English

• 亚硝酰氢(HNO)是一氧化氮(NO)单电子还原并质子化的产物, 生命体内可以由一氧化氮合成酶(NOS)氧化降解L-精氨酸而成. HNO具有独特的化学性质, 可以与生命体内的巯基化合物、金属离子以及金属蛋白发生相互作用, 在多种生理和病理过程中发挥着重要的作用^[1~3].自从被发现以来, HNO在调节心血管系统、免疫系统和神经系统等方面引起研究者的广泛关注^[4~6].此外, HNO还可以刺激心血管舒张和抑制乙醛脱氢酶活性, 已经作为治疗心脏衰竭和酗酒的潜在药物^{[7, 8]}.

  溶酶体被称为细胞的“清道夫”, 是细胞正常生长所需的重要细胞器, 可以通过自噬过程调节细胞的新陈代谢^[9].研究表明, NO可以与溶酶体外部相关蛋白发生相互作用, 进而引发溶酶体的自噬过程^[10].在超氧化物歧化酶催化下, HNO可以与NO相互转化^[11].因此, 开发可视化溶酶体内HNO的荧光方法对进一步研究HNO在溶酶体自噬过程中的作用具有重要意义.

  目前, 多种检测HNO的荧光探针被报道, 这些探针主要基于三种识别原理^{[12, 13]}: HNO将Cu(Ⅱ)还原成Cu(Ⅰ)^{[14, 15]}, HNO将氮氧化合物还原成羟胺^[16]; HNO与三苯基膦发生施陶丁格反应(Staudinger)^{[17~26, 28~30]}.虽然这些荧光探针能够选择性检测HNO, 但是大部分探针属于单光子激发的荧光探针^[17~26].相比于单光子激发, 双光子激发的荧光探针使用近红外光作为激发光源, 具有长波长激发、较低的自发荧光干扰、较小的光损伤、较少的光漂白和较深的组织穿透深度等优点^[28~30]. 1, 8-萘酰亚胺是一种经典的荧光染料^[31~34], 它具有典型的电子供体-π-电子受体(D-π-A)双光子荧光染料结构, 具有易于合成、光稳定性好、斯托克斯位移大等特点, 已经被广泛用于组织深层次双光子成像^[35~37].

  本文以4-(2-氨基乙基)-吗啉为溶酶体靶向基团, 1, 8-萘二甲酰亚胺为双光子荧光团, 三苯基膦作为HNO识别基团, 经过4步简单有机合成, 得到一个能够特异性定位于溶酶体的打开型双光子HNO荧光探针(Lyso- HNO), 测试了探针对HNO的选择性和灵敏性, 研究了探针对细胞溶酶体内HNO的共聚焦成像.

  1.   结果与讨论

  1.1   荧光探针Lyso-HNO的设计

  HNO是生命体内重要的活性物种, 参与多种生命调节过程.当前报道的HNO荧光探针可以用于检测细胞内HNO, 但是它们多为单光子激发的荧光探针.探针Lyso-HNO以萘酰亚胺作为双光子激发荧光染料, 这种近红外光作为激发光源在降低光损伤和光漂白方面更具有优势, 更利于活细胞荧光成像.同时, 探针Lyso-HNO具有溶酶体定位功能, 能够用于溶酶体内HNO的共聚焦成像研究.

  1.2   荧光探针Lyso-HNO的光谱性质研究

  1.2.1   荧光探针Lyso-HNO的荧光反应动力学研究

  由于HNO不稳定, 易脱水发生不可逆的二聚化反应, 因此, 快速响应型探针更能准确检测HNO的实际浓度.溶酶体内pH在4.0~6.0范围内^[38], 选取磷酸缓冲盐溶液(PBS) (10 mmol•L^-1, pH 5.0, 10% N, N-二甲基甲酰胺), 测试了室温下探针对HNO的响应速度.如图 1所示, 向探针溶液(5 μmol•L^-1)中加入HNO (50 μmol•L^-1), 溶液出现明显的黄绿色荧光, 2 min后反应体系的荧光强度基本饱和.利用570 nm处荧光强度(I_{570 nm})对反应时间(t)作图, 根据公式计算^[24], 探针的准一级反应动力学常数K_obs、二级反应动力学常数K₂、半衰期t_1/2分别为2.59×10^-3 s^-1、517.4 mol•L^-1•s^-1和27 s, 说明探针Lyso-HNO响应快速, 具有实时检测HNO的能力.

  图 1

  

  图 1.  (a) 探针Lyso-HNO加入HNO后随时间变化的荧光发射光谱和(b)探针Lyso-HNO与HNO反应后570 nm处荧光随时间的变化曲线(Lyso-HNO 5 μmol•L^-1, HNO 50 μmol•L^-1, E_x 450 nm)

  Figure 1.  (a) Time dependence of fluorescence spectra of Lyso-HNO with HNO, and (b) time dependence of fluorescence intensity of Lyso-HNO at 570 nm with HNO (Lyso-HNO 5 μmol•L^-1, HNO 50 μmol•L^-1, E_x 450 nm)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  1.2.2   荧光探针Lyso-HNO的选择性研究

  高度专一的选择性是性能优良荧光探针的必备条件, 生物体系中存在多种类型的活性物种.为了考察探针的选择性, 测试了探针对各种活性氧、活性氮、巯基化合物以及其它相关分析物的荧光光谱响应, 这些分析物包括, 还原型分析物(Na₂S、NaNO₂、NO)、氧化型分析物(H₂O₂、NaClO、KO₂、TBHP)、巯基化合物(GSH、Cys、Hcy)和金属离子(Na⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Zn²⁺).如图 2所示, 向探针溶液中加入其它分析物并没有使探针溶液的荧光强度发生明显变化, 而加入HNO使探针溶液在570 nm处的荧光强度显著增强.说明探针Lyso-HNO对HNO的识别具有较强的专一性, 也表明该探针在生物系统中具有潜在的应用价值.

  图 2

  

  图 2.  探针Lyso-HNO (5 μmol•L^-1)加入各种分析物后在570 nm处的荧光响应图

  Figure 2.  Fluorescence enhancement at 570 nm of Lyso-HNO (5 μmol•L^-1) upon individual addition of different species

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  1.2.3   荧光探针Lyso-HNO的灵敏性研究

  为了考察探针的灵敏性, 测试了探针与不同浓度HNO反应后的荧光光谱图.如图 3所示, 随着HNO浓度逐渐增大, 探针溶液在570 nm处的荧光强度逐渐增强, 当加入HNO浓度高于50 µmol•L^-1时, 探针荧光强度基本保持不变.根据滴定实验发现, 探针溶液的荧光强度与HNO浓度(0~25 μmol•L^-1)具有较好的线性关系(线性相关系数: R²＝0.99838), 表明探针可以用来定量检测HNO.根据3σ/k的计算方法(σ是空白溶液的标准偏差, k是荧光强度与HNO浓度线性关系的斜率)^[39], 探针的检测极限为202 nmol•L^-1.以上结果表明, 探针Lyso-HNO可以用于低浓度HNO检测.

  图 3

  

  图 3.  (a) 探针Lyso-HNO (5 μmol•L^-1)在不同浓度HNO (0~80 μmol•L^-1)中的荧光光谱图和(b)探针在570 nm处的荧光强度与HNO浓度(0~25 μmol•L^-1)的线性关系

  Figure 3.  (a) Fluorescence spectra of Lyso-HNO (5 μmol•L^-1) in the presence of HNO (0~80 μmol•L^-1), and (b) the linear relationship between the fluorescence intensity (I_570nm) and the concentration of HNO (0~25 μmol•L^-1)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  1.2.4   荧光探针Lyso-HNO的识别机理研究

  为了验证探针的识别机理, 测试了探针与HNO反应后的紫外吸收光谱和高分辨质谱.如图 4所示, 探针在350 nm左右处有一个强吸收带.随着反应的进行, 350 nm处的吸收峰强度逐渐减弱, 450 nm处的吸收峰逐渐增强, 这是由于探针结构中萘酰亚胺4位从酯基变为羟基, 给电子能力增强, 紫外吸收峰红移.通过高分辨质谱发现, 探针与HNO反应后, 出现327.1342分子离子峰, 与化合物3的理论分子量相符([M+H]⁺＝327.1345).以上结果表明, 探针结构中的三苯基膦基团与HNO发生Staudinger反应生成氮叶立德中间体, 接着氮叶立德中间体与分子内酯基发生亲核反应, 形成二苯基膦酰基苯甲酰胺, 释放出化合物3, 最终使荧光团恢复发射荧光.其机理如Scheme 1所示.

  图 4

  

  图 4.  探针Lyso-HNO (5 μmol•L^-1)加入HNO (50 μmol•L^-1)后随时间变化的紫外吸收光谱图

  Figure 4.  UV-Vis spectra of Lyso-HNO (5 μmol•L^-1) upon addition of HNO (50 μmol•L^-1) at different incubation time

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  图式 1

  

  图式 1.  探针Lyso-HNO对HNO的识别机理

  Scheme 1.  Sensing mechanism of Lyso-HNO to HNO

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  1.2.5   HeLa细胞成像研究

  为了进一步研究探针在活细胞中对HNO响应的能力, 首先利用噻唑蓝(MTT)法对探针进行了细胞毒性测试, 选取宫颈癌HeLa细胞和人正常肾HEK293细胞两种细胞株.实验结果表明, 探针在0~20 μmol• L^-1浓度范围内对测试细胞株均未表现出明显的抑制作用, 说明探针适用于在活细胞中对HNO进行检测.据文献报道, 吗啉结构可以定位于细胞中的溶酶体细胞器, 测试了探针的溶酶体定位能力^[25~27].如图 5所示, 探针与商品化溶酶体定位探针Lyso-Tracker Red共孵育后, 共定位能力良好, 皮尔森相关系数(Pearson’s correlation coefficient)为0.93, 表明探针可以定位于溶酶体细胞器.萘酰亚胺荧光团是一种双光子吸收荧光团, 探针被应用到HeLa细胞的双光子荧光成像实验.如图 6所示, 探针单独孵育的HeLa细胞基本没有绿色荧光(图 6A); 当加入HNO继续孵育后, 绿色荧光明显增强(图 6B).这些结果表明探针Lyso-HNO具有良好的细胞渗透性, 可以用来检测活细胞溶酶体内的HNO.

  图 5

  

  图 5.  探针Lyso-HNO溶酶体荧光共定位成像A为探针

  Figure 5.  Colocalization imaging of lysosomes in HeLa cells using Lyso-HNO

  (A): Fluorescence image of Lyso-HNO; (B): Fluorescence image of Lyso-Tracker Red; 3: bright-field image; 4: Merged images of A, B and C; Scale bars＝20 μm)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  图 6

  

  图 6.  探针Lyso-HNO培养的HeLa细胞双光子荧光共聚焦成像研究

  Figure 6.  Two-photon confocal fluorescence imaging of exogenous HNO in HeLa cells using Lyso-HNO

  (A) Incubation probe (5 μmol•L^-1) only; (B) incubation probe (5 μmol• L^-1) firstly, then HNO (50 μmol•L^-1). 1: fluorescence images, 2: bright-field images, 3: Merged images of 1 and 2; Scale bars＝20 μm

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.   结论

  设计合成了一种溶酶体靶向荧光增强型双光子HNO荧光探针Lyso-HNO, 通过HNO引发的Staudinger反应, 释放前体化合物3.探针对HNO表现出良好的选择性和灵敏性, 并且响应迅速, 检测极限为202 nmol• L^-1.此外, 探针具有双光子吸收功能和溶酶体定位能力, 可用于活细胞溶酶体中HNO的检测, 具有潜在的应用价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  Brucker核磁共振仪(400MHz和600 MHz); Varian 7.0 T FTICR-MS质谱仪(美国Agilent公司); HitachiF- 7000型荧光光谱仪(日本Hitachi公司); UV-3600型分光光度计(美国Agilent公司).

  柱层析用硅胶(100~200目)及GF254薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂产品; 所用试剂和溶剂均为国产或进口, 分析纯或者化学纯试剂, 无水试剂均按常规方法处理.

  图 2

  

  图 2.  探针Lyso-HNO的合成

  Figure 2.  Synthesis of probe Lyso-HNO

  Reagents and conditions: (ⅰ) N-(2-aminoethyl)morpholine, EtOH, reflux, 5 h; (ⅱ) CH₃OH, K₂CO₃, reflux, 24 h; (ⅲ) HI, reflux, 5 h.

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.2   实验方法

  3.2.1   化合物1、2和3的合成

  向100 mL圆底烧瓶中加入5.0 g (18.0 mmol) 4-溴- 1, 8-萘二酸酐, 5.0 g (36.0 mmol)胺乙基吗啉和50 mL无水乙醇, 回流反应8 h.将反应液冷却至室温, 析出沉淀, 抽滤, 少量无水乙醇洗涤沉淀, 干燥, 得到6.2 g淡黄色固体1, 产率90%. m.p. 165.2~166.8 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.65 (d, J＝7.2 Hz, 1H), 8.57 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 8.40 (d, J＝7.6 Hz, 1H), 8.04 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 7.85 (t, J＝8.0 Hz, 1H), 4.34 (t, J＝6.4 Hz, 2H), 3.68 (s, 4H), 2.71 (t, J＝6.4 Hz, 2H), 2.61 (s, 4H). HRMS calcd for C₁₈H₁₈BrN₂O₃ 389.0501, found 389.0492.

  向50 mL圆底烧瓶中加入2.5 g (6.40 mmol)化合物1, 3.50 g (25.3 mmol)碳酸钾和30 mL无水甲醇, 回流反应24 h.将反应液冷却至室温, 析出沉淀, 抽滤, 少量水洗涤沉淀, 干燥, 得到1.6 g淡黄色针状固体2, 产率76 %. m.p. 125.5~127.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.59~8.53 (m, 3H), 7.70 (t, J＝7.6 Hz, 1H), 7.04 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 4.34 (t, J＝7.2 Hz, 2H), 4.13 (s, 3H), 3.70 (t, J＝4.8 Hz, 4H), 2.71 (t, J＝7.2 Hz, 2H), 2.62 (s, 4H). HRMS calcd for C₁₉H₂₁N₂O₄ 341.1501, found 341.1497.

  向50 mL圆底烧瓶中加入1.0 g (3.00 mmol)化合物2和50 mL 57% HI, 回流反应6 h.将反应液冷却至室温, 用2 mol•L^-1 NaOH水溶液调节pH至中性, 有淡黄色针状沉淀生成.抽滤, 少量无水乙醇洗涤沉淀, 干燥, 得到0.82 g淡黄色针状固体3, 产率86%. m.p. 116.3~117.8 ℃; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.55 (d, J＝6.4 Hz, 1H), 8.48 (d, J＝7.2 Hz, 1H), 8.35 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 7.76 (t, J＝8.4 Hz, 1H), 7.14 (d, J＝7.8 Hz, 1H), 4.17 (t, J＝7.2 Hz, 2H), 3.54 (t, J＝4.2 Hz, 4H), 2.57 (t, J＝7.2 Hz, 2H), 2.49 (s, 4H). HRMS calcd for C₁₈H₁₉N₂O₄ 327.1345, found 327.1335.

  3.2.2   探针Lyso-HNO的合成

  将200 mg (0.61 mmol)化合物3溶解于15 mL无水二氯甲烷, 依次加入151 mg (0.73 mmol)二环己基碳二亚胺、224 mg (0.73 mmol) 2-二苯基膦苯甲酸和89 mg (0.73 mmol) 4-二甲氨基吡啶, 室温搅拌过夜.将反应液浓缩, 柱层析分离[V(二氯甲烷):V(乙酸乙酯)＝4:1], 得到354 mg白色固体Lyso-HNO, 产率79%. m.p. 220.5~221.9 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.59~8.53 (m, 2H), 8.45~8.42 (m, 1H), 8.05 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 7.65 (t, J＝8.0 Hz, 1H), 7.58~7.53 (m, 2H), 7.38~7.27 (m, 11H), 7.10~7.07 (m, 1H), 4.34 (t, J＝6.8 Hz, 2H), 3.68 (t, J＝4.4 Hz, 2H), 2.71 (t, J＝6.8 Hz, 2H), 2.68 (s, 4H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 164.38, 164.01, 163.51, 151.54, 142.57, 137.20, 137.13, 134.65, 134.11, 133.97, 133.20, 131.68, 131.51, 129.31, 128.95, 128.67, 128.62, 128.48, 128.00, 127.09, 125.33, 122.72, 120.32, 119.50, 67.03, 56.12, 53.80, 37.20. HRMS (ESI⁺) calcd for C₃₇H₃₂N₂O₅ 615.2043, found 615.2045.

  3.2.3   光谱测试

  探针Lyso-HNO用二甲基亚砜(DMSO)配制成5 mmol•L^-1的母液, 测试浓度为5 μmol•L^-1.选择性测试所用各种干扰离子均为钠盐或钾盐, 除谷胱甘肽(GSH)为5 mmol•L^-1外, 其它干扰离子测试浓度为500 μmol• L^-1, 测试溶液为PBS缓冲溶液(10 mmol•L^-1, pH 5.0, 10% DMF). Angeli’s salt (HNO供体)和硝普化钠(NO供体)溶解在0.01 mol•L^-1 NaOH中, KO₂溶解在DMSO中制备所需浓度的母液.荧光光谱均在室温条件下测试, 样品池为1 cm×1 cm×4 cm石英比色皿, 激发波长为450 nm, 激发和发射狭缝宽度分别为5和10 nm.

  3.2.4   细胞实验

  HeLa细胞培养条件:细胞培养基为高糖培养基, 其中含有体积比为10%胎牛血清、100 U/mL盘尼西林、100 mg/mL链霉素和4 mM L-谷氨酰胺. HeLa细胞在体积分数为5% CO₂的环境下培养, 待生长至融合度为70%~80%时, 加入质量分数为0.25%的胰酶蛋白消化细胞进行实验操作.

  细胞毒性实验:将HeLa细胞接种于96孔板, 每孔细胞浓度为10⁴, 过夜孵育后, 加入不同浓度的Lyso- HNO (0, 1, 2, 5, 10, 15, 20 μmol•L^-1), 继续孵育3 h.向每孔加入四甲基偶氮唑盐(MTT), 终浓度为0.5 mg/mL, 继续孵育4 h.用150 μL DMSO溶解生成的甲瓒沉淀, 通过酶标仪在490 nm处检测其光密度(OD)值.

  细胞共定位成像实验: HeLa细胞接种于35 mm细胞成像专用玻底培养皿, 成像细胞密度为2×10⁴.首先加入HNO (50 μmol•L^-1)孵育30 min, 再加入Lyso-HNO (5 μmol•L^-1)和商品化溶酶体定位探针Lyso-Tracker Red (20 nmol•L^-1)共孵育30 min, 用PBS洗涤三次后, 进行共定位成像研究.探针Lyso-HNO荧光通道激发波长为780 nm, 收集500~550 nm范围; Lyso-Tracker Red荧光通道激发波长为546 nm, 收集590~640 nm范围.

  细胞外源HNO成像实验:单独加入Lyso-HNO (5 μmol•L^-1)孵育30 min, 用PBS洗涤三次后, 采集明场和荧光场图像, 进行细胞成像研究; 首先加入Lyso-HNO (5 μmol•L^-1)孵育30 min, 用PBS洗涤三次后, 加入HNO (50 μmol•L^-1), 继续孵育45 min, 最后采集明场和荧光场图像, 进行细胞成像研究.探针Lyso-HNO荧光通道激发波长为780 nm, 收集500~550 nm范围.

  辅助材料(Supporting information)  所有化合物的¹H NMR, ¹³C NMR以及HRMS谱图, 探针的毒性, 探针与HNO反应后的高分辨质谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

• 1. [1]

     Paolocci, N.; Jackson, M. I.; Lopez, B. E.; Miranda, K.; Toc-chetti, C. G.; Wink, D. A.; Hobbs, A. J.; Fukuto, J. M. Pharmacol. Therapeut. 2007, 113, 442. doi: 10.1016/j.pharmthera.2006.11.002

  2. [2]

     Irvine, J. C.; Ritchie, R. H.; Favaloro, J. L.; Andrews, K. L.; Widdop, R. E.; Kemp-Harper, B. K. Trends Pharmacol. Sci. 2008, 29, 601. doi: 10.1016/j.tips.2008.08.005

  3. [3]

     Flores-Santana, W.; Salmon, D. J.; Donzelli, S.; Switzer, C. H.; Basudhar, D.; Ridnour, L.; Cheng, R.; Glynn, S. A.; Paolocci, N.; Fukuto, J. M.; Miranda, K. M.; Wink, D. A. Antioxid. Redox Sign. 2011, 14, 1659. doi: 10.1089/ars.2010.3841

  4. [4]

     Paolocci, N.; F. Saavedra, W.; Miranda, K.; Martignani, C.; Isoda, T.; M. Hare, J.; G. Espey, M.; M. Fukuto, J.; Feelisch, M.; Wink, D.; Kass, D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001, 98, 10463. doi: 10.1073/pnas.181191198

  5. [5]

     Switzer, C. H.; Flores-Santana, W.; Mancardi, D.; Donzelli, S.; Basudhar, D.; Ridnour, L. A.; Miranda, K. M.; Fukuto, J. M.; Paolocci, N.; Wink, D. A. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 2009, 1787, 835. doi: 10.1016/j.bbabio.2009.04.015

  6. [6]

     Bult, H.; Boeckxstaens, G. E.; Pelckmans, P. A.; Jorfaens, F. H.; Van Maercke, Y. M.; Herman, A. G. Nature 1990, 345, 346. doi: 10.1038/345346a0

  7. [7]

     Irvine, J. C.; Kemp-Harper, B. K.; Widdop, R. E. Hypertension 2007, 49, 1468.

  8. [8]

     Lee, M. J. C.; Nagasawa, H. T.; Elberling, J. A.; Demaster, E. G. J. Med. Chem. 1992, 35, 3648. doi: 10.1021/jm00098a008

  9. [9]

     李美含, 王宇童, 刘广建, 吕海娟, 邢国文, 有机化学, 2017, 37, 356. http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract345746.shtmlLi, M.; Wang, Y.; Liu, G.; Lv, H.; Xing, G. Chin. J. Org. Chem. 2017, 37, 356(in Chinese). http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract345746.shtml

  10. [10]

      Da Silva, T. R. M.; De Freitas, J. R.; Silva, Q. C.; Figueira, C. P.; Roxo, E.; Leao, S. C.; De Freitas, L. A. R.; Veras, P. S. T. Infect. Immun. 2002, 70, 5628. doi: 10.1128/IAI.70.10.5628-5634.2002

  11. [11]

      Radi, R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 4003. doi: 10.1073/pnas.0307446101

  12. [12]

      Dong, B.; Kong, X.; Lin, W. ACS Chem. Biol. 2018, 13, 1714. doi: 10.1021/acschembio.7b00901

  13. [13]

      景晓彤, 于法标, 陈令新, 化学进展, 2014, 26, 866.Jing, X.; Yu, F.; Chen, L. Prog. Chem. 2014, 26, 866(in Chi-nese).

  14. [14]

      Apfel, U.-P.; Buccella, D.; Wilson, J. J.; Lippard, S. J. Inorg. Chem. 2013, 52, 3285. doi: 10.1021/ic302793w

  15. [15]

      Lv, H.; Ma, R.; Zhang, X.; Li, M.; Wang, Y.; Wang, S.; Xing, G. Tetrahedron 2016, 72, 5495. doi: 10.1016/j.tet.2016.07.039

  16. [16]

      R., C. M.; P., T. J. J. Phys. Org. Chem. 2011, 24, 993. doi: 10.1002/poc.1871

  17. [17]

      Kawai, K.; Ieda, N.; Aizawa, K.; Suzuki, T.; Miyata, N.; Nakagawa, H. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 12690. doi: 10.1021/ja404757s

  18. [18]

      Liu, C.; Wu, H.; Wang, Z.; Shao, C.; Zhu, B.; Zhang, X. Chem. Commun. 2014, 50, 6013. doi: 10.1039/c4cc00980k

  19. [19]

      Tan, Y.; Liu, R.; Zhang, H.; Peltier, R.; Lam, Y.; Zhu, Q.; Hu, Y.; Sun, H. Sci. Rep. 2015, 5. 16979. doi: 10.1038/srep16979

  20. [20]

      Gong, X.; Yang, X.; Zhong, Y.; Chen, Y.; Li, Z. Dyes Pigm. 2016, 131, 24. doi: 10.1016/j.dyepig.2016.03.046

  21. [21]

      Jin, X.; Sun, X.; Di, X.; Zhang, X.; Huang, H.; Liu, J.; Ji, P.; Zhu, H. Sens. Actuators, B 2016, 224, 209. doi: 10.1016/j.snb.2015.09.072

  22. [22]

      Ali, F.; Sreedharan, S.; Ashoka, A. H.; Saeed, H. K.; Smythe, C. G. W.; Thomas, J. A.; Das, A. Anal. Chem. 2017, 89, 12087. doi: 10.1021/acs.analchem.7b02567

  23. [23]

      Zhou, Y.; Zhang, X.; Yang, S.; Li, Y.; Qing, Z.; Zheng, J.; Li, J.; Yang, R. Anal. Chem. 2017, 89, 4587. doi: 10.1021/acs.analchem.7b00073

  24. [24]

      Li, H.; Yao, Q.; Xu, F.; Xu, N.; Ma, X.; Fan, J.; Long, S.; Du, J.; Wang, J.; Peng, X. Anal. Chem. 2018, 90, 4641. doi: 10.1021/acs.analchem.7b05172

  25. [25]

      Yuan, S.; Wang, F.; Yang, G.; Lu, C.; Nie, J.; Chen, Z.; Ren, J.; Qiu, Y.; Sun, Q.; Zhao, C.; Zhu, W. H. Anal. Chem. 2018, 90, 3914. doi: 10.1021/acs.analchem.7b04787

  26. [26]

      Jing, X.; Yu, F.; Chen, L. Chem. Commun. 2014, 50, 14253. doi: 10.1039/C4CC07561G

  27. [27]

      Zhang, B. B.; Yang, X. P.; Zhang, R.; Liu, Y.; Ren, X. L.; Xian, M.; Ye, Y.; Zhao, Y. F. Anal. Chem. 2017, 89, 10384. doi: 10.1021/acs.analchem.7b02361

  28. [28]

      Zheng, K.; Lin, W.; Cheng, D.; Chen, H.; Liu, Y.; Liu, K. Chem. Commun. 2015, 51, 5754. doi: 10.1039/C4CC10382C

  29. [29]

      Zhu, X.; Xiong, M.; Liu, H.; Mao, G.; Zhou, L.; Zhang, J.; Hu, X.; Zhang, X.; Tan, W. Chem. Commun. 2016, 52, 733. doi: 10.1039/C5CC08695G

  30. [30]

      Dong, B.; Song, X.; Kong, X.; Wang, C.; Zhang, N.; Lin, W. J. Mater. Chem. B 2017, 5, 5218. doi: 10.1039/C7TB00703E

  31. [31]

      Fernández-Alonso, S.; Corrales, T.; Pablos, J. L.; Catalina, F. Sens. Actuators, B 2018, 270, 256. doi: 10.1016/j.snb.2018.05.030

  32. [32]

      Tang, J.; Ma, S. G.; Zhang, D.; Liu, Y. Q.; Zhao, Y. F.; Ye, Y. Sens. Actuators, B 2016, 236, 109. doi: 10.1016/j.snb.2016.05.144

  33. [33]

      Gupta, N.; Kaur, T.; Bhalla, V.; Parihar, R. D.; Ohri, P.; Kaur, G.; Kumar, M. Chem. Commun. 2017, 53, 12646. doi: 10.1039/C7CC07996F

  34. [34]

      Zhang, B. B.; Qin, F. Y.; Niu, H. W.; Liu, Y.; Zhang, D.; Ye, Y. New J. Chem. 2017, 41, 14683. doi: 10.1039/C7NJ02813J

  35. [35]

      谢振达, 付曼琳, 尹彪, 朱勍, 有机化学, 2018, 38, 1364. http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract346463.shtmlXie, Z.; Fu, M.; Yin, B.; Zhu, Q. Chin. J. Org. Chem. 2018, 38, 1364(in Chinese). http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract346463.shtml

  36. [36]

      Wang, Y.; Liu, C.; Yang, W.; Zou, G.; Zhang, X.; Wu, F.; Yu, S.; Luo, X.; Zhou, X. Chem. Commun. 2018, 54, 1497. doi: 10.1039/C7CC08715B

  37. [37]

      Liu, C.; Wang, Y.; Zhang, X.; Wu, F.; Yang, W.; Zou, G.; Yao, Q.; Wang, J.; Chen, Y.; Wang, S.; Zhou, X. Chem. Sci. 2017, 8, 4505. doi: 10.1039/C7SC00637C

  38. [38]

      Christensen, K.; Myers, J.; Swanson, J. Cell Sci. 2002, 115, 599.

  39. [39]

      Michael, S.; Raoul, K.; Michael, K.; Brian, H. Anal. Chem. 1996, 65, 1414. http://cn.bing.com/academic/profile?id=a2db90795049f6c0517798ccadf02011&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn

• 

  图 1  (a) 探针Lyso-HNO加入HNO后随时间变化的荧光发射光谱和(b)探针Lyso-HNO与HNO反应后570 nm处荧光随时间的变化曲线(Lyso-HNO 5 μmol•L^-1, HNO 50 μmol•L^-1, E_x 450 nm)

  Figure 1  (a) Time dependence of fluorescence spectra of Lyso-HNO with HNO, and (b) time dependence of fluorescence intensity of Lyso-HNO at 570 nm with HNO (Lyso-HNO 5 μmol•L^-1, HNO 50 μmol•L^-1, E_x 450 nm)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 2  探针Lyso-HNO (5 μmol•L^-1)加入各种分析物后在570 nm处的荧光响应图

  Figure 2  Fluorescence enhancement at 570 nm of Lyso-HNO (5 μmol•L^-1) upon individual addition of different species

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 3  (a) 探针Lyso-HNO (5 μmol•L^-1)在不同浓度HNO (0~80 μmol•L^-1)中的荧光光谱图和(b)探针在570 nm处的荧光强度与HNO浓度(0~25 μmol•L^-1)的线性关系

  Figure 3  (a) Fluorescence spectra of Lyso-HNO (5 μmol•L^-1) in the presence of HNO (0~80 μmol•L^-1), and (b) the linear relationship between the fluorescence intensity (I_570nm) and the concentration of HNO (0~25 μmol•L^-1)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 4  探针Lyso-HNO (5 μmol•L^-1)加入HNO (50 μmol•L^-1)后随时间变化的紫外吸收光谱图

  Figure 4  UV-Vis spectra of Lyso-HNO (5 μmol•L^-1) upon addition of HNO (50 μmol•L^-1) at different incubation time

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图式 1  探针Lyso-HNO对HNO的识别机理

  Scheme 1  Sensing mechanism of Lyso-HNO to HNO

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 5  探针Lyso-HNO溶酶体荧光共定位成像A为探针

  Figure 5  Colocalization imaging of lysosomes in HeLa cells using Lyso-HNO

  (A): Fluorescence image of Lyso-HNO; (B): Fluorescence image of Lyso-Tracker Red; 3: bright-field image; 4: Merged images of A, B and C; Scale bars＝20 μm)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 6  探针Lyso-HNO培养的HeLa细胞双光子荧光共聚焦成像研究

  Figure 6  Two-photon confocal fluorescence imaging of exogenous HNO in HeLa cells using Lyso-HNO

  (A) Incubation probe (5 μmol•L^-1) only; (B) incubation probe (5 μmol• L^-1) firstly, then HNO (50 μmol•L^-1). 1: fluorescence images, 2: bright-field images, 3: Merged images of 1 and 2; Scale bars＝20 μm

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 2  探针Lyso-HNO的合成

  Figure 2  Synthesis of probe Lyso-HNO

  Reagents and conditions: (ⅰ) N-(2-aminoethyl)morpholine, EtOH, reflux, 5 h; (ⅱ) CH₃OH, K₂CO₃, reflux, 24 h; (ⅲ) HI, reflux, 5 h.

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
•