English

• 含氮杂环化合物, 如三唑、咪唑、噻二唑等因其具有高效、广谱的生物活性而被广泛地应用于农药中, 其可作为杀菌剂、杀虫剂、植物生长调节剂等^[1~5].目前, 三唑类抗真菌剂在农业真菌感染的抑制中起主导作用, 例如戊唑醇、环氧唑醇、环丙唑醇和三唑酮等^[6].席夫碱化合物由于其独特的物理性能, 良好的配位化学性能及独特的抗菌、抗癌、除草等生理活性, 在许多领域有着广泛的应用^[1~8].研究表明, 三唑类化合物在与氨基化合物形成的席夫碱化合物中, 当三唑环上含有烷基、取代芳基等基团时具有显著的杀菌、抑菌作用^[9].因而, 基于前期的研究工作^{[1, 5~7]}, 本工作采用活性叠加原理, 将具有生物活性的1, 2, 4-三唑与席夫碱进行活性拼接, 设计合成新型的、具有良好抑菌效果的席夫碱化合物(Scheme 1).采用元素分析, IR和¹H NMR对目标化合物进行结构表征.通过菌丝生长速率法, 测定目标化合物对葡萄黑豆菌(Grape anthracnose), 苹果轮纹菌(Botryosphaeria berengriana), 苹果干腐菌(Botryo sphaeria ribis), 小麦赤霉菌(Wheat gibberellic), 玉米粗缩菌(Maize rough dwarf bacteria)及马铃薯干腐菌(Potato dry rot fungus) 6种真菌的抑制活性.同时使用分子对接方法, 从理论上分析目标化合物对蛋白质的对接能量以及蛋白质与残基结合的亲和力, 得出化合物对蛋白的理论抑菌效果.

  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物的合成

  Scheme 1.  Synthetic route of target compounds

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  1.   结果与讨论

  1.1   合成与波谱分析

  中间体4-氨基-5-甲基-1, 2, 4-三唑-3-硫酮(M1)的合成采用文献^{[1, 10~12]}的方法进行, 即硫代甲酰肼与冰乙酸在回流条件下反应4 h得到(Scheme 2).

  图式 2

  

  图式 2.  4-氨基-5-甲基-1, 2, 4-三唑-3-硫酮(M1)的合成

  Scheme 2.  Synthesis of 4-amino-5-methyl-1, 2, 4-triazole-3- thione (M1)

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  中间体4-氨基-5-芳基-1, 2, 4-三唑-3-硫酮(M2)的合成按照文献^[13~17]的方法, 经过酯化、酰肼化、成盐和环化反应进行(Scheme 3), 产物用无水乙醇重结晶.

  图式 3

  

  图式 3.  4-氨基-5-芳基-1, 2, 4-三唑-3-硫酮(M2)的合成

  Scheme 3.  Synthesis of 4-amino-5-aryl-1, 2, 4-triazole-3-thione (M2)

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  在合成中间体M的成环反应中, 产物采用浓盐酸进行酸化至pH值2~3时, 可有效提高产率.

  中间体M1和M2分别与4, 6-二氯-5-嘧啶甲醛在冰乙酸中回流反应得到4种1, 2, 4-三唑席夫碱化合物^{[12, 15~19]}.中间体M与嘧啶甲醛合成目标化合物M1-1, M2-2和M2-3的过程中, 使用冰醋酸作为反应溶剂和催化剂, 既有效的缩短了反应时间, 又提高了三唑硫酮席夫碱的产率.

  从IR光谱可以看出, 化合物M1-1, M2-1和M2-2在1500~1600 cm^-1处出现硫酮伸缩振动, 且在2560~2329 cm^-1范围内并未出现S—H伸缩振动, 表明化合物以C＝S基团形式存在.在1600 cm^-1附近出现了N＝CH亚氨基的特征吸收峰, 且未发现C＝O羰基的伸缩振动吸收峰, 则证实了缩合产物的生成.在¹H NMR光谱分析表明, N＝CH基团的H在δ 8~10范围内, 这证实了氨基与羰基之间缩合反应的发生, 而δ 7.0~8.0出现低场信号则为苯环上的质子.

  1.2   室内生物活性分析

  4种目标化合物及标准药物(Fluconazole)对6种植物真菌的毒力回归方程均呈现线性相关关系(表 1).化合物M1-1, M2-2和M2-3对小麦赤霉菌表现出优异的抑菌效果.

  表 1

  

  表 1  化合物对六种真菌的测定结果^a

  Table 1.  Results of compounds against six plant pathogens

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  化合物	病菌名称	毒力回归方程	相关系数(r)	EC50/(mg·L-1)	EC95/(mg·L-1)
  M1-1	小麦赤霉菌	Y＝3.3474+1.9509x	0.9600	4.03	49.00
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.6373+1.7585x	0.9929	5.95	51.32
  	苹果轮纹菌	Y＝3.5142+1.4314x	0.9631	10.91	153.86
  	苹果干腐菌	Y＝3.3665+1.5167x	0.9600	11.94	145.04
  	玉米粗缩菌	Y＝3.2724+1.7587x	0.9853	9.60	82.71
  	马铃薯干腐菌	Y＝4.1296+0.6115x	0.9581	26.50	—
  M2-1	小麦赤霉菌	Y＝3.8573+0.9450x	0.9975	16.18	890.82
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.7873+1.5801x	0.9969	5.85	64.33
  	苹果轮纹菌	Y＝3.5662+1.0763x	0.9798	21.48	725.11
  	苹果干腐菌	Y＝3.6334+1.2576x	0.9930	12.20	248.08
  	玉米粗缩菌	Y＝3.5373+1.4696x	0.9581	9.89	130.18
  	马铃薯干腐菌	Y＝3.7753+0.8238x	0.7571	30.66	—
  M2-2	小麦赤霉菌	Y＝3.2158+1.7933x	0.9746	9.88	81.68
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.6037+1.8117x	0.9991	5.89	47.71
  	苹果轮纹菌	Y＝2.7910+1.6951x	0.9943	20.09	187.72
  	苹果干腐菌	Y＝3.6999+0.8198x	0.9674	38.53	—
  	玉米粗缩菌	Y＝3.5408+1.8859x	0.9777	5.93	44.25
  	马铃薯干腐菌	Y＝3.3665+1.5167x	0.7479	25.44	—
  M2-3	小麦赤霉菌	Y＝4.0715+1.3861x	0.9956	4.67	71.86
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.3786+1.9038x	0.9871	7.10	51.95
  	苹果轮纹菌	Y＝3.2165+1.7136x	0.9870	10.98	100.15
  	苹果干腐菌	Y＝3.5360+1.2333x	0.9918	15.38	331.71
  	玉米粗缩菌	Y＝3.3792+1.7967x	0.9877	7.98	65.70
  	马铃薯干腐菌	Y＝3.7641+0.8454x	0.7519	28.96	—
  SD	小麦赤霉菌	Y＝3.4009+1.5462x	0.9383	10.81	125.31
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.7394+2.1295x	0.9861	3.90	23.14
  	苹果轮纹菌	Y＝5.0875+0.9620x	0.8987	0.81	41.57
  	苹果干腐菌	Y＝5.0010+0.8915x	0.9699	0.99	69.81
  	玉米粗缩菌	Y＝4.1356+1.2712x	0.9916	4.78	94.17
  	马铃薯干腐菌	Y＝4.7788+0.7018x	0.9807	2.06	455.98
  a SD:标准药物; “—”: EC95值大于1000 mg/L.

  从EC₅₀(半最大效应浓度, 引起50%个体有效的药物浓度值)值可见图 1, 化合物M1-1, M2-2和M2-3对小麦赤霉菌的EC₅₀值(4.03, 9.88和4.67 mg/L)均小于标准药物(10.81 mg/L).化合物对葡萄黑豆菌和玉米粗缩菌的抑菌效果稍差于标准药物, 化合物对苹果轮纹菌、苹果干腐菌及马铃薯干腐菌的抑菌效果相对较差.

  图 1

  

  图 1.  化合物M1-1 (▅), M2-1 (), M2-2 (), M2-3 ()和SD ()对6种植物病菌的EC₅₀值

  Figure 1.  EC₅₀ values of compounds M1-1 (▅), M2-1 (), M2-2 (), M2-3 () and SD () against six plant pathogens

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  1.3   分子对接分析

  分子对接是利用配体小分子与受体蛋白大分子的完整结构信息, 按照能量匹配、几何匹配以及化学环境匹配的原则来评价配体分子和受体蛋白的结合能力, 并预测它们之间最佳的结合模式^[20], 即最优构象, 使得整个系统的自由能最小化^{[21, 22]}.

  据报道, 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是侵染小麦穗部引起小麦赤霉病的主要原因^[23].特别地, 作为禾谷镰刀菌病原体之一的异柠檬酸裂解酶(ICL), 其乙醛酸循环和植物致病性之间有明显关联, 破坏ICL基因可能会影响禾谷镰刀菌毒力.因此, 来自禾谷镰刀菌的ICL可以作为抗真菌剂的靶标酶^[24].故本文选用其作为分子对接的蛋白, 所使用的软件为AutoDockTools- 1.5.6^[25].

  图 2为4种化合物进行20组构象中能量最低的构象与受体蛋白的对接图(3D和2D图).从图 2可知, 4种目标化合物均以氢键的模式很好地结合到蛋白受体中, 这也为抑制蛋白生长奠定了结构基础. 图 2中的2D结构显示, 席夫碱化合物三唑上NH中的H原子、嘧啶环上的N原子、N＝CH基团上的N原子以及苯环上OH的H原子是主要的活性位点, 分别与蛋白受体的SER434, ARG252, TRP108, GLY216, ASP123, ASN432, TYR104, LYS213, THR466等氨基酸残基形成氢键, 使受体蛋白与目标化合物结合更加牢固, 这也使得此类杀菌剂对小麦赤霉菌具有较强抑制作用.

  图 2

  

  图 2.  5E9H与目标化合物的3D(左)和2D(右)对接模式

  Figure 2.  3D (left) and 2D (right) docking modes of 5E9H with target compounds

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  结合表 2与图 2, 遵循对接能量低, 抑菌效果好的原则, 可以得出目标化合物的抑菌效果为M1-1＞ M2-3＞M2-2＞M2-1, 表明所合成的四种席夫碱化合物对小麦赤霉菌抑制的顺序为:甲基取代＞2-溴苯基取代＞2-羟基苯基取代＞2-氯苯基取代.此外, 从结构来看, 取代基为甲基时, 其抑菌效果最佳, 这可能由于其空间位阻小, 易于进攻受体蛋白的原因.取代基为2-溴苯基、2-羟基苯基和2-氯苯基时, 抑菌效果较甲基取代差, 这也与他们存在较大的空间位阻有关.

  表 2

  

  表 2  化合物与蛋白(5E9H)的对接能量, 氢键, 活性位点和抑制常数K_i

  Table 2.  Docking energy, hydrogen bonding, the residue of active site and inhibition constant K_i of compound with protein (5E9H)

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  5E9H	Docking energy/ (kcal·mol-1)	Hydrogen bond	Residue of active site	Ki/(µmol·L-1)
  M1-1	-4.65	SER434; ARG252	LYS213; ASP128; CYS215; GLY216; HIS217; ASN432; SER436; LEU467; THR466; TPR109; TYR104	389.25
  M2-1	-2.27	ASN432; TYR104	GLU206; LYS213; ASP123; TYR104; SER106; TRP108; THR466; SER436; HIS217; ASN432; CYS215; TRP402	4050
  M2-2	-3.26	TRP108; ASP123; GLY216	GLU206; LYS213; ASP123; LYS213; GLU206; CYS215; GLU404; HIS217; THR466; TRP108; TYR104; SER106; GLY107; ASP177	2170
  M2-3	-3.85	LYS213; AG252; ASP123; THR466	PHE437; TRP439; PRO435; ILE465; HIS471; THR472; LEU475	1520
  Lig	-7.05	ARG252; GLU404; GLY216; LYS213	LYS213; GLY216; GLU404; TRP402; ASP123	6.77

  2.   结论

  采用活性拼接原理合成了4种新型含嘧啶环的1, 2, 4-三唑席夫碱化合物.通过室内毒理实验和分子对接法研究其抑菌活性和抑菌机理.结果表明, 三唑环上5位取代基对生物活性产生一定的影响.菌丝生长速率法结果表明, 当5位取代基为甲基时, 化合物的抑菌活性较高, 即M1-1对不同被测菌种的抑菌效果最优. 4种化合物对小麦赤霉菌的抑制效果最佳, 其抑制顺序为M1-1＞M2-3＞M2-2＞SD＞M2-1, 即甲基取代＞2-溴苯基取代＞2-羟基苯基取代＞2-氯苯基取代.从理论上通过分子对接得出, 化合物对小麦赤霉菌作为受体蛋白的抑制顺序为M1-1＞M2-3＞M2-2＞M2-1, 这也与生物活性测试结果一致.因此, 化合物M1-1、M2-2及M2-3可作为先导化合物进行进一步研究.

  3.   实验部分

  3.1   试剂与仪器

  所使用的试剂均为市售分析纯, 且使用前未经纯化.真菌有葡萄黑豆菌(Grape anthracnose), 苹果轮纹菌(Botryosphaeria berengriana), 苹果干腐菌(Botryo sphaeria ribis), 小麦赤霉菌(Wheat gibberellic), 玉米粗缩菌(Maize rough dwarf bacteria)及马铃薯干腐菌(Potato dry rot fungus), 菌种均由西北农林科技大学生命科技学院提供.

  ELEMENTAR公司的Vario EL III元素分析仪; Bruker公司的EQUINOX 55 FT-IR光谱仪, 其测量范围在400~4000 cm^－1之间; AV400和600 NMR光谱仪(Bruker), 以DMSO-d₆作为溶剂, 四甲基硅烷(TMS)作为内标物.中间体4-氨基-5-甲基-1, 2, 4-三唑-3-硫酮(M1)采用文献^{[1, 10~12]}方法合成, 4-氨基-5-芳基- 1, 2, 4-三唑-3-硫酮(M2)按照文献[13~17]方法合成.

  3.2   实验方法

  将2 mmol的4, 6-二氯-5-嘧啶甲醛完全溶于5 mL冰乙酸中, 按照等物质的量比缓慢加入2 mmol中间体M1/M2.在110 ℃下回流反应, 采用TLC [V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝5:7]跟踪反应过程至终点.反应完全后, 将反应混合物倒入碎冰中冷却, 过滤得到固体物质, 用冰水洗涤三次, 干燥, 用无水乙醇进行重结晶后得到目标化合物.

  4-((4, 6-二氯嘧啶-5-基)亚甲基氨基)-5-甲基-2H- 1, 2, 4-三唑-3(4H)-硫酮(M1-1):淡黄色粉末, 产率67.3%. m.p. 200.2~201.8 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.87 (s, 1H, Triazole), 9. 84 (s, 1H, Pyrimidine), 8.75 (s, 1H, CH＝N), 2.10 (s, 3H, Py-CH₃); IR (KBr) ν: 2977, 1696, 1638, 1561, 1516 cm^-1. Anal. calcd for C 33.23, H 2.09, N 29.07; found C 33.02, H 2.13, N 29.14.

  4-((4, 6-二氯嘧啶-5-基)亚甲基氨基)-5-(2-氯苯基)- 2H-1, 2, 4-三唑-3(4H)-硫酮(M2-1):淡黄色粉末, 产率64.8%. m.p.＞300 ℃, ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.78 (s, 1H, Triazole), 8.09 (s, 1H, CH＝N), 7.83 (s, 1H, Pyrimidine), 7.68~7.51 (m, 4H, Ph); IR (KBr) ν: 3073, 1817, 1657, 1593, 1471 cm^-1. Anal. calcd for C 40.49, H 1.83, N 21.79; found C 41.04, H 1.92, N 21.83.

  4-((4, 6-二氯嘧啶-5-基)亚甲基氨基)-5-(2-羟基苯基)-2H-1, 2, 4-三唑-3(4H)-硫酮(M2-2):淡黄色粉末, 产率70.3%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.75 (s, 1H, Triazole), 10.09 (s, 1H, CH＝N), 8.21 (s, 1H, Pyrimidine), 8.08 (s, 1H, Ar-OH), 6.82~6.56 (s, 4H, Ph); IR (KBr) ν: 2977, 1778, 1670, 1587, 1394, 1253, 786 cm^－1. Anal. calcd for C 42.52, H 2.20, N 22.89; found C 42.89, H 2.03, N 21.78.

  4-((4, 6-二氯嘧啶-5-基)亚甲基氨基)-5-(2-溴苯基)- 2H-1, 2, 4-三唑-3(4H)-硫酮(M2-3):淡黄色粉末, 产率74.1%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.84 (s, 1H, Triazole), 8.14 (s, 1H, CH＝N), 7.84 (s, 1H, Pyrimidine), 7.68~7.51 (m, 4H, Ph); IR (KBr) ν: 2989, 1772, 1650, 1593, 1394, 1253, 786 cm^-1. Anal. calcd for C 36.30, H 1.64, N 19.54; found C 37.03, H 1.62, N 19.32.

  3.3   室内生物活性测试

  采用菌丝生长速率法对合成的化合物M1-1, M2-1, M2-2, M2-3以及标准药物氟康唑(SD)对6种植物真菌进行生物活性研究^[26].

  将待测化合物和标准药物(SD)分别溶于N, N-二甲基甲酰胺(2 mL)中, 测试其在不同浓度(2, 4, 8和16 mg/L)下的生物活性.采用十字交叉法测量平板上真菌菌落的直径, 采用公式(1)计算抑制率.

  $ 抑制率\left( \% \right) = \frac{{{\rm{d}}c - {\rm{d}}t}}{{{\rm{d}}c}} \times 100\% $

  式中, dc为空白对照的平均菌落直径(mm), dt为用药物板的平均菌落直径(mm).

  药剂浓度的对数值x与抑制率的几率值Y得出毒力回归方程、相关系数r以及EC₅₀和EC₉₅值^[27].

  3.4   分子对接

  对接的受体蛋白从蛋白质结构数据库中获得, 蛋白编码为5E9H.对接前用Chimera 1.11.2软件除去蛋白结构中的原配体分子Lig (1, 1, 3, 3-四醇丙烷), 通过蛋白受体中原有的配体获得对接口袋.选择遗传算法(GA)将4个种席夫碱化合物与受体蛋白进行对接, 并进行50次GA运行.对接成功后, 按照对接能量排序选取前20组构象作为最优构象.

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  图式 1  目标化合物的合成

  Scheme 1  Synthetic route of target compounds

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  图式 2  4-氨基-5-甲基-1, 2, 4-三唑-3-硫酮(M1)的合成

  Scheme 2  Synthesis of 4-amino-5-methyl-1, 2, 4-triazole-3- thione (M1)

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  图式 3  4-氨基-5-芳基-1, 2, 4-三唑-3-硫酮(M2)的合成

  Scheme 3  Synthesis of 4-amino-5-aryl-1, 2, 4-triazole-3-thione (M2)

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  图 1  化合物M1-1 (▅), M2-1 (), M2-2 (), M2-3 ()和SD ()对6种植物病菌的EC₅₀值

  Figure 1  EC₅₀ values of compounds M1-1 (▅), M2-1 (), M2-2 (), M2-3 () and SD () against six plant pathogens

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  图 2  5E9H与目标化合物的3D(左)和2D(右)对接模式

  Figure 2  3D (left) and 2D (right) docking modes of 5E9H with target compounds

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  表 1  化合物对六种真菌的测定结果^a

  Table 1.  Results of compounds against six plant pathogens

  化合物	病菌名称	毒力回归方程	相关系数(r)	EC50/(mg·L-1)	EC95/(mg·L-1)
  M1-1	小麦赤霉菌	Y＝3.3474+1.9509x	0.9600	4.03	49.00
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.6373+1.7585x	0.9929	5.95	51.32
  	苹果轮纹菌	Y＝3.5142+1.4314x	0.9631	10.91	153.86
  	苹果干腐菌	Y＝3.3665+1.5167x	0.9600	11.94	145.04
  	玉米粗缩菌	Y＝3.2724+1.7587x	0.9853	9.60	82.71
  	马铃薯干腐菌	Y＝4.1296+0.6115x	0.9581	26.50	—
  M2-1	小麦赤霉菌	Y＝3.8573+0.9450x	0.9975	16.18	890.82
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.7873+1.5801x	0.9969	5.85	64.33
  	苹果轮纹菌	Y＝3.5662+1.0763x	0.9798	21.48	725.11
  	苹果干腐菌	Y＝3.6334+1.2576x	0.9930	12.20	248.08
  	玉米粗缩菌	Y＝3.5373+1.4696x	0.9581	9.89	130.18
  	马铃薯干腐菌	Y＝3.7753+0.8238x	0.7571	30.66	—
  M2-2	小麦赤霉菌	Y＝3.2158+1.7933x	0.9746	9.88	81.68
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.6037+1.8117x	0.9991	5.89	47.71
  	苹果轮纹菌	Y＝2.7910+1.6951x	0.9943	20.09	187.72
  	苹果干腐菌	Y＝3.6999+0.8198x	0.9674	38.53	—
  	玉米粗缩菌	Y＝3.5408+1.8859x	0.9777	5.93	44.25
  	马铃薯干腐菌	Y＝3.3665+1.5167x	0.7479	25.44	—
  M2-3	小麦赤霉菌	Y＝4.0715+1.3861x	0.9956	4.67	71.86
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.3786+1.9038x	0.9871	7.10	51.95
  	苹果轮纹菌	Y＝3.2165+1.7136x	0.9870	10.98	100.15
  	苹果干腐菌	Y＝3.5360+1.2333x	0.9918	15.38	331.71
  	玉米粗缩菌	Y＝3.3792+1.7967x	0.9877	7.98	65.70
  	马铃薯干腐菌	Y＝3.7641+0.8454x	0.7519	28.96	—
  SD	小麦赤霉菌	Y＝3.4009+1.5462x	0.9383	10.81	125.31
  	葡萄黑豆菌	Y＝3.7394+2.1295x	0.9861	3.90	23.14
  	苹果轮纹菌	Y＝5.0875+0.9620x	0.8987	0.81	41.57
  	苹果干腐菌	Y＝5.0010+0.8915x	0.9699	0.99	69.81
  	玉米粗缩菌	Y＝4.1356+1.2712x	0.9916	4.78	94.17
  	马铃薯干腐菌	Y＝4.7788+0.7018x	0.9807	2.06	455.98
  a SD:标准药物; “—”: EC95值大于1000 mg/L.

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  表 2  化合物与蛋白(5E9H)的对接能量, 氢键, 活性位点和抑制常数K_i

  Table 2.  Docking energy, hydrogen bonding, the residue of active site and inhibition constant K_i of compound with protein (5E9H)

  5E9H	Docking energy/ (kcal·mol-1)	Hydrogen bond	Residue of active site	Ki/(µmol·L-1)
  M1-1	-4.65	SER434; ARG252	LYS213; ASP128; CYS215; GLY216; HIS217; ASN432; SER436; LEU467; THR466; TPR109; TYR104	389.25
  M2-1	-2.27	ASN432; TYR104	GLU206; LYS213; ASP123; TYR104; SER106; TRP108; THR466; SER436; HIS217; ASN432; CYS215; TRP402	4050
  M2-2	-3.26	TRP108; ASP123; GLY216	GLU206; LYS213; ASP123; LYS213; GLU206; CYS215; GLU404; HIS217; THR466; TRP108; TYR104; SER106; GLY107; ASP177	2170
  M2-3	-3.85	LYS213; AG252; ASP123; THR466	PHE437; TRP439; PRO435; ILE465; HIS471; THR472; LEU475	1520
  Lig	-7.05	ARG252; GLU404; GLY216; LYS213	LYS213; GLY216; GLU404; TRP402; ASP123	6.77

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