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系列红色染料的合成、光学性质及在蛋白标记中的应用

李慧芳 ,  冷鑫 ,  闫立润 ,  杨秉勤 ,  白银娟

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引用本文: 李慧芳, 冷鑫, 闫立润, 杨秉勤, 白银娟. 系列红色染料的合成、光学性质及在蛋白标记中的应用[J]. 有机化学, 2019, 39(3): 793-799. doi: 10.6023/cjoc201807036 shu
Citation:  Li Huifang, Leng Xin, Yan Lirun, Yang Bingqin, Bai Yinjuan. A Series of Red Dyes: Synthesis, Optical Properties and Application in Protein Labeling[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2019, 39(3): 793-799. doi: 10.6023/cjoc201807036 shu

系列红色染料的合成、光学性质及在蛋白标记中的应用

  • 西北大学化学与材料科学学院 合成与天然功能分子化学教育部重点实验室 西安 710127

    • 通讯作者: Yang Bingqin, E-mail: yangbq@nwu.edu.cn; Bai Yinjuan, E-mail: baiyinjuan@nwu.edu.cn
  • 基金项目:

    国家自然科学基金（No.21172178）资助项目

摘要: 以3-N，N-二乙基氨基酚为原料合成了一系列荧光染料，用1H NMR，13C NMR，IR，HRMS对结构进行了表征，检测了新型染料的光学性质，标记了牛血清白蛋白，比较了新染料与菁染料（Cy3）在凝集素微阵列芯片上的荧光信号值.结果显示，新型染料的最大发射波长均在600 nm以上，斯托克斯位移约70 nm左右，染料/蛋白质（D/P）标记效率高达1.5~1.8，在凝集素微阵列中新染料和Cy3的荧光信号值相当.表明新染料可以作为荧光标记物用于凝集素微阵列中检测糖链的变化.

English

  • 蛋白质糖基化是最常见的翻译后修饰(PTM)之一.它涉及在蛋白质骨架的特定位点上附着碳水化合物[1~4].因此聚糖在涉及健康和疾病的生理事件中起着关键的作用[5~7].目前在糖链结构的解析中, 荧光标记的凝集素微阵列芯片技术成为主要的方法[8], 该方法可高通量、系统、灵敏地检测待测样品表面糖链与凝集素的特异性结合反应, 并且固定凝集素的方式简单、快速且成本较低.在使用的各种荧光标记染料中, 近红外染料(＞600 nm)的应用研究引起了人们较大的兴趣, 这类染料对生物样品光损伤小, 组织穿透深度大, 且生物分子的背景荧光干扰小[9~11], 在荧光标记的凝集素微阵列芯片技术的应用中, 目前使用较多的是菁染料系列[12~20], 它们能较好地通过共价偶联对纯化的生物大分子进行标记[21].但这类染料也因结构的差异存不同的缺点.有些染料斯托克斯位移较小, 应用过程中常常导致自猝灭现象的发生, 造成荧光检测中的误差, 有些染料光学性能虽好, 但合成过程复杂, 价格昂贵, 限制或降低了使用范围.如何开发出光学性能良好且价格低廉的新型荧光染料用于标记蛋白, 是一项具有现实意义的研究课题.

    我们课题组在查阅大量文献资料的基础上, 设计合成了一系列氧杂多环结构荧光染料HQ1~HQ4.首先以3-N, N-二乙基氨基酚为原料以3步反应且较高收率得到系列新型红色荧光染料HQ1~HQ4, 发射波长均大于600 nm.用1H NMR, 13C NMR, IR, HRMS对结构进行了表征, 检测了新型染料的光学性质, 斯托克斯位移增加到70 nm以上, 具有良好的光稳定性和水溶性.对牛血清白蛋白(BSA)进行标记纯化后测得这些染料的标记蛋白的染料/蛋白质(D/P)值高达1.5~1.9.而且凝集素芯片扫描结果显示, 新染料的荧光信号值与Cy3相当.表明新型染料在有关蛋白标记的研究中具有较好实用价值.

    1.   结果与讨论

    1.1   染料HQ1~HQ4的合成

    标记蛋白的染料分子, 结构中必须具有能够插入蛋白链中的烷基链羧基或氨基, 设计合成了带有支链羧基的目标化合物HQ1~HQ4, 合成路线如Scheme 1所示.将3-N, N-二乙基氨基酚和氢氧化钠溶于乙腈中, 反应3 h后加入对甲苯磺酸甲酯反应6 h, 得到中间体a, 产率95%.用中间体a和琥珀酸酐通过傅克酰基化反应合成中间体b.中间体b在强酸甲烷磺酸中与取代的茚酮d1~d4反应生成目标化合物HQ1~HQ4, 产率约70%.

    图式 1

    图式 1.  荧光染料HQ1~HQ4的合成
    Scheme 1.  Synthesis of fluorescent dyes HQ1~HQ4
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    1.2   染料HQ1~HQ4的光学性能

    染料HQ1~HQ4在不同溶剂中的吸收光谱和发射光谱如图 1和2.光谱图中所用的溶液浓度为1×10-5mol•L-1, 相关数据在表 1中.从表 1看出这些染料在不同溶剂中发射波长均在600 nm以上, 而且斯托克斯位移在70 nm以上.染料中不同取代基团CH3, H, Cl, Br在不同溶剂中, 荧光发射波长相差不大.同时发现不同溶剂对这些化合物吸收波长影响不大, 但对吸光度有明显影响(图 1, 2).在二甲基亚砜(DMSO)中可见光区没有明显的吸收峰, 在水、甲醇和DMSO中的荧光强度较弱, 在二氯甲烷中染料HQ1~HQ4系列荧光强度较强.这些现象可能是溶剂的极性所致, 染料分子与极性溶剂之间发生了不同程度的配位作用, DMSO配位作用较大导致吸光度最小.

    图 1

    图 1.  HQ1在各种溶剂中的吸收光谱
    Figure 1.  Absorption spectra of HQ1 in different solvents
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    图 2

    图 2.  HQ1在各种溶剂中的发射光谱(激发波长: 535 nm)
    Figure 2.  Emission spectra of HQ1 in different solvents (λex: 535 nm)
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    表 1

    表 1  染料HQ1~HQ4在不同溶剂中的光谱数据
    Table 1.  Spectral data of the dyes HQ1~HQ4in different solvents
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    Dye Solvent λabs/nm λem/nm Stokes shift/nm εmax/(L•mol-1•cm-1) ΦFa/%
    HQ1 CH3OH 532 607 75 15200 17
    CH2Cl2 534 602 68 15600 35.6
    H2O 535 609 74 17600 3.4
    DMSO — 605 — — —
    HQ2 CH3OH 534 609 75 21600 27
    CH2Cl2 537 604 67 13200 71.2
    H2O 531 609 78 19800 3.3
    DMSO — 604 — — —
    HQ3 CH3OH 532 610 78 5800 12
    CH2Cl2 535 610 75 7300 23.4
    H2O 530 614 84 14000 2.8
    DMSO — 607 — — —
    HQ4 CH3OH 536 604 68 10000 15
    CH2Cl2 535 610 75 14300 64.5
    H2O 532 607 75 10000 2.4
    DMSO — 610 — — —
    aϕF is the relative fluorescence quantum yield estimated by using Rhodamine B as a fluorescence standard.

    优良的光稳定性是近红外染料的重要指标之一[22].采用连续照射法进行了光稳定性测试(图 3).在磷酸缓冲液(PBS)中, 将染料HQ1~HQ4放置在500 W碘钨灯下连续照射, 以紫外吸收强度为输出信号, 每隔10 min检测一次, 60 min后, HQ1~HQ4的紫外吸收强度随着时间的延长始终在96%以上, 表明这些红色染料具有良好的光稳定性.

    图 3

    图 3.  化合物HQ1~HQ4在PBS中的光稳性
    Figure 3.  Photostability of the compounds HQ1~HQ4 in PBS
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    在生物学研究中, 染料对于酸碱度的敏感程度是需考虑的一大因素.目标染料在pH 3.12~11.13的范围中, 荧光强度变换的归一化的曲线如图 4所示.染料HQ1~HQ4在pH 6.17~9.21范围内具有很强的荧光, 此范围正是处于生命体或生物大分子适宜的pH范围, 说明染料HQ1~HQ4在生物学应用中有着较好的适应条件.

    图 4

    图 4.  HQ1~HQ4在不同pH下的荧光特性
    Figure 4.  Fluorescence characteristics of HQ1~HQ4under different pH
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    染料在水中的溶解度也是衡量染料性能的重要指标. 图 5显示了HQ1~HQ4在PBS中的工作曲线, 表 2列出了相应的溶解度数据.可以看出染料HQ1~HQ4溶解度在(3.23.2±0.18)×10-2和(6.96.9±0.22)×10-2 mg/mL之间.其中HQ3的溶解性最好.

    图 5

    图 5.  HQ4在PBS溶液中的工作曲线
    Figure 5.  Working curve of HQ4 in PBS solution
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    表 2

    表 2  HQ1~HQ4在PBS溶液中的溶解度
    Table 2.  Solubility of HQ1~HQ4 in PBS solution
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    Dye Absorbance/a.u. Maximum solubility/(10-2 mg•mL-1)
    HQ1 2.5±0.10 3.2±0.18
    HQ2 2.9±0.10 5.3±0.16
    HQ3 5.5±0.10 8.3±0.15
    HQ4 3.1±0.10 6.9±0.22

    1.3   染料-BSA共轭物

    1.3.1   染料-BSA共轭物与游离染料的光学性质对比

    图 6和7分别是染料-BSA的紫外吸收和荧光发射图, 相应的光谱数据归纳在表 3中.由表 3可知, 这些染料-BSA共轭物的紫外-可见吸收和荧光光谱分别在500~520和540~570 nm之间, 而游离染料的紫外-可见吸收和荧光光谱分别在524和600 nm以上.与游离染料相比, 染料-BSA共轭物发生蓝移.比如HQ1共价结合前紫外吸收在524 nm荧光发射在608 nm, 共价结合后, 蓝移至498/553.4 nm.值得注意的是所有染料在共价结合后都有明显的荧光增强.例如HQ1-BSA在PBS中的荧光量子产率达到6.7%左右, 是游离染料的2倍.这种荧光增强效应是由染料结合蛋白质后形成刚性微环境导致[23], 对提高荧光标记蛋白质的检测灵敏度非常有意义.

    图 6

    图 6.  染料-BSA在PBS中的吸收光谱和发射光谱
    Figure 6.  Absorption a spectra of dye-BSA in PBS
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    图 7

    图 7.  染料-BSA在PBS中的发射光谱(激发波长: 495 nm)
    Figure 7.  Emission spectra of dye-BSA in PBS (λex: 495 nm)
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    表 3

    表 3  PBS中游离染料HQ1~HQ4和染料-BSA的光谱数据
    Table 3.  Spectral data of free dyes HQ1~HQ4 and dye-BSA in PBS
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    Dye λabs/λem/nm Stokes shift/nm ΦFa/% ΦFdye-BSA/ΦFdye
    HQ1 528/608 80 3.5
    HQ2 524/608 84 2.8
    HQ3 524/614 90 5.1
    HQ4 530/605 75 2.5
    HQ1-BSA 498/553 55 6.7 1.9
    HQ2-BSA 522/541 19 3.4 1.2
    HQ3-BSA 516/567 51 5.7 1.1
    HQ4-BSA 526/565 39 3.2 1.3
    1.3.2   染料的D/P值的计算

    在相同的测试条件下, 以BSA为模型蛋白, 用目标染料对其进行标记, 标记纯化后计算这些染料的标记效率如表 4所示, 这些染料的D/P在1.5~1.9.在生物标记中标记蛋白质最适合的D/P为1.0~2.0[24].因此新染料HQ1~HQ4对蛋白质有较高的标记效率.随着取代基团CH3, H, Cl, Br的变化, HQ系列荧光染料的蛋白标记效率表现为HQ1≈HQ4＜HQ2＜HQ3, 说明取代基为甲基和氯原子的标记效果稍逊于溴原子和氢原子.

    表 4

    表 4  染料HQ1~HQ4对于BSA的D/P值
    Table 4.  D/P of HQ1~HQ4 dye for BSA
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    Dye HQ1 HQ2 HQ3 HQ4
    D/P 1.53 1.74 1.97 1.52

    1.4   凝集素微阵列中新染料HQ1~HQ4与Cy3荧光信号值的比较

    新染料HQ1~HQ4成功地将血清和唾液两种糖蛋白进行了标记, 之后与Cy3的标记效果进行了对比(图 8), 并与凝集素芯片成功地进行了杂交.以染料HQ1为例, 杂交斑点形态为圆形, 没有遗漏点及连点, 说明芯片制作很成功.此外从斑点杂交看出, 染料HQ1与糖蛋白的结合不影响糖蛋白与凝集素的结合.用GenePix 3.0软件计算了每种糖聚糖结构的凝集素荧光信号值的百分比.如图 9所示, 在血清中凝集素ECA, HHL, GSL-Ⅱ, PHA-E, SJA, PNA, EEL, LTL, LEL, PSA, VVA和SBA荧光强度均低于Cy3.但凝集素AAL, WFA, PTL-Ⅰ, GSL-Ⅰ, RCA120, STL, PTL-Ⅱ, DSA, NPA, ACA, UEA-Ⅰ, PWM和SNA荧光强度均显著高于Cy3.其它凝集素与Cy3基本持平.在唾液中凝集素GSL-Ⅱ, SJA, LTL, MPL, LEL, DBA, ConA, SBA, VVA, PSA, ACA, SNA, BPL, MAL, PWM荧光强度均低于Cy3, 而凝集素Jacalin, ECA, HHL, WFA, MAL-Ⅱ, PHA-E, PTL-Ⅰ, AAL, RCA120, STL, BSI、PTL-Ⅱ, UEA-Ⅰ和PHA-E+L荧光强度均显著高于Cy3.其它凝集素与Cy3基本持平.这些结果表明, 新染料可以作为糖蛋白的标记物用于凝集素微阵列中分析有关糖链的变化.

    图 8

    图 8.  环氧幻灯片上Cy3-糖基化和新染料-糖基化后与凝集素阵列的结合图
    Figure 8.  Cy3-glycosylation and new dye-glycosylation binding to lectin array on epoxide slides
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    图 9

    图 9.  用Genepix5.1软件对图 8的幻灯片进行分析
    Figure 9.  Graphical representation of the array data from the slide shown in Figure 8

    Slides were analyzed by using the Genepix 5.1 software. The average of the median fluorescence signal (arbitrary units) for a single slide is taken. Standard deviations were calculated by using Microsoft Excel. Solid line: Cy3, Dotted line: HQ1

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    2.   结论

    设计合成了一系列氧杂多环结构染料HQ1~HQ4, 通过IR, HRMS-ESI, 1H NMR, 13C NMR对其结构进行了表征.光谱数据表明, 染料HQ1~HQ4最大发射波长在600 nm以上, 斯托克斯位移在70 nm左右.标记蛋白的染料/蛋白质(D/P)值高达1.5~1.9, 适合生物标记.在凝集素微阵列中新染料和Cy3的荧光信号值相当.因此在生物标记方面有很好的应用前景.

    3.   实验部分

    3.1   仪器与试剂

    F-4500荧光分光度计(日立, 东京, 日本); UV-1700紫外-可见光谱仪(Purkinje General); XT-4显微熔点仪(北京泰克仪器有限公司); OTOF-Q Ⅱ ESI-QTOF LC/MS/MS高分辨质谱仪(德国布鲁克公司); Avance Ⅲ-400 MHz核磁共振测量仪(德国布鲁克公司); Genepix 4000B芯片扫描仪(Axon, USA); 晶芯48点样仪(北京博奥生物).所有溶剂均为分析纯且无需纯化即可使用.

    3.2   染料的合成与表征

    中间体a和b参考相关文献合成[25, 26], 化合物HQ1~HQ4的合成参考并改进文献方法得到[27].以化合物HQ1合成为例, 称取1.6 g (10 mmol)的3-N, N-二乙基氨基酚和0.4 g (10 mmol)的NaOH, 混合后溶于60 mL乙腈中, 室温下搅拌2~3 h, 后滴加1.5 mL对甲苯磺酸甲酯并升温至40 ℃, 再反应4~6 h.反应结束后过滤得到粗产物, 用石油醚/乙酸乙酯(V:V=10:1)过柱分离, 得到中间体a, 产率95%.

    将1.4 g (8 mmol)中间体a, 1.2 g (12 mmol)丁二酸酐与3.7 g (28 mmol)无水氯化铝溶于100 mL CH2Cl2中, 室温搅拌8~10 h, 之后加入50 mL 1 mol•L-1 HCl水溶液, 搅拌成为黄色浑液体, 用CH2Cl2/饱和食盐水(V: V=1:1)萃取, 再无水硫酸钠充分干燥后旋去溶液, 用乙酸乙酯/石油醚(V:V=1:1)过柱分离, 得中间体b, 产率30%.

    将0.53 g (2 mmol)中间体b与0.5 g (3 mmol) 6-甲基茚酮溶于甲磺酸(8 mL)中, 在90 ℃下搅拌12 h, 自然冷却后加入15 g冰水混合物, 再用CH2Cl2/饱和食盐水(V:V=1:1)萃取得到粗产物.粗品经二氯甲烷/甲醇(V:V=10:1)过柱分离得到目标化合物HQ1, 产率70%.化合物HQ3, HQ4的合成方法类似HQ1.

    10-(2-羧乙基)-7-(二乙基氨基)-3-甲基-11H-茚并[1, 2-b]苯并吡喃-5-鎓(HQ1):红色固体(0.37 g), 产率50%. m.p. 101~102 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.42 (d, J=9.6 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.67 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.58~7.49 (m, 1H), 7.30 (dd, J=9.7, 2.1 Hz, 1H), 6.95 (d, J=2.2 Hz, 1H), 4.24 (s, 2H), 3.75~3.54 (m, 4H), 3.25 (t, J=7.4 Hz, 2H), 2.53 (s, 3H), 1.38 (t, J=7.1 Hz, 6H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 173.2, 167.9, 161.2, 158.7, 155.1, 145.3, 138.9, 135.5, 133.0, 129.4, 128.2, 126.5, 122.6, 117.5, 116.2, 97.0, 45.8, 33.9, 32.5, 25.6, 21.4, 12.9; IR (KBr) ν: 3419, 2923, 2852, 1635, 1546, 1511, 1346, 1203, 1074, 788 cm-1; HRMS (ESI) calcd for C24H26NO3 376.1907, found 376.1920.

    10-(2-羧乙基)-7-(二乙基氨基)-11H-茚并[1, 2-b]吡喃-5-鎓(HQ2):红色固体(0.31 g), 产率48%. m.p. 150~154 ℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ: 8.15 (d, J=9.6 Hz, 1H), 8.04 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.74 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.67 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.56 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.35 (dd, J=9.6, 2.4 Hz, 1H), 7.18 (d, J=2.4 Hz, 1H), 3.64 (q, J=7.1 Hz, 4H), 3.21 (dt, J=3.2, 1.6 Hz, 4H), 2.71 (s, 2H), 1.25 (t, J=7.1 Hz, 6H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 173.9, 169.1, 162.1, 159.7, 156.1, 148.5, 134.9, 133.8, 129.9, 129.7, 128.5, 127.3, 123.4, 118.2, 117.1, 97.6, 46.5, 34.2, 30.2, 27.7, 13.0; IR (KBr) ν: 3419, 2925, 2856, 1725, 1635, 1513, 1346, 1267, 1083, 725 cm-1; HRMS (ESI) calcd for C23H24NO3 362.1751, found 362.1768.

    2-溴-10-(2-羧乙基)-7-(二乙基氨基)-11H-茚并[1, 2-b]吡喃-5-鎓(HQ3):红色固体(0.28 g), 产率52%. m.p. 163~164 ℃; 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ: 8.18 (d, J=9.6 Hz, 1H), 8.00~7.82 (m, 2H), 7.70 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.42 (dd, J=9.6, 2.2 Hz, 1H), 7.20 (d, J=2.2 Hz, 1H), 3.74 (q, J=7.1 Hz, 4H), 3.33 (s, 4H), 2.82 (s, 2H), 1.37 (t, J=7.1 Hz, 6H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 173.0, 166.7, 160.9, 158.8, 155.4, 148.9, 132.0, 129.7, 129.5, 129.1, 128.2, 127.3, 123.6, 117.6, 116.6, 97.0, 45.7, 33.2, 31.7, 29.3, 12.1; IR (KBr) ν: 3415, 2923, 1758, 2854, 1633, 1511, 1346, 1116, 1039, 840 cm-1; HRMS (ESI) calcd for C23H23BrNO3 440.0856, found 440.0857.

    10-(2-羧乙基)-2-氯-7-(二乙基氨基)-11H-茚并[1, 2-b]吡喃-5-鎓(HQ4):红色固体(0.36 g), 产率43%. m.p. 209~210 ℃; 1H NMR (400 MHz, CD3CN)δ: 8.42 (d, J=9.6 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.67 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.61~7.51 (m, 1H), 7.30 (d, J=9.6 Hz, 1H), 6.95 (d, J=2.2 Hz, 1H), 4.24 (s, 2H), 3.81~3.53 (m, 4H), 3.25 (t, J=7.4 Hz, 2H), 2.53 (s, 2H), 1.38 (t, J=7.1 Hz, 6H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 173.0, 166.8, 161.0, 158.8, 155.4, 149.0, 139.3, 131.6, 129.2, 129.0, 127.5, 126.5, 123.6, 117.5, 116.5, 96.7, 45.7, 33.2, 31.6, 29.3, 12.0; IR (KBr) ν: 3419, 2923, 2854, 1758, 1635, 1515, 1347, 1120, 1039, 836 cm-1; HRMS (ESI) calcd for C23H23ClNO3 396.1361, found 396.1353.

    3.3   染料的活化和BSA标记过程及染料-蛋白质共轭物的纯化

    先将染料(1 mg)溶于100 μL的无水N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中, 用含有2-吗啉乙磺酸(MES) (0.1 mol• L-1)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (10 mmol•L-1)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC) (10 mmol•L-1)的溶液在37 ℃下活化1.5 h.活化后离心15 min, 用PBS洗涤两次得到活性酯.将活性酯溶于制备好的含BSA (2.5 mg)碳酸氢钠缓冲液(0.5 mL, 50 mmol•L-1, pH 9.4)中, 在25 ℃下混合液搅拌3 h, 形成染料-BSA共轭物, 再用Sephadex G-25离子色谱凝胶柱分离游离染料及染料蛋白结合物.

    3.4   染料与蛋白质比值(D/P)的测定

    对BSA进行标记, 并对相应的游离染料和染料- BSA结合物进行纯化分离后测定游离染料和染料-BSA的吸收光谱.假设染料与BSA结合前后摩尔晓光系数大致相等, 则可使用下列方程计算染料蛋白比率(D/P)[28]

    $\frac{D}{P}=\frac{{{A_{{\rm{conj}}(\lambda \max )}}{\varepsilon _{{\rm{BSA}}}}}}{{{A_{{\rm{conj}}(278)}}-x{A_{{\rm{conj}}(\lambda \max )}}{\varepsilon _{{\rm{dye}}}}}} $

    εdye代表游离染料在最大吸收波长处的摩尔消光系数; εBSA=45540 L•mol-1•cm-1, 代表染料-BSA在278 nm处的摩尔消光系数; x=Adye(278)/Adye(λmax)代表游离染料在278 nm处的吸光度和在最大吸收波长处吸光度的比值; Aconj(λmax)代表染料-BSA复合物在最大吸收波长处的吸光度; Aconj(278)代表染料-BSA复合物在278 nm处的吸光度.

    3.5   凝集素微阵列的制备

    将37种凝集素(从载体实验室Sigma-Aldrich和CalBiochem购买)分别溶解于厂家推荐的缓冲液中, 再分别加入浓度为0.5 mg/mL的BSA构成点样缓冲液.用晶芯48点样系统在环氧修饰后的玻片上进行点样, 再在60%湿度中孵育3 h, 随后在37 ℃抽真空干燥3 h.干燥后先用质量分数为0.05% Tween-20的10 mmol•L-1 PBS, 10 mmol•L-1 PBS各清洗玻片一次, 再用质量分数为1% BSA的10 mmol•L-1 PBS对芯片进行封闭1 h.后用1×PBST, 1×PBS清洗玻片2 min, 离心甩干芯片.将纯化分离后的Cy3-血清或者Cy3-唾液和新染料-血清或者新染料-唾液与封闭好的凝集素微阵列芯片进行杂交, 在37 ℃中孵育3 h后先用1×PBST洗2次, 再用1×PBS冲洗一次, 每次冲洗5 min, 离心干燥后用Genepix 4000B芯片扫描仪扫描芯片, 光电倍增管(PMT)设为100%, 先进行预扫描, 然后选定点样区域精确扫描.调节明亮度和对比度达到最佳视觉效果.用GenePix3.0软件从扫描结果图中获取荧光信号强度值和背景值等信息进行分析.

    辅助材料(Supporting Information)   化合物HQ1~HQ4的HRMS-ESI, 1H NMR, 13C NMR, IR谱图以及其它相关图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

    1. [1]

      Larsen, M. R.; H jrup, P.; Roepstorff, P. Mol. Cell. Proteomics 2005, 4, 107. doi: 10.1074/mcp.M400068-MCP200

    2. [2]

      Baker, J. L.; elik, E.; Delisa, M. P. Trends Biotechnol. 2013, 31, 313. doi: 10.1016/j.tibtech.2013.03.003

    3. [3]

      Zhang, L.; Luo, S.; Zhang, B. mAbs 2016, 8, 524. doi: 10.1080/19420862.2016.1149662

    4. [4]

      Fry, S. A.; Afrough, B.; Lomaxbrowne, H. J.; Lomaxbrowne, H. J.; Timms, J. F.; Velentzis, L. S.; Leathem, A. J. C. Glycobiology 2011, 21, 1060. doi: 10.1093/glycob/cwr045

    5. [5]

      Smit, C. H.; Diepen, A. V.; Nguyen, D. L.; Wuhrer, M.; Hoffmann, K. F.; Deelder, A. M.; Hokke, C. H. Mol. Cell. Proteomics 2015, 14, 1750. doi: 10.1074/mcp.M115.048280

    6. [6]

      Meany, D. L.; Hackler, L.; Zhang, H.; Chan, D. W. J. Proteome Res. 2011, 10, 1425. doi: 10.1021/pr1010873

    7. [7]

      Lee, J. H.; Jeong, Y. R.; Kim, Y. G.; Lee, G. M. Biotechnol. Bioeng. 2017, 1721. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28266015

    8. [8]

      Olkhov, R. V.; Weissenborn, M. J.; Flitsch, S. L.; Shaw, A. M. Anal. Chem. 2013, 86, 621. http://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=17da6a04bcacd5aed5719c00522cde29&site=xueshu_se

    9. [9]

      Kuno, A.; Uchiyama, N.; Kosekikuno, S.; Ebe, Y.; Takashima, S.; Yamada, M.; Hirabayashi, J. Nat. Methods 2005, 2, 851. doi: 10.1038/nmeth803

    10. [10]

      Yamashita, K.; Kuno, A.; Matsuda, A.; Ikehata, Y.; Katada, N.; Hirabayashi, J.; Narimatsu, H.; Watanabe, M. Gastric Cancer 2016, 19, 531. doi: 10.1007/s10120-015-0491-2

    11. [11]

      Uchiyama, N.; Kuno, A.; Tateno, H.; Kubo, Y.; Mizuno, M.; Noguchi, M.; Hirabayashi, J. Proteomics 2008, 8, 3042. doi: 10.1002/pmic.v8:15

    12. [12]

      Goncalves, M. S. T. ChemInform 2009, 40, 190. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19105748/

    13. [13]

      李波, 孟文斐, 杨美盼, 苏娜, 刘晓静, 杨秉勤, 有机化学, 2015, 35, 2629. http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract345189.shtmlLi, B.; Meng, W.-F.; Yang, M.-P.; Su, N.; Liu, X.-J.; Yang, B.-Q. Chin. J. Org. Chem. 2015, 35, 2629(in Chinese). http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract345189.shtml

    14. [14]

      Boyarskiy, V. P.; Belov, V. N.; Medda, R.; Hein, B.; Bossi, M.; Hell, S. W. Chem.-Eur. J. 2008, 14, 1784. doi: 10.1002/(ISSN)1521-3765

    15. [15]

      周佳, 杨美盼, 孟文斐, 成昭, 杨秉勤, 有机化学, 2014, 34, 1646. http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract344393.shtmlZhou, J.; Yang, M.-P.; Meng, W.-F.; Cheng, Z.; Yang, B.-Q. Chin. J. Org. Chem. 2014, 34, 1646(in Chinese). http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract344393.shtml

    16. [16]

      Raghavachari, R. Carbohydr. Polym. 2000, 52, 87.

    17. [17]

      孟文斐, 杨美盼, 成昭, 李少妮, 杨秉勤, 有机化学, 2014, 34, 398. http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract343595.shtmlMeng, W.-F.; Yang, M.-P.; Cheng, Z.; Li, S.-N.; Yang, B.-Q. Chin. J. Org. Chem. 2014, 34, 398(in Chinese). http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract343595.shtml

    18. [18]

      汤昆, 张鹏超, 王升, 邱娜, 张付利, 有机化学, 2016, 36, 1700. http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract345455.shtmlTang, K.; Zhang, P.; Wang, S.; Qiu, N.; Zhang, F. Chin. J. Org. Chem. 2016, 36, 1700(in Chinese). http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract345455.shtml

    19. [19]

      Tolosa, L.; Nowaczyk, K.; Lakowicz, J. SpringerPlus 2002, 139.

    20. [20]

      Markova, L. I.; Terpetschnig, E. A.; Patsenker, L. D. Dyes. Pigm. 2013, 99, 561. doi: 10.1016/j.dyepig.2013.06.022

    21. [21]

      Hosseini, M. S.; Hashemimoghaddam, H. Talanta 2005, 67, 555. doi: 10.1016/j.talanta.2005.01.010

    22. [22]

      Chen, X.; Peng, X.; Cui, A.; , Wang, B.; Wang, L.; Zhang, R. J. Photochem. Photobiol., A 2006, 181, 79. doi: 10.1016/j.jphotochem.2005.11.004

    23. [23]

      Wang, L. Q.; Peng, X. J.; Zhang, R.; Cui, J. N.; Xu, G Q.; Wang, F. Dyes Pigm. 2002, 54, 107. doi: 10.1016/S0143-7208(02)00036-0

    24. [24]

      沈倍奋, 陈志南, 刘民培, 重组抗体, 科学出版社, 北京, 2005, pp. 440~441.Seng, B. F.; Cheng, Z. N.; Liu, M. P. Recombinant Antibody, Science Press, Beijing 2005, pp. 440~441(in Chinese)

    25. [25]

      Ge, J. F.; Arai, C.; Ihara, M. Dyes Pigm. 2008, 79, 33. doi: 10.1016/j.dyepig.2008.01.001

    26. [26]

      Richter, C.; Ernsting, N P.; Mahrwald, R. ChemInform 2016, 47, 1217. https://www.researchgate.net/publication/295503011_Operationally_Simple_and_Selective_One-Pot_Synthesis_of_Hydroxyphenones_A_Facile_Access_to_SNARF_Dyes?ev=auth_pub

    27. [27]

      Liu, J.; Sun, Y. Q.; Wang, P.; Zhang, J.; Guo, W. Analyst 2013, 138, 2654. doi: 10.1039/c3an00061c

    28. [28]

      Mujumdar, S. R.; Mujumdar, R. B.; Grant, C. M.; Waggoner, A. S. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 35. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8816960

  • 图式 1  荧光染料HQ1~HQ4的合成

    Scheme 1  Synthesis of fluorescent dyes HQ1~HQ4

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    图 1  HQ1在各种溶剂中的吸收光谱

    Figure 1  Absorption spectra of HQ1 in different solvents

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    图 2  HQ1在各种溶剂中的发射光谱(激发波长: 535 nm)

    Figure 2  Emission spectra of HQ1 in different solvents (λex: 535 nm)

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    图 3  化合物HQ1~HQ4在PBS中的光稳性

    Figure 3  Photostability of the compounds HQ1~HQ4 in PBS

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    图 4  HQ1~HQ4在不同pH下的荧光特性

    Figure 4  Fluorescence characteristics of HQ1~HQ4under different pH

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    图 5  HQ4在PBS溶液中的工作曲线

    Figure 5  Working curve of HQ4 in PBS solution

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    图 6  染料-BSA在PBS中的吸收光谱和发射光谱

    Figure 6  Absorption a spectra of dye-BSA in PBS

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    图 7  染料-BSA在PBS中的发射光谱(激发波长: 495 nm)

    Figure 7  Emission spectra of dye-BSA in PBS (λex: 495 nm)

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    图 8  环氧幻灯片上Cy3-糖基化和新染料-糖基化后与凝集素阵列的结合图

    Figure 8  Cy3-glycosylation and new dye-glycosylation binding to lectin array on epoxide slides

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    图 9  用Genepix5.1软件对图 8的幻灯片进行分析

    Figure 9  Graphical representation of the array data from the slide shown in Figure 8

    Slides were analyzed by using the Genepix 5.1 software. The average of the median fluorescence signal (arbitrary units) for a single slide is taken. Standard deviations were calculated by using Microsoft Excel. Solid line: Cy3, Dotted line: HQ1

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    表 1  染料HQ1~HQ4在不同溶剂中的光谱数据

    Table 1.  Spectral data of the dyes HQ1~HQ4in different solvents

    Dye Solvent λabs/nm λem/nm Stokes shift/nm εmax/(L•mol-1•cm-1) ΦFa/%
    HQ1 CH3OH 532 607 75 15200 17
    CH2Cl2 534 602 68 15600 35.6
    H2O 535 609 74 17600 3.4
    DMSO — 605 — — —
    HQ2 CH3OH 534 609 75 21600 27
    CH2Cl2 537 604 67 13200 71.2
    H2O 531 609 78 19800 3.3
    DMSO — 604 — — —
    HQ3 CH3OH 532 610 78 5800 12
    CH2Cl2 535 610 75 7300 23.4
    H2O 530 614 84 14000 2.8
    DMSO — 607 — — —
    HQ4 CH3OH 536 604 68 10000 15
    CH2Cl2 535 610 75 14300 64.5
    H2O 532 607 75 10000 2.4
    DMSO — 610 — — —
    aϕF is the relative fluorescence quantum yield estimated by using Rhodamine B as a fluorescence standard.
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    表 2  HQ1~HQ4在PBS溶液中的溶解度

    Table 2.  Solubility of HQ1~HQ4 in PBS solution

    Dye Absorbance/a.u. Maximum solubility/(10-2 mg•mL-1)
    HQ1 2.5±0.10 3.2±0.18
    HQ2 2.9±0.10 5.3±0.16
    HQ3 5.5±0.10 8.3±0.15
    HQ4 3.1±0.10 6.9±0.22
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    表 3  PBS中游离染料HQ1~HQ4和染料-BSA的光谱数据

    Table 3.  Spectral data of free dyes HQ1~HQ4 and dye-BSA in PBS

    Dye λabs/λem/nm Stokes shift/nm ΦFa/% ΦFdye-BSA/ΦFdye
    HQ1 528/608 80 3.5
    HQ2 524/608 84 2.8
    HQ3 524/614 90 5.1
    HQ4 530/605 75 2.5
    HQ1-BSA 498/553 55 6.7 1.9
    HQ2-BSA 522/541 19 3.4 1.2
    HQ3-BSA 516/567 51 5.7 1.1
    HQ4-BSA 526/565 39 3.2 1.3
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    表 4  染料HQ1~HQ4对于BSA的D/P值

    Table 4.  D/P of HQ1~HQ4 dye for BSA

    Dye HQ1 HQ2 HQ3 HQ4
    D/P 1.53 1.74 1.97 1.52
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  • 发布日期:  2019-03-25
  • 收稿日期:  2018-07-22
  • 修回日期:  2018-09-11
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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