记录了血红素与1的紫外滴定谱图:血红素在390 nm处的紫吸收峰先下降后上升, 没有出现等消光点, 表明1虽与血红素有所作用, 但并没有特异性的结合模式.这一结果反证了3与血红素特异性结合可能是由于其自身钳形构像^[8], 钳住了血红素所引起的(图 7).

  图 6

  

  图 6.  血红素(10 µmol/L)与1的紫外滴定图谱

  Figure 6.  UV-vis spectra of hemin upon addition of 1

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  图 7

  

  图 7.  MMFF力场优化的血红素与3的结合模式示意图

  Figure 7.  Optimized binding pattern of hemin with 3

  (a) Front view, (b) side view

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  由于血红素和3在当前环境下无荧光, 因此无法采用荧光光谱法进一步研究两者的相互作用.核磁共振虽然也是研究分子相互作用的常见技术, 然而核磁检测通常需要较高浓度的化合物(毫摩尔级别), 3在这一浓度下的水溶性极差, 这也限制了该方法的使用.另外, 难溶性也将影响到3的生物活性及成药性.改进的方法有两种, 一是对3进一步结构衍生, 引入水溶性官能团, 但这需要繁琐的合成与分离工作; 另外一种方法是采用分子载体对其进行增溶.我们课题组在后一种方法具有一定经验^[7b], 因此尝试此方案解决其水溶性问题.

  1.3   杯[4]咔唑对化合物3的识别及增溶作用

  杯[n]咔唑是我们课题组^[7]报道的一类新型大环分子.其中, 杯[4]咔唑的疏水空腔可以封装、包载药物, 改善药物的水溶性(图 8).因此本文研究了杯[4]咔唑对3的识别及增溶作用. 图 9记录了两者相互作用的紫外光谱. 图 9a表明:当[3]/[杯咔唑]＜1.0时, 杯[4]咔唑310 nm处的吸收峰呈现减色红移现象, 303 nm处出现一组等消光点, 表明两者之间的特异性结合作用; 然而当[3]/[杯咔唑]＞1.0, 3自身290 nm处的吸收峰开始干扰310 nm处吸收峰的走向(图 9b).这种情况下, 很难采用紫外滴定方式求出两者之间的结合能.随后采用荧光光谱进行了测试.荧光滴定实验(图 10a)结果表明, 随着3的不断加入, 杯咔唑的的荧光不断降低.采用1:1模型对结果进行了拟合(图 10b), R²数值为0.99, 表明模型有效.两者1:1结合模式也被JOB曲线所验证, 求出结合常数为K_a=2.8×10⁵ L•mol^-1.

  图 8

  

  图 8.  杯[4]咔唑结构示意图

  Figure 8.  Structure of calix[4]carbazole

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  图 9

  

  图 9.  杯[4]咔唑与3的紫外滴定谱图

  Figure 9.  UV-vis spectra of calix[4]carbazole upon addition of 3

  (a) [3]/[calixcarbazole] < 1.0, (b) [3]/[calixcarbazole] > 1.0

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  图 10

  

  图 10.  杯咔唑与3的荧光滴定谱图(a)及拟合曲线(b)

  Figure 10.  Fluorescence spectra of calix[4]carbazole upon addition of 3 (a) and the fitted curve (b)

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  比较了3及其与杯咔唑复合物水溶性的差异, 发现杯咔唑的强结合作用可显著改善3的水中溶解度.如图 11所示, 当没有杯咔唑存在时(图 11, 右侧管), 3自身的溶解性能差, 有大量的固体析出.作为对比, 当加入1.5倍量杯咔唑(图 11, 左侧管)时, 此时观测不到明显的沉淀, 证明3的溶解性得到极大的改善.这一增溶能力为今后研究这些青蒿素衍生物的生物活性奠定了基础.

  图 11

  

  图 11.  杯咔唑对3的增溶示意图(图左:杯咔唑与3复合物; 图右: 3自身)

  Figure 11.  Enhanced solubility of 3 by calix[4]carbazole (left: calix[4]carbazole/3 complexes; right: 3 alone)

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  2.   结论

  设计、合成了含有N-水杨醛酰腙键的新型青蒿素及其去氧类生物; 研究了3的分子构型及其与血红素以及杯[4]咔唑的结合性能.结果表明: 3可形成分子钳构像结合血红素.此外, 杯[4]咔唑能够识别和结合3, 并增进其水溶性, 表明其可作为分子载体, 为今后深入研究青蒿素二聚体的生物活性奠定了基础.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  Bruker AVIII 600 MHz核磁共振仪, Bruker micro TOF_Q质谱仪, Tu-1810紫外-可见分光光度计, RF5301荧光分光光度计, H型硅胶层析柱(200~300目).所用试剂均为国产分析纯, 使用前未经处理.

  3.2   合成方法

  3.2.1   (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR)-11-(((E)-2-羟基- 5-(4-羟基-3-((E)-(((3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12R, 12aR)-3, 6, 9-三甲基-10-氧代十氢-3, 12-环氧[1, 2]二氧杂[4, 3-i]异喹啉-11(12H)-基)亚氨基)甲基)苄基)亚苄基)氨基)-3, 6, 9-三甲基十氢-3, 12-环氧[1, 2]二氧杂[4, 3-i]异喹啉- 10(3H)-酮(1)的合成

  将290 mg (0.98 mmol)氮杂青蒿素(中间体a)加入到3 mL苯中溶解, 再加入300 mg (2.45 mmol)水杨醛和30 mg Amberlyst-15, 搅拌, 室温反应4 h, 反应结束后向反应液中加入10 mL二氯甲烷, 震荡离心, 取上清液, 减压旋转蒸发, 除去溶剂, 硅胶柱分离(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯, V/V=15/1), 得到298 mg产品, 收率为76%. $[\alpha ]_{\rm{D}}^{25}$-31.1 (c 0.11, CHCl₃), m.p. 52.0~54.3 ℃; ¹H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ: 11.29 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.30 (dt, J=27.2, 5.7 Hz, 2H), 6.99 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.91 (t, J=7.4 Hz, 1H), 5.67 (s, 1H), 3.55 (p, J=7.0 Hz, 1H), 2.44 (t, J=12.3 Hz, 1H), 2.03 (d, J=10.2 Hz, 2H), 1.85 (d, J=11.9 Hz, 1H), 1.82~1.71 (m, 2H), 1.60~1.48 (m, 2H), 1.42 (td, J=11.3, 6.3 Hz, 1H), 1.34 (s, 3H), 1.20 (d, J=7.1 Hz, 3H), 1.11~0.99 (m, 5H); ¹³C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ: 169.6, 162.5, 159.4, 132.2, 131.9, 119.1, 117.8, 117.2, 105.2, 81.1, 80.8, 51.4, 46.1, 37.5, 36.5, 34.3, 33.6, 25.4, 25.0, 22.9, 19.7, 12.5. HRMS (ESI/TOF-Q) calcd for C₂₂H₂₉N₂O₅ [M+H]⁺ 401.2076, found 401.2072.

  3.2.2   (2S, 4aS, 4a1R, 5R, 7aS, 8R, 10aR)-10-(((E)-2-羟基苯亚甲基)氨基)-2, 5, 8-三甲基十氢-2, 4a1-环氧杂[4, 3, 2-ij]异喹啉-9(2H)-酮(2)的合成

  将280 mg (1.00 mmol)氮杂去氧青蒿素(中间体b)加入到3 mL苯中溶解, 再加入300 mg (2.45 mmol)水杨醛和30 mg Amberlyst-15, 搅拌, 室温反应4 h, 反应结束后向反应液中加入10 mL二氯甲烷, 震荡离心, 取上清液, 减压旋转蒸发, 除去溶剂, 硅胶柱分离(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯, V/V=15/1), 得190 mg产品, 收率为49%. $[\alpha ]_{\rm{D}}^{25}$+27.8 (c 0.10, CHCl₃), m.p. 53.0~55.1 ℃; ¹H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ: 8.50 (s, 1H), 7.29 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.00 (d, J=8.2 Hz, 1H), 6.91~6.85 (m, 1H), 5.44 (s, 1H), 3.32~3.28 (m, 1H), 2.06 (dt, J=13.3, 4.3 Hz, 1H), 2.01~1.96 (m, 1H), 1.91~1.87 (m, 1H), 1.80~1.85 (m, 1H), 1.78~1.67 (m, 2H), 1.47 (s, 3H), 1.40~1.33 (m, 2H), 1.23 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.14~1.07 (m, 1H), 0.96~0.90 (m, 5H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 168.3, 158.9, 151.3, 131.5, 131.3, 118.8, 118.0, 117.3, 108.6, 85.1, 83.1, 45.9, 42.7, 35.2, 34.5, 33.9, 33.3, 24.2, 23.0, 22.2, 18.4, 12.2; HRMS (ESI/TOF-Q) calcd for C₂₂H₂₉N₂O₄ [M+H]⁺ 385.2127, found 385.2130.

  3.2.3   (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR)-11-(((E)-2-羟基- 5-(4-羟基-3-((E)-(((3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12R, 12aR)-3, 6, 9-三甲基-10-氧十氢-3, 12-环氧[1, 2]二氧杂[4, 3-i]异喹啉-11(12H)-基)亚氨基)甲基)苄基)亚苄基)氨基)-3, 6, 9-三甲基十氢-3, 12-环氧[1, 2]二氧杂[4, 3-i]异喹啉- 10(3H)-酮(3)的合成

  将1.20 g (4.04 mmol)氮杂青蒿素(中间体a)加入到3 mL苯中溶解, 再加入260 mg 5, 5'-亚甲基二(2-羟基苯甲醛) (1.01 mmol)和30 mg Amberlyst-15, 搅拌, 室温反应4 h.反应结束后向反应液中加入10 mL二氯甲烷, 震荡离心, 取上清液, 减压旋转蒸发, 除去溶剂, 硅胶柱分离(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯, V/V=10/1), 得95 mg产品, 收率12%. $[\alpha ]_{\rm{D}}^{25}$-32.0 (c 0.09, CHCl₃), m.p. 42.2~44.3 ℃; ¹H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ: 8.68 (s, 1H), 7.13 (dd, J=8.4, 2.2 Hz, 1H), 7.05 (d, J=2.2 Hz, 1H), 6.92 (d, J=8.4 Hz, 1H), 5.67 (s, 1H), 3.86 (s, 1H), 3.54 (qd, J=7.2, 4.5 Hz, 1H), 2.46~2.41 (m, 1H), 2.05~ 2.00 (m, 2H), 1.83 (dt, J=13.3, 3.5 Hz, 1H), 1.78~1.73 (m, 2H), 1.57~1.50 (m, 2H), 1.44~1.40 (m, 1H), 1.33 (s, 3H), 1.19 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.08~0.98 (m, 5H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 169.4, 161.2, 157.6, 132.7, 131.7, 117.6, 117.2, 105.1, 80.8, 80.7, 51.3, 45.9, 39.7, 37.3, 36.4, 34.1, 33.5, 29.6, 25.3, 24.9, 22.7, 19.6, 12.3; HRMS (ESI/TOF-Q) calcd for C₄₆H₅₇N₄O₁₂ [M+COOH]^- 857.3973, found 857.3991.

  3.2.4   (2S, 4aS, 4a1R, 5R, 7aS, 8R, 10aR)-10-(((E)-2-羟基- 5-(4-羟基-3-((E)-(((2R, 4aS, 4a1S, 5R, 7aS, 8R, 10aS)-2, 5, 8-三甲基-9-氧代十氢-2, 4a1-环氧杂[4, 3, 2-ij]异喹啉- 10(10aH)-基)亚氨基)甲基)苄基)亚苄基)氨基)-2, 5, 8-三甲基十氢-2, 4a1-环氧杂[4, 3, 2-ij]异喹啉-9(2H)-酮(4)的合成

  将1.13 g (4.04 mmol)氮杂去氧青蒿素(中间体b)加入到3 mL苯中溶解, 再加入260 mg 5, 5'-亚甲基二(2-羟基苯甲醛) (1.01 mmol)和30 mg Amberlyst-15, 搅拌, 室温反应4 h, 反应结束后向反应液中加入10 mL二氯甲烷, 震荡离心, 取上清液, 减压旋转蒸发, 除去溶剂, 硅胶柱分离(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯, V/V=10/1), 得105 mg产品, 收率为13%. $[\alpha ]_{\rm{D}}^{25}$+25.5 (c 0.09, CHCl₃), m.p. 44.3~46.0 ℃; ¹H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ: 8.40 (s, 1H), 7.12 (d, J=10.6 Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.95 (d, J=8.4 Hz, 1H), 5.42 (s, 1H), 3.86 (s, 1H), 3.31~3.27 (m, 1H), 2.07~2.03 (m, 1H), 1.99~1.95 (m, 1H), 1.90~1.87 (m, 1H), 1.83 (dd, J=13.9, 5.1 Hz, 1H), 1.75 (dd, J=13.4, 3.4 Hz, 1H), 1.72~1.67 (m, 1H), 1.46 (s, 3H), 1.38~1.32 (m, 2H), 1.23 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.13~1.06 (m, 1H), 0.96~0.90 (m, 5H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 168.3, 157.3, 150.6, 132.2, 131.6, 131.3, 117.9, 117.3, 108.6, 84.8, 83.2, 45.9, 42.7, 39.7, 35.2, 34.5, 33.9, 33.3, 24.1, 23.0, 22.2, 18.4, 12.2; HRMS (ESI/TOF-Q) calcd for C₄₅H₅₇N₄O₈ [M+H]⁺ 781.4176, found 781.4136.

  3.3   荧光及紫外测试方法

  光谱测试环境均为: 10 mmol/L PBS缓冲溶液, pH=7.35, 体系中含有5%二甲基亚砜(DMSO)以使化合物完全溶解.

  辅助材料(Supporting Information)化合物1~4的¹H NMR、¹³C NMR和HRMS等谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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     (a) Yang, Z.-Z.; Chen, Y.; Li, G.; Tian, Z.; Zhao, L.; Wu, X.; Ma, Q.; Liu, M.-Z.; Yang, P. Chem.-Eur. J. 2018, 24, 6087.
     (b) Zhao, L.; Kang, L.; Chen, Y.; Li, G.; Wang, L.; Hu, C.; Yang, P. Spectrochim. Acta, Part A 2018, 193, 276.
     (c) Yang, P.; Jian, Y.; Zhou, X.; Li, G.; Deng, T.; Shen, H.-Y.; Yang, Z.-Z.; Tian, Z.-M. J. Org. Chem. 2016, 81, 2974.
     (d) Li, G.; Zhao, L.; Yang, P.; Yang, Z.; Tian, Z.; Chen, Y.; Shen, H.-Y.; Hu, C. Anal. Chem. 2016, 88, 10751

  8. [8]

     姚欢, 孙娇囡, 柯华, 杨留攀, 李加荣, 蒋伟, 有机化学, 2017, 37, 603. http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract345866.shtmlYao, H.; Sun, J. N.; Ke, H.; Yang, L. P.; Li, J. R. Jiang, W. Chin. J. Org. Chem. 2017, 37, 603(in Chinese). http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract345866.shtml

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  图式 1  化合物1~4合成路线

  Scheme 1  Synthetic routes of the target compounds 1~4

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  图 1  化合物3的可能构型

  Figure 1  Possible configuration of 3S

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  图 2  化合物3局部¹H NMR谱图(a)及其NOESY的部分放大谱图(b)

  Figure 2  Partial ¹H NMR (a) and partial NOESY (b) of 3

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  图 3  优化的化合物3能量最低构象

  Figure 3  Optimized conformation of 3 with the lowest energy

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  图 4  血红素分子结构

  Figure 4  Molecular structure of hemin

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  图 5  血红素(10 µmol/L)与3的紫外滴定图谱(a)及拟合曲线(b)

  Figure 5  UV-vis spectra (a) and the fitted curve (b) of hemin (10 µmol/L) upon addition of 3

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  图 6  血红素(10 µmol/L)与1的紫外滴定图谱

  Figure 6  UV-vis spectra of hemin upon addition of 1

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  图 7  MMFF力场优化的血红素与3的结合模式示意图

  Figure 7  Optimized binding pattern of hemin with 3

  (a) Front view, (b) side view

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  图 8  杯[4]咔唑结构示意图

  Figure 8  Structure of calix[4]carbazole

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  图 9  杯[4]咔唑与3的紫外滴定谱图

  Figure 9  UV-vis spectra of calix[4]carbazole upon addition of 3

  (a) [3]/[calixcarbazole] < 1.0, (b) [3]/[calixcarbazole] > 1.0

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  图 10  杯咔唑与3的荧光滴定谱图(a)及拟合曲线(b)

  Figure 10  Fluorescence spectra of calix[4]carbazole upon addition of 3 (a) and the fitted curve (b)

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  图 11  杯咔唑对3的增溶示意图(图左:杯咔唑与3复合物; 图右: 3自身)

  Figure 11  Enhanced solubility of 3 by calix[4]carbazole (left: calix[4]carbazole/3 complexes; right: 3 alone)

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