新型嘧啶-水杨酸类抑制剂的设计、合成及其生物活性研究

引用本文: 曲仁渝, 严耀超, 杨景芳, 陈琼, 杨光富. 新型嘧啶-水杨酸类抑制剂的设计、合成及其生物活性研究[J]. 有机化学, 2019, 39(8): 2303-2310. doi: 10.6023/cjoc201901043 shu

Citation: Qu Renyu, Yan Yaochao, Yang Jingfang, Chen Qiong, Yang Guangfu. Design, Synthesis and Bioactivity of New Pyrimidyl-salicylate Inhibitors[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2019, 39(8): 2303-2310. doi: 10.6023/cjoc201901043 shu

新型嘧啶-水杨酸类抑制剂的设计、合成及其生物活性研究

华中师范大学化学学院农药与化学生物学教育部重点实验室武汉 430079

通讯作者: 陈琼, qchen@mail.ccnu.edu.cn; 杨光富, gfyang@mail.ccnu.edu.cn

基金项目:

国家重点研发计划（No.2018YFD0200102）、国家自然科学基金（Nos.21837001.21772058）资助项目

摘要: 乙酰羟酸合成酶（Acetohydroxyacid synthase，AHAS）是一类重要的除草剂靶标，但是靶向AHAS的抑制剂是所有除草剂类型中抗性最为严重的一类，因此设计具有反抗性的AHAS抑制剂显得尤为必要.本工作基于前期低抗性AHAS抑制剂结构，利用“构象柔性度分析”的设计策略合理增加分子柔性，设计并合成了13个含“双氧桥”结构的嘧啶水杨酸类抑制剂.目标分子均经过氢谱（¹H NMR）、碳谱（¹³C NMR）和高分辨质谱（HRMS）确证.酶水平活性结果显示，部分化合物对P197L突变体表现出了微摩尔水平的抑制作用，特别是2-（（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基）氧基）-6-（2-氟-4-硝基苯氧基）-4-甲基苯甲酸（6l）对P197L突变体表现出了良好的反抗性.盆栽除草活性结果表明，个别化合物对抗性杂草播娘蒿具有一定的除草活性，其中2-（（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基）氧基）-6-（2-氟苯氧基）-4-甲基苯甲酸（6b）在150 g ai/ha浓度下，对敏感生物型播娘蒿和抗性播娘蒿均达到80%的除草防效，具有进一步深入研究的价值.

关键词:

English

Design, Synthesis and Bioactivity of New Pyrimidyl-salicylate Inhibitors

Key Laboratory of Pesticide and Chemical Biology, College of Chemistry, Central China Normal University, Wuhan 430079

Corresponding author: Chen, Qiong, E-mail: qchen@mail.ccnu.edu.cn; Yang, Guangfu, E-mail: gfyang@mail.ccnu.edu.cn

Received Date: 26 January 2019
Revised Date: 04 March 2019
Available Online: 25 August 2019
Fund Project:

Project supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFD0200102) and the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21837001. 21772058)

Abstract: Acetohydroxyacid synthase (AHAS) was one of important herbicidal targets. However, the issue of weed resistance to commercial AHAS inhibitors has become one of the largest obstacles for their application. Therefore, there is a high demand to design new anti-resistance AHAS inhibitors. Herein, based on the reported low resistance AHAS inhibitors, a series of pyrimidyl-salicylates with "double oxygen bridge" utilized the "conformation flexibility analysis" strategy were designed. All the synthesized compounds were characterized by ¹H NMR, ¹³C NMR and HRMS. The bioactivity results showed that most of the derivatives displayed good inhibitory activities against P197L mutant. Especially, 2-((4, 6-dimethoxypyrimidin-2-yl)oxy)-6-(2-fluoro-4-nitrophenoxy)-4-methylbenzoic acid (6l) was identified as the most potent anti-resistance AHAS inhibitor. In addition, some compounds showed good weed control for resistant Descurainia sophia (P197L AHAS). Most importantly, 2-((4, 6-dimethoxypyrimidin-2-yl)oxy)-6-(2-fluorophenoxy)-4-methylbenzoic acid (6b) showed 80% herbicidal activities against sensitive and resistant Descurainia sophia at the dosage of 150 g ai/ha. These results indicated that this type of compounds worth of the further investigation.

Key words:

乙酰羟酸合成酶(AHAS, EC 2.2.1.6)是生物体内支链氨基酸合成的关键酶, 其主要催化一分子丙酮酸以及一分子2-羰基丁酸(异亮氨酸的合成途径)或两分子的丙酮酸(亮氨酸和缬氨酸的合成途径)分别合成产物α-乙酰羟基丁酸和α-乙酰乳酸^[1].由于AHAS在植物体内独特的生理功能, 早在20世纪70年代其已经被发展成为一类重要的除草剂靶标.自跨世纪除草剂“氯磺隆”问世以来, 以AHAS为靶标的除草剂品种层出不穷, 截止目前为止共有五种不同结构类型的抑制剂分别靶向于AHAS, 包括磺酰脲类(SUs)、三唑并嘧啶磺酰胺类(TPs)、嘧啶(硫代)苯甲酸(PTBs)、咪唑啉酮类(IMIs)以及三唑啉酮类(SCTs)^[2].在实际生产中, 已商品化的AHAS除草剂往往具有超高效的除草活性、良好的作物选择性以及对哺乳动物高度安全等优点, 然而由于该类除草剂在田间被大面积连续使用, 对杂草造成的巨大选择压力致使其抗性问题日益突出^[3].根据除草剂抗性委员会(HRAC, Herbicide resistance action committee)截止2018年的统计报道, AHAS抑制类除草剂的抗性杂草物种数高达160余种, 是所有除草剂类型中抗性最为严重的一类^[4].因此, 发展具有全新反抗性机制且保持原有产品优势的AHAS抑制剂先导结构迫在眉睫!

近些年的研究表明, 抑制剂分子与靶酶AHAS催化亚基的结合位点发生氨基酸残基的单点突变, 导致相互作用力减弱, 是造成杂草对AHAS抑制剂产生高倍抗性问题的主要原因.目前已知的抗性突变位点有7个, 分别是Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Trp574、Ser653、Gly654(以Arabidopsis thaliana, AtAHAS催化亚基序列进行编号), 它们都位于AHAS催化亚基的5个高度保守区域^[5].这7个突变位点中, Pro-197-Leu突变引起的杂草抗性报道最为广泛, 并且该突变会对多种类型AHAS抑制剂产生严重的交互抗性^[6].例如, 杂草Amaranthus retroflexus的AHAS发生P197L突变后, 对SUs、IMIs、TPs、PTBs以及SCTs五类AHAS抑制类除草剂均产生十倍甚至百倍以上的抗性^[7].因此, 针对P197L突变体设计一类在酶水平以及活体水平均具有高活性的反抗性AHAS抑制剂具有重要的现实意义.最近, 我们发现在酶突变前后抑制剂分子构象柔性变化与抗性倍数高低之间存在着一定的关联性, 并提出一种基于“构象柔性度分析”(conformational flexibility analysis)的反抗性分子设计策略^[8].基于该策略, 我们前期发展了一种通过柔性桥链连接的嘧啶-联芳基类衍生物, 代表性化合物A对野生型AtAHAS和P197L突变体均表现出良好的酶抑制作用^[9].但令人遗憾的是, 虽然其对P197L突变体的抗性倍数(约19倍)相较于SUs、TPs类AHAS抑制剂(＞500倍)有大幅下降, 但仍然没有达到反抗性的设计要求.因此根据上述反抗性药物分子设计理念, 继续增加配体分子的构象柔性, 使其更加适应突变体空腔, 增强对突变体的抑制活性, 实现抑制剂对P197L突变体的反抗性.

基于此, 我们将低抗性AHAS抑制剂A作为基本骨架, 侧链引入苯氧基结构, 设计了一类含“双柔性氧桥”的新型AHAS抑制剂结构(图 1).从分子对接叠合图中, 我们发现母体分子6a在酶突变前后的构象翻转相比于化合物A更加显著, 可能更有利于抑制剂与P197L突变体结合以及反抗性AHAS抑制剂的发现.而后我们合成了一系列的相关衍生结构6b~6m, 所有目标分子结构均经过¹H NMR, ¹³C NMR以及高分辨质谱确定, 同时测试了它们对野生型AtAHAS和P197L突变体的酶抑制活性, 并利用分子模拟探讨了该系列分子的反抗性机制.此外也将它们对敏感型和抗性(P197L-AHAS)杂草播娘蒿的除草活性进行了评价.

图 1

图 1. 目标化合物6的分子设计以及代表性化合物A和6a在野生型AtAHAS和P197L突变体中的叠合图

Figure 1. Design of target compounds 6, and simulated binding modes overlay of representative compounds A and 6a with wild-type AtAHAS and its P197L mutant, respectively

The green molecule represent binding mode between ligand and wild-type AtAHAS, and the pink molecule represent binding mode between ligand and P197L mutant

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1. 结果与讨论

1.1 目标化合物6a~6m的合成

1.1.1 中间体3的合成

在合成目标分子的过程中, 我们以3, 5-二羟基甲苯(苔黑酚, 化合物1)作为起始原料, 首先在通CO₂的条件下, 将化合物1的2号位引入重要的药效羧基片段, 经过浓盐酸酸化可以合成中间体2.随后如何在双氧桥的两个侧链连接不同的芳香片段是合成的关键, 因此我们利用类缩醛保护策略, 将中间体2与丙酮在二氯亚砜和DMAP的作用下进行环化保护反应, 同时保护羧基以及其中的一个羟基得到了关键中间体3^[10], 以便提高后续的反应选择性.

1.1.2 中间体4和5的合成

为了利于后续底物扩展, 我们主要利用两种合成方法对右侧的二芳基醚片段进行构建.第一种, 利用二芳基碘鎓四氟硼酸盐与中间体3中酚羟基在叔丁醇钾的作用下发生反应合成中间体4, 对称的二芳基碘鎓盐是利用文献报道的方法进行合成^[11]; 第二种, 利用S_NAr亲核取代反应, 将中间体3与带有强吸电子基团的(取代)对氟硝基苯或邻氟硝基苯在碳酸钾的作用下, 得到了含有硝基取代的中间体4.最后在NaOH的作用下将类缩醛结构水解, 酸化后可不经纯化直接得到6-苯氧基水杨酸中间体5.

1.1.3 化合物6a~6m合成

在足量碳酸钾的作用下, 将上一步得到的中间体5与4, 6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶(DMSP)溶解于最适反应溶剂甲苯中进行S_NAr取代反应, 原料反应完全后脱干甲苯, 酸化即可得到粗产品, 后经柱层析提纯即可得到对应目标分子6a~6m, 收率均在70%以上(Scheme 1).

图式 1

图式 1. 目标分子6a~6m的合成路线

Scheme 1. Synthetic route of title compounds 6a~6m

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1.2 抑制活性以及反抗性机制研究

通过前期报道的测试方法^[8], 针对野生型AtAHAS和P197L突变体, 分别对已合成的化合物6a~6m进行了酶抑制动力学常数(K_i值)的测定.将化合物对P197L突变体的K_i值与其对野生型AtAHAS的比值定义为抑制剂对P197L突变体的抗性倍数(RF值).

该系列化合物的酶水平抑制活性结果如表 1所示, 其中对照药剂氯磺隆、唑嘧磺草胺对野生型AtAHAS均表现出优异的抑制作用, 但它们对P197L突变体的抑制活性仅有103和25.8 μmol·L^-1, 抗性倍数高达2060倍和68倍, 这也进一步从酶学水平解释了这两个商品化AHAS抑制剂高抗的原因.而前期合成的先导化合物A对野生型AtAHAS和P197L突变体均表现出微摩尔级别的抑制活性(K_{i, wild-type}＝0.25 μmol·L^-1, K_{i, P197L}＝4.81 μmol·L^-1), 其抗性倍数相比于氯磺隆有接近107倍下降, 呈现出低抗性水平.令人欣喜的是, 本文通过增加侧链构象柔性所设计的代表性化合物6a (R¹＝H), 对P197L突变体的抗性倍数仅为1.35倍, 相较于先导化合物A, 其抗性倍数进一步下降近14倍, 但该化合物对野生型AtAHAS和P197L突变体的抑制活性并不理想(K_{i, wild-type}＝9.47 μmol·L^-1, K_{i, P197L}＝12.8 μmol·L^-1).为了进一步增加分子对野生型AtAHAS和P197L突变体的抑制活性, 并继续降低分子的抗性程度实现反抗性, 我们合成了6a的衍生物6b~6m.观察该系列衍生物的K_i值, 当分子中R¹基团引入F、Cl时, 发现化合物的取代基位置对P197L突变体的酶抑制活性影响有一定的规律: 2-F＞3-F＞4-F (6b＞6c＞6d), 2-Cl＞3-Cl＞4-Cl (6e＞6f＞6g), 且R¹为F取代时化合物对P197L突变体的抑制活性明显优于Cl取代, 特别是化合物6b (R¹＝2-F), 对P197L突变体的抑制活性达到6.34 μmol·L^-1, 此外该化合物对野生型AtAHAS也表现出了不错的抑制作用(K_{i, wild-type}＝5.87 μmol·L^-1), 其抗性倍数仅为1.08倍, 相较于未取代的化合物6a, 抗性程度进一步降低.当继续考察取代基对活性影响时, 发现R¹为4-NO₂取代, 相应化合物6i对P197L突变体和野生型AtAHAS的K_i值均表现出优于化合物6b的结果, 但其抗性倍数高于化合物6b.为了综合二者优势, 继续在侧链的苯环上引入双取代基, 发现化合物6j (R¹＝3-Me-4-NO₂)、6k (R¹＝2-Me-4-NO₂)和6m (R¹＝2-Cl-4-NO₂)相较于化合物6i, 它们对P197L突变体的酶抑制活性均有大幅度的下降.但当R¹基团为2-F-4-NO₂取代时, 相应化合物6l不仅对P197L突变体的抑制活性(K_{i, P197L}＝2.82 μmol·L^-1)优于化合物6i (R¹＝4-NO₂), 且对野生型AtAHAS的抑制活性也达到了微摩尔水平, 与化合物6i相当.值得注意的是, 该化合物对P197L突变体的抗性倍数比化合物6b (R¹＝2-F)更低, RF值仅有0.97倍, 相比于对照药剂氯磺隆和唑嘧磺草胺, 其抗性倍数分别下降了2100倍和70倍, 说明该化合物对P197L突变体具有良好的反抗性.

表 1

表 1 目标化合物6a~6m对野生型AtAHAS和P197L突变体的酶水平抑制活性数据以及其对应抗性倍数

Table 1. Inhibitory activities of compounds 6a~6m against wild-type AtAHAS and P197L mutant

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化合物	R¹	AtAHAS inhibition constant K_i/(μmol·L^-1)
化合物	R¹	野生型AtAHAS	P197L突变体	抗性倍数(RF)^a
6a	H	9.47±1.12	12.80±2.10	1.35
6b	2-F	5.87±0.49	6.34±0.23	1.08
6c	3-F	6.03±1.50	23.90±8.60	4.40
6d	4-F	6.86±0.96	54.90±6.60	8.00
6e	2-Cl	17.20±2.80	21.50±3.70	1.25
6f	3-Cl	5.55±0.60	26.00±4.60	13.47
6g	4-Cl	9.13±0.93	35.90±6.60	3.93
6h	2-NO₂	2.82±0.32	29.60±3.20	10.50
6i	4-NO₂	2.25±0.22	5.25±0.39	2.33
6j	3-Me-4-NO₂	10.30±1.10	22.80±2.10	2.21
6k	2-Me-4-NO₂	13.10±1.50	47.50±6.80	2.06
6l	2-F-4-NO₂	2.90±0.42	2.82±0.32	0.97
6m	2-Cl-4-NO₂	5.94±0.79	21.80±3.10	3.67
A		0.25±0.10	4.81±0.32	19.2
氯磺隆^b		0.05±0.01	103.00±14.00	2060
唑嘧磺草胺^b		0.38±0.26	25.80±3.20	68.0
^a RF, Resistance Farctor＝K_{i, P197L}/K_{i, wild-type}; ^b对照药剂:商品化AHAS抑制剂.

为了进一步解释化合物6l的反抗性分子机制, 我们采用分子对接方法研究化合物与靶酶之间的作用模式.代表性化合物6l与野生型和突变型AHAS的结合模式如图 2A和2B所示, 对比化合物6l在野生型AtAHAS和P197L突变体的结合模式, 我们发现分子的嘧啶环与两个活性空腔中的氨基酸残基W574均形成了较好的π-π相互作用, 羧基片段和分子末端的硝基则与周围的氨基酸有良好的氢键作用, 上述的作用力保证了分子无论在野生型和突变型AHAS中均有较好的结合力, 因而化合物6l表现出了较高的酶抑制活性.进一步研究发现, 当氨基酸残基P197突变为L197时, 残基位阻增大, 而分子本身具有较大的柔性, 因此通过构象的翻转避免了末端芳环与L197之间的立体冲突.虽然分子羧基在突变体中丢失了与K256之间的氢键作用, 但是新的结合构象却形成了更多的相互作用力, 例如, 羧基与S635、R377之间以及苯氧基中的氧桥与K256之间形成新的氢键作用, 使小分子与P197L突变体更好地结合, 这一定程度上解释了该化合物的反抗性分子机制, 也进一步证明了本文设计的具有柔性构象AHAS抑制剂确实有助于降低其对P197L突变体的抗性倍数.此外, 化合物6l相比于其他衍生物, 其分子4位硝基与R199之间以及2位氟原子与K256之间可以形成额外的氢键作用, 这也解释了化合物6l对P197L突变体显示出最优抑制活性的原因.

图 2

图 2. (A) 化合物6l与野生型AtAHAS结合模式示意图以及(B)化合物6l与P197L突变体结合模式示意图

Figure 2. (A) Binding mode of compound 6l with wild-type AtAHAS and (B) binding mode of compound 6l with P197L mutant

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1.3 温室盆栽除草活性研究

在剂量为150 g ai/ha条件下, 温室盆栽除草活性结果如表 2所示, 其中对照药剂唑嘧磺草胺对敏感生物型播娘蒿表现出完全的抑制作用, 但对于抗性生物型播娘蒿却仅有60%的除草防效, 表现出了明显的杂草抗性, 与表 1中的酶水平呈现的抗性倍数相符.观察本文所合成化合物6a~6m的除草活性, 我们发现大部分的化合物对敏感生物型播娘蒿具有一定的抑制作用.其中化合物6b、6e、6h和6l对敏感生物型杂草播娘蒿表现出超过70%的除草活性.此外, 个别化合物对抗性播娘蒿表现出了较好的抑制作用, 化合物6b、6e和6l对抗性播娘蒿防效超过70%, 除草活性优于商品化AHAS抑制剂唑嘧磺草胺.综合以上数据, 进一步发现化合物6b不仅表现出了活体反抗性, 并且对敏感生物型和抗性播娘蒿的除草活性达到80%, 具有进一步深入研究的价值.因此, 本文的分子设计策略具有一定可行性, 有望设计出具有更高除草活性的反抗性AHAS抑制剂.

表 2

表 2 目标化合物6a~6m对敏感生物型播娘蒿以及抗性播娘蒿的除草活性(生长抑制率/%)

Table 2. Herbicidal activities of compounds 6a~6m against sensitive and resistant Descurainia sophia (growth inhibitory rate/%)

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化合物	敏感型播娘蒿	抗性播娘蒿^a
6a	50	50
6b	80	80
6c	60	30
6d	40	0
6e	70	70
6f	50	40
6g	0	0
6h	70	20
6i	30	30
6j	0	60
6k	30	30
6l	80	70
6m	40	40
唑嘧磺草胺^b	100	60
^a AHAS突变位点P197L; ^b对照药剂:商品化AHAS抑制剂.

2. 结论

本文基于“构象柔性度分析”分子设计策略, 将先导化合物A作为基本骨架, 增加侧链构象柔性, 引入苯氧基片段, 设计了一类具有“双柔性氧桥”的新型AHAS抑制剂.以苔黑酚作为起始原料, 经过羧基化、环化、S_NAr亲核取代反应等5步反应, 以中等偏上的收率合成了目标化合物6a~6m.采用分子对接的方法, 对比代表性化合物6a在酶突变体后的结合构象, 发现在P197L突变体中, 分子相比于其在野生型靶酶构象有较大翻转, 避免了与残基L197之间的立体冲突, 从而降低抗性程度.经过后续的衍生化, 发现绝大多数衍生物对P197L突变体的抗性倍数维持在0.9至10.0范围内, 特别是化合物6l, 不仅对野生型AtAHAS和P197L突变体表现出较优的抑制活性, 并且抗性倍数仅有0.97, 具有良好的反抗性.同时在盆栽除草活性筛选中, 化合物6b、6e和6l对抗性播娘蒿的防效超过70%, 优于对照药剂唑嘧磺草胺.因此, 该类AHAS抑制剂具有进一步研究的潜力, 并为新型反抗性AHAS抑制剂的设计提供了新的先导骨架.

3. 实验部分

3.1 仪器与试剂

MR 3001型恒温磁力搅拌器(Heidolph, German), R-200型旋转蒸发仪(Büchi, Flawil, Switzerland), Sartotuis万分之一电子天平, ZF-20D暗箱式紫外分析仪, SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵, WS70-1型远红外线干燥箱等仪器. ¹H NMR和¹³C NMR使用Varian VNMR 400 MHz和600 MHz核磁共振仪(Varian, Palo Alto, CA)测定, 以TMS作为内标, 以氘代氯仿、氘代二甲亚砜等为溶剂; 质谱和高分辨质谱数据测定分别使用DSQ II GC-MS质谱仪(Thermo Fisher, Austin, TX)和6224 TOF LC/MS质谱仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA); 熔点测定使用Büchi M-545数字熔点仪(未经校正).柱层析硅胶(200~300目)和TLC薄层层析硅胶板均从青岛海洋化工厂购买; 使用石油醚沸程为60~90 ℃, 其他溶剂如无特殊说明均经标准操作干燥处理, 订购试剂均为分析纯或化学纯.中间体二芳基碘鎓四氟硼酸盐和4, 6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶分别参照文献方法合成^{[11, 12]}.

3.2 实验方法

3.2.1 中间体2的合成

在1 L三颈瓶中, 将3, 5-二羟基甲苯(1) 100 g溶解于400 mL的丙三醇中, 反应温度加热至80 ℃, 并将CO₂通入反应体系中, 液面鼓泡速度控制于2次/s, 反应约12 h, 停止反应并降温至室温, 将反应体系缓慢加入至300 mL的2 μmol·L^-1盐酸溶液中, 大量白色固体析出, 静置抽滤得到固体中间体2.

3.2.2 中间体3的合成

N₂保护下, 在500 mL三颈瓶中将100 mmol的2, 6-二羟基-4-甲基苯甲酸(2)、1 mmol DMAP以及9.5 mL丙酮溶解至100 mL干燥的乙二醇二甲醚中, 随后将体系冷却至-10 ℃, 并向体系中缓慢滴加10.5 mL二氯亚砜和50 mL乙二醇二甲醚混合溶液.保持体系温度低于30 ℃, 持续反应约2 d, 薄层色谱(TLC)监测直至原料反应完全, 将体系中的混合溶液减压脱干, 大量固体析出, 用饱和碳酸氢钠溶液对其进行多次洗涤, 剩余固体用正己烷/乙酸乙酯重结晶即可得到纯度较高的关键中间体3, 产率74%, m.p. 105~106 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.21 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.40 (s, 1H), 2.28 (s, 3H), 1.70 (s, 6H); ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ: 165.2, 160.9, 155.2, 149.9, 111.1, 107.9, 106.9, 96.7, 25.5, 22.3. EIMS m/z: 208.00 (M⁺). Anal. calcd for C₁₁H₁₂O₄: C 63.45, H 5.81; found C 63.66, H 5.79.

3.2.3 中间体5的合成

在100 mL单颈瓶中, 将5 mmol中间体3溶于25 mL THF或20 mL DMF中, 加入5.5 mmol叔丁醇钾(KTB)或K₂CO₃, 控温于70 ℃, 向体系中加入5.5 mmol对应的二芳基碘鎓四氟硼酸盐或者邻(对)氟硝基苯, TLC跟踪反应进程直至原料消失.随后将6 mmol NaOH加入反应体系后, 将反应温度升温至60 ℃, TLC跟踪反应进程直至中间态消失, 待反应体系冷却至室温后, 加2 mol/L盐酸调节pH值为1, 固体析出, 低温静置抽滤, 红外干燥得到中间体5, 无需进一步提纯可直接投入下一步反应当中.

3.2.4 目标化合物6a~6m的合成

在100 mL单颈瓶中, 将2 mmol中间体5和8 mmol无水K₂CO₃溶于40 mL重蒸甲苯中, 室温搅拌约1 h, 向反应体系中加入2.2 mmol 4, 6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶, 并将体系升温至甲苯回流, TLC跟踪反应进程.反应完全后将体系冷却至室温, 加入40 mL 2 mol/L盐酸溶液淬灭反应, 乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 合并有机相, 有机相用无水硫酸钠进行干燥, 减压蒸馏拌样, 经柱层析分离提纯[V(石油醚)/V(丙酮)＝20/10]得到目标化合物.

2-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-4-甲基-6-苯氧基苯甲酸(6a):产率75%.白色固体, m.p. 135~136 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.91 (s, 1H), 7.35 (dd, J＝7.8, 7.8 Hz, 2H), 7.10 (dd, J＝7.2, 7.2 Hz, 1H), 7.02~6.90 (m, 3H), 6.68 (s, 1H), 5.97 (s, 1H), 3.79 (s, 6H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.2, 164.6, 163.1, 156.8, 153.4, 149.8, 141.3, 129.6, 123.0, 118.6, 118.6, 117.8, 116.8, 83.9, 54.2, 20.9. HRMS calcd for C₂₀H₁₈N₂NaO₆ [M+Na]⁺ 405.1057, found 405.1060.

2-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-6-(2-氟苯氧基)-4-甲基苯甲酸(6b):产率78%.白色固体, m.p. 136~137 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.05 (s, 1H), 7.41~7.33 (m, 1H), 7.23~7.16 (m, 2H), 7.07 (dd, J＝8.6, 8.6 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.64 (s, 1H), 6.01 (s, 1H), 3.80 (s, 6H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.3, 164.6, 163.1, 153.5, 152.7 (d, J＝244.0 Hz), 149.8, 143.3 (d, J＝11.0 Hz), 141.5, 125.1 (d, J＝7.0 Hz), 124.9 (d, J＝7.0 Hz), 120.7, 118.6, 117.6, 116.9 (d, J＝17.0 Hz), 115.0, 83.9, 54.3, 21.0. HRMS calcd for C₂₀H₁₇FN₂NaO₆ [M+Na]⁺ 423.0963, found 423.0964.

2-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-6-(3-氟苯氧基)-4-甲基苯甲酸(6c):产率66%.白色固体, m.p. 130~131 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.03 (s, 1H), 7.39 (dd, J＝15.6, 8.4 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.95 (dd, J＝7.8, 7.8 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.82~6.76 (m, 2H), 6.00 (s, 1H), 3.79 (s, 6H), 2.32 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.2, 164.5, 163.1, 162.4 (d, J＝242.0 Hz), 158.6 (d, J＝11.0 Hz), 152.4, 149.9, 141.9, 130.9 (d, J＝10.0 Hz), 119.6, 119.0, 118.0, 113.2, 109.6 (d, J＝21.0 Hz), 104.9 (d, J＝24.0 Hz), 84.0, 54.2, 20.91. HRMS calcd for C₂₀H₁₇FN₂NaO₆ [M+Na]⁺ 423.0963, found 423.0963.

2-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-6-(4-氟苯氧基)-4-甲基苯甲酸(6d):产率85%.白色固体, m.p. 143~144 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.02 (s, 1H), 7.23 (dd, J＝9.0, 9.0 Hz, 2H), 7.03 (dd, J＝9.0, 4.2 Hz, 2H), 6.96 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.01 (s, 1H), 3.80 (s, 6H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.3, 164.7, 163.1, 157.8 (d, J＝237.0 Hz), 153.8, 152.9, 149.8, 141.5, 119.8 (d, J＝8.0 Hz), 118.5 (d, J＝22.0 Hz), 116.4, 116.2, 83.9, 54.3, 21.0. HRMS calcd for C₂₀H₁₇FN₂NaO₆ [M+Na]⁺ 423.0963, found 423.0961.

2-(2-氯苯氧基)-6-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-4-甲基苯甲酸(6e):产率68%.白色固体, m.p. 138~139 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.02 (s, 1H), 7.54 (d, J＝7.8 Hz, 1H), 7.31 (dd, J＝7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.15 (dd, J＝7.6, 7.6 Hz, 1H), 7.04~6.89 (m, 2H), 6.61 (s, 1H), 5.98 (s, 1H), 3.79 (s, 6H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.3, 164.5, 163.1, 153.0, 152.0, 149.9, 141.6, 130.4, 128.4, 124.7, 123.4, 119.5, 118.9, 118.1, 115.9, 84.0, 54.3, 21.0. HRMS calcd for C₂₀H₁₇ClN₂NaO₆ [M+Na]⁺ 439.0667, found 439.0665.

2-(3-氯苯氧基)-6-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-4-甲基苯甲酸(6f):产率67%.白色固体, m.p. 135~136 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.03 (s, 1H), 7.39 (dd, J＝7.8, 7.8 Hz, 1H), 7.16 (d, J＝7.8 Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.98~6.90 (m, 2H), 6.86 (s, 1H), 6.00 (s, 1H), 3.79 (s, 6H), 2.33 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.2, 164.4, 163.0, 158.3, 152.3, 149.9, 142.1, 133.5, 131.0, 122.6, 119.7, 119.1, 118.3, 117.1, 115.9, 84.0, 54.2, 20.9. HRMS calcd for C₂₀H₁₇ClN₂NaO₆ [M+Na]⁺ 439.0667, found 439.0668.

2-(4-氯苯氧基)-6-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-4-甲基苯甲酸(6g):产率81%.白色固体, m.p. 152~153 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.03 (s, 1H), 7.42 (d, J＝9.0 Hz, 2H), 7.06~6.94 (m, 3H), 6.78 (s, 1H), 6.00 (s, 1H), 3.79 (s, 6H), 2.30 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.3, 164.6, 163.1, 156. 0, 152.9, 149.9, 141.8, 129.5, 126.8, 119.3, 118.8, 117.5, 84.0, 54.3, 20.9. HRMS calcd for C₂₀H₁₇ClN₂NaO₆ [M+Na]⁺ 439.0667, found 439.0669.

2-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-4-甲基-6-(2-硝基苯氧基)苯甲酸(6h):产率76%.白色固体, m.p. 163~164 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.03 (s, 1H), 7.58 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 7.34 (dd, J＝7.8, 7.8 Hz, 1H), 7.18 (dd, J＝7.8, 7.8 Hz, 1H), 7.03~6.94 (m, 2H), 6.00 (s, 1H), 3.80 (s, 6H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.6, 164.4, 163.3, 152.2, 150.4, 150.2, 142.5, 140.1, 134.8, 125.5, 123.4, 120.3, 119.1, 118.8, 118.1, 84.1, 54.2, 54.1, 20.8. HRMS calcd for C₂₀H₁₇N₃NaO₈ [M+Na]⁺ 450.0908, found 450.0906.

2-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-4-甲基-6-(4-硝基苯氧基)苯甲酸(6i):产率68%.白色固体, m.p. 148~149 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.12 (s, 1H), 8.26 (d, J＝8.4 Hz, 2H), 7.15 (s, 1H), 7.10 (d, J＝8.4 Hz, 2H), 7.02 (s, 1H), 6.00 (s, 1H), 3.79 (s, 6H), 2.37 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.3, 164.3, 163.1, 163.0, 151.3, 150.3, 142.7, 142.0, 125.9, 120.8, 119.4, 116.8, 109.3, 84.1, 54.3, 20.9. HRMS calcd for C₂₀H₁₇N₃NaO₈ [M+Na]⁺ 450.0908, found 450.0910.

2-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-4-甲基-6-(3-甲基-4-硝基苯氧基)苯甲酸(6j):产率69%.白色固体, m.p. 151~152 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.08 (s, 1H), 8.06 (d, J＝9.0 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.88 (d, J＝9.0 Hz, 1H), 5.97 (s, 6H), 2.53 (s, 3H), 2.36 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.2, 164.2, 163.0, 161.1, 151.4, 150.2, 143.0, 142.5, 136.2, 127.2, 120.5, 119.8, 119.3, 119.1, 114.4, 84.1, 54.3, 20.9, 20.5. HRMS calcd for C₂₁H₁₉N₃NaO₈ [M+Na]⁺464.1064, found 464.1061.

2-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-4-甲基-6-(2-甲基-4-硝基苯氧基)苯甲酸(6k):产率54%.白色固体, m.p. 175~176 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.06 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.07 (dd, J＝9.0, 1.8 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.79 (d, J＝9.0 Hz, 1H), 5.99 (s, 1H), 3.79 (s, 6H), 2.36 (s, 3H), 2.35 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.4, 164.4, 163.3, 161.2, 152.0, 150.5, 142.6, 141.9, 128.6, 126.3, 123.3, 120.4, 118.9, 115.3, 54.4, 21.1, 16.1. HRMS calcd for C₂₁H₁₉N₃NaO₈ [M+Na]⁺ 464.1064, found 464.1063.

2-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-6-(2-氟-4-硝基苯氧基)-4-甲基苯甲酸(6l):产率71%.白色固体, m.p. 145~146 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.17 (s, 1H), 8.33 (d, J＝10.2 Hz, 1H), 8.10 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.06 (s, 1H), 7.05~7.00 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 2.36 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.2, 164.0, 162.9, 151.7, 150.9 (d, J＝10.0 Hz), 150.5 (d, J＝248.0 Hz), 150.3, 142.7, 141.8 (d, J＝10.0 Hz), 121.1 (d, J＝29.0 Hz), 118.7, 118.6, 117.6, 112.9 (d, J＝23.0 Hz), 84.1, 54.3, 20.9. HRMS calcd for C₂₀H₁₆FN₃NaO₈ [M+Na]⁺ 468.0814, found 468.0829.

2-(2-氯-4-硝基苯氧基)-6-[(4, 6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧基]-4-甲基苯甲酸(6m):产率64%.白色固体, m.p. 150~151 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.16 (s, 1H), 8.45 (d, J＝2.4 Hz, 1H), 8.20 (dd, J＝9.0, 2.4 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.93 (d, J＝9.2 Hz, 1H), 5.99 (s, 1H), 3.78 (s, 6H), 2.37 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 172.2, 163.9, 163.0, 158.5, 150.9, 150.3, 142.8, 142.0, 125.8, 124.2, 122.3, 121.1, 119.0, 119.0, 116.5, 84.1, 54.3, 20.9. HRMS calcd for C₂₀H₁₆ClN₃NaO₈ [M+Na]⁺ 484.0518, found 484.0524.

3.2.5 酶抑制活性测定实验

首先将化合物配制四种不同浓度的溶液, 即母液的浓度为6、60、600、6000 μmol·L^-1, 反应时再进行稀释, 在反应体系中的最终浓度为0.2、2、20、200 μmol·L^-1.使用的野生型AHAS为拟南芥AHAS催化亚基表达蛋白质裂解液. P197L突变体采用Megaprimer PCR定点突变的方法, 以含有拟南芥AHAS基因的质粒pET28a (+)-ACSU:T86作为模板, 进行定点突变, 得到含有突变位点的产物^[13].突变产物经过限制性内切酶酶切克隆到所要连接的载体中.把经过测序验证的突变质粒转化到E. coli (XL1-blue)中进行酶表达.

活性结果测定公式: V_i＝V_∞+(V₀-V_∞)/(1+[I]/K_i)

[I]代表所加化合物样品的浓度; K_i代表样品的抑制率为50%时所对应的测试样品浓度. V_i和V₀分别为加抑制剂和未加抑制剂的酶反应速率; V_i数值用residual activity (百分比)表示; V₀设为100%, V_∞表示在饱和浓度的抑制浓度下的残留活性.

3.2.6 模型构建与分子对接

从Protein Data Bank数据库中下载野生型AtAHAS的5K2O晶体结构作为受体^[14].采用SYBYL 2.0中的生物聚合物突变建模工具, 对P197L突变体进行构建.随后, 采用Powell法^[15]对突变位点周围3 Å距离内的残基进行3000步的优化, 收敛条件设置为42 J/mol.采用Auto Dock 4.0程序进行分子对接, 活性腔中心坐标设为x＝77.68, y＝75.62, z＝80.86, 格点大小为50×50×50, 步长设为0.375 Å.设置每个小分子化合物产生256个构象, 其它参数设为默认值^[16].最后, 对选择的构象进行1-2ns的平衡动力学模拟.

3.2.7 温室盆栽除草活性测定实验

供试靶标为浙江省化工研究院提供的敏感生物型播娘蒿和抗性(P197L-AHAS)播娘蒿^[17].播娘蒿种子用0.05% GA₃浸种24 h, 打破休眠, 再用清水洗净后播种.取内径7.5 cm花盆, 装复合营养土至3/4处, 均匀覆土0.2 cm, 人工气候室中保持温度15 ℃(夜)/25 ℃(昼).子叶展开后, 将苗搬至温室进行炼苗, 待杂草长至4叶期进行备用.各化合物按照150 g ai/ha剂量用自动喷雾塔(型号: 3WPSH-700E)给杂草施药后, 将其移入人工气候室, 35 d后调查其对杂草的活性(生长抑制率, %).

辅助材料(SupportingInformation)化合物6a~6m的¹H NMR和¹³C NMR谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://s10oc-journal.cn/)上下载.

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图 1 目标化合物6的分子设计以及代表性化合物A和6a在野生型AtAHAS和P197L突变体中的叠合图

Figure 1 Design of target compounds 6, and simulated binding modes overlay of representative compounds A and 6a with wild-type AtAHAS and its P197L mutant, respectively

The green molecule represent binding mode between ligand and wild-type AtAHAS, and the pink molecule represent binding mode between ligand and P197L mutant

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图式 1 目标分子6a~6m的合成路线

Scheme 1 Synthetic route of title compounds 6a~6m

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图 2 (A) 化合物6l与野生型AtAHAS结合模式示意图以及(B)化合物6l与P197L突变体结合模式示意图

Figure 2 (A) Binding mode of compound 6l with wild-type AtAHAS and (B) binding mode of compound 6l with P197L mutant

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表 1 目标化合物6a~6m对野生型AtAHAS和P197L突变体的酶水平抑制活性数据以及其对应抗性倍数

Table 1. Inhibitory activities of compounds 6a~6m against wild-type AtAHAS and P197L mutant

化合物	R¹	AtAHAS inhibition constant K_i/(μmol·L^-1)
化合物	R¹	野生型AtAHAS	P197L突变体	抗性倍数(RF)^a
6a	H	9.47±1.12	12.80±2.10	1.35
6b	2-F	5.87±0.49	6.34±0.23	1.08
6c	3-F	6.03±1.50	23.90±8.60	4.40
6d	4-F	6.86±0.96	54.90±6.60	8.00
6e	2-Cl	17.20±2.80	21.50±3.70	1.25
6f	3-Cl	5.55±0.60	26.00±4.60	13.47
6g	4-Cl	9.13±0.93	35.90±6.60	3.93
6h	2-NO₂	2.82±0.32	29.60±3.20	10.50
6i	4-NO₂	2.25±0.22	5.25±0.39	2.33
6j	3-Me-4-NO₂	10.30±1.10	22.80±2.10	2.21
6k	2-Me-4-NO₂	13.10±1.50	47.50±6.80	2.06
6l	2-F-4-NO₂	2.90±0.42	2.82±0.32	0.97
6m	2-Cl-4-NO₂	5.94±0.79	21.80±3.10	3.67
A		0.25±0.10	4.81±0.32	19.2
氯磺隆^b		0.05±0.01	103.00±14.00	2060
唑嘧磺草胺^b		0.38±0.26	25.80±3.20	68.0
^a RF, Resistance Farctor＝K_{i, P197L}/K_{i, wild-type}; ^b对照药剂:商品化AHAS抑制剂.

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表 2 目标化合物6a~6m对敏感生物型播娘蒿以及抗性播娘蒿的除草活性(生长抑制率/%)

Table 2. Herbicidal activities of compounds 6a~6m against sensitive and resistant Descurainia sophia (growth inhibitory rate/%)

化合物	敏感型播娘蒿	抗性播娘蒿^a
6a	50	50
6b	80	80
6c	60	30
6d	40	0
6e	70	70
6f	50	40
6g	0	0
6h	70	20
6i	30	30
6j	0	60
6k	30	30
6l	80	70
6m	40	40
唑嘧磺草胺^b	100	60
^a AHAS突变位点P197L; ^b对照药剂:商品化AHAS抑制剂.

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142