合成生物学是一门综合性工程科学, 意在以传统生物学研究获取的功能基因元件为基础, 利用系统和定量生物学手段对其加以精确的定量表征, 在工程学以及计算机指导下设计新生物系统或对已有生物系统进行深度改造[1].目前, 人工遗传改造的生命体已经在工业生产、临床医疗、环境修复[2]等诸多领域产生了重要影响.
另一方面, 合成生物学的快速发展也为我们带来了诸多挑战.首先, 随着DNA合成技术和基因组编辑技术的发展, 人们不仅有能力重新合成并拯救复活已灭绝生物(包括烈性病原体)的基因组[3], 而且可以大规模改造乃至从头设计各类型现存生命体(不仅仅是微生物, 还包括昆虫[4]、植物[5], 甚至是高等生物[6]).但是这些遗传改造生命体对自然环境的影响是未知的.同时, 精确的基因组编辑工具使得我们可以对生命体进行更多的干预, 比如利用基因驱动技术消除携带和传播人类病原体的蚊子[7], 这也为自然生态环境带来了更多未知的挑战.其次, 合成生物学能够创造依赖于非经典生物化学组分的生命体, 例如, 利用合成化学物质(如非天然氨基酸、非天然核苷酸)作为蛋白质[8]或者核酸[9]等生命体的基础组成成分.但是值得担心的是, 这些依赖于非经典生物化学组分的生命体如何与环境中的野生生物系统相互作用也是未知的.再次, 遗传改造生命体的应用已经开始从发酵生产等封闭体系转向动物肠道微生物改造、土壤重金属吸收和垃圾塑料降解等开放环境问题[10].这些释放于开放环境的人工生命体有可能给地区和全球生态带来严重不良后果.最后, 人工生命体设计的标准化、流程化和简易化等合成生物学工程技术的积累, 也让业余科研爱好者能够在厨房或者仓库中对生命体进行设计和改造[11].这些缺乏科研培训和相关法律监管的业余科研爱好者将进一步增加遗传改造生命体释放到自然环境的可能性.
由以上可知, 人工遗传改造生命体释放到自然环境中时, 伴随着潜在的安全隐患, 有可能会对自然环境生态以及人类健康产生负面影响.自20世纪70年代以来, 科学家和公众就已经表示, 人工遗传改造生命体在实验室外环境中故意或意外释放可能会对环境产生意想不到的影响[12].随着近年来合成生物学设计能力的提高和相关应用的迅速增加, 遗传改造生命影响生态系统和人类健康的危险将会持续增加[13].所以, 遗传改造生命体在实验室外环境的应用急需更加安全、高效的防逃逸技术提高人工遗传改造生命体的可控性, 防止它们逃逸到自然环境, 避免其造成无法预知的破坏.
一般来说, 造成遗传改造生命体逃逸的分子机制和潜在原因主要有以下几个方面:第一, 遗传改造生命体可以通过基因突变或者基因重组获得某种生存上的优势, 从而突破防逃逸系统, 实现在非受控环境中的增殖和富集; 第二, 不同生物之间可以通过基因横向转移彼此分享遗传信息, 这一点在细菌中尤其明显.合成基因可以通过这种方式传播到其他的野生生物体之中, 如抗性基因的转移.同时野生生物体的基因也可以通过这种方式传播到遗传改造生命体中, 最终赋予合成生物某种生存优势, 逃脱防逃逸系统.所以有效的遗传改造生命体防逃逸系统必需能够阻止遗传改造生命体在自然环境中的增殖和富集, 同时阻止其与野生生物体之间的遗传交流.根据美国卫生研究所提出的标准:一个成功的防逃逸系统需要将生物逃逸出此系统的概率控制在10-8以下[14].也就是说, 细菌在600 nm光密度(Optical density at 600 nm, OD600)等于1的时候, 100 mL菌液中逃逸的细菌数量不能超过1000个(我们一般认为细菌OD600等于1相当于109 CFU/mL).
要实现这一目标, 防逃逸系统需要满足一下几点标准:第一防逃逸系统必须具有极高的鲁棒性, 阻止任何遗传改造生命体在自然生态系统中造成负面影响.第二, 由于遗传改造生命体通常需要繁殖多代, 长期的稳定性是防逃逸系统另一个关键的标准.第三, 为了实现鲁棒性和稳定性, 防逃逸系统必须考虑潜在的遗传沉默机制如DNA重组和基因突变, 以及横向基因转移等.第四, 防逃逸系统往往会对遗传改造生命体施加压力或者产生毒性, 这进一步提高了选择压力从而造成部分遗传改造生命体突破防逃逸系统.为了解决这个问题, 防逃逸系统必须在许可的环境中受到严格的调控.第五, 因为遗传改造生命体往往需要在多种环境中发挥不同的功能, 防逃逸系统的普适化也是一个重要的评价标准.
为实现以上标准, 近几十年来, 大量的研究聚焦在生物安全领域, 开发了多种防逃逸技术.遗传改造生命体的防逃逸主要策略主要分为三个方面:营养缺陷和基因流屏障等相对简单的传统防逃逸策略; 对遗传中心法则进行正交化设计, 构建正交型人工生命体, 在野生生命体和人工生命体之间建立交流屏障; 利用复杂基因调控网络整合多种防逃逸策略, 实现对人工生命体的逃逸控制.本综述便从这三方面简要地对人工遗传改造生命体的防逃逸技术的研究进展进行了阐述.
构建营养缺陷型生物是遗传改造生命体防逃逸最常用的策略之一.我们通常需要敲除细菌、酵母等生物的一些必需基因或者抑制此类基因的表达, 使其依赖于某种关键的代谢分子, 由于营养缺陷型生物缺少了合成某个必需代谢分子的能力, 要维持生存, 其必须从生长环境或者培养基中获取这个必需分子[15].为了实现这一点, 我们一般都需要对负责关键代谢物例如核酸、氨基酸等生产的必需基因进行敲除.一旦营养缺陷型生命体逃逸到不含有此分子的环境中, 它们就会迅速死亡(图 1A).因为这种方法十分直接—只需要改造细菌使其失去产生某种关键物质的能力即可, 所以这种策略至今仍被广泛应用.
(A) Auxotroph; (B) simple kill switches; (C) inducible gene switch to control essential gene; (D) gene flow barrier
这种防逃逸策略最早可以追溯到Curtiss等[16]对大肠杆菌χ 1776的改造和设计.这种大肠杆菌株系缺少具有功能的天冬氨酸半醛脱氢酶基因和胸苷酸合成酶等基因, 所以此株系的存活需要依赖于这些基因的产物—二氨基庚二酸以及胸腺嘧啶或者胸苷. Steidler等[17]利用工程化改造的乳酸乳球菌分泌白介素-10来治疗克罗恩氏病.为了避免工程化改造的细菌在体内不可控的富集, 通过将人类的白介素-10基因IL10替代细菌本身的胸苷酸合成酶基因thyA, 研究人员构建了胸苷酸合成酶基因缺陷型菌株.工程化改造的细菌在缺少胸苷的培养环境中存活率降到了可检测的限度之下.另外, 工程化改造的浮萍植物可以用来生产医用蛋白或者疫苗.比如, Nguyen等[18]利用RNA干扰技术沉默了苏氨酸脱氨酶基因的表达构建了异亮氨酸缺陷型浮萍.
通过让生命体依赖于最关键的必需分子, 同时细菌对此分子的需要量很大时, 营养缺陷型防逃逸策略能够达到最优化的水平. Hirota等[19]使细胞的生长和生存依赖于亚磷酸盐(H3PO3, Pt), 开发了基于营养缺陷型策略的高效的防逃逸技术.在研究他们发现来自菌株Pseudomonas stutzeri WM88的次磷酸盐(H3PO2, HPt)转运体蛋白HtxBCDE能够转运亚磷酸盐(Pt), 但不能转运磷酸盐(H3PO4, Pi).他们敲除了大肠杆菌细胞内所有的和无机磷或者有机磷相关的转运蛋白, 并且将HtxBCDE转运蛋白与亚磷酸盐脱氢酶在大肠中重组表达, 这使得细菌唯一获得磷的方式为Pt或者HPt的吸收和氧化(图 2A). Pt/HPt在环境中的存在很少, 且存在的量也不足以支持亚磷酸盐依赖型细菌的生存(图 2B).在21天的培养实验中研究人员没有发现任何的逃逸个体, 逃逸概率低于1.94×10-13.这是迄今为止利用营养缺陷型防逃逸策略所报道的最低的逃逸概率.
(A) Schematic of the engineered P metabolic pathway for biocontainment; (B) concept for the biocontainment strategy using engineered dependency on Pt/HPt
除了构建营养缺陷型生物, 使其依赖于某种特定的代谢分子之外, 另一种常用的人工生命体防逃逸策略是在遗传改造生命体中诱导型开关控制基因的表达.主要分为两类, 一种是构建自杀开关, 利用诱导型启动子控制毒性蛋白的表达.当生命体逃逸出受控的环境, 自杀开关就会启动, 表达毒性物质, 使逃逸的遗传改造生命体全部死亡(图 1B).第二种是利用诱导型开关控制必需基因的表达, 在受控的环境中添加某种物质可以激活必需基因的表达, 从而保证遗传改造生命体的存活; 而在非受控环境中必需基因无法表达, 最终造成遗传改造生命体死亡(图 1C).
研究人员已经开发出多种自杀开关, 主要是利用诱导型启动子控制毒性蛋白基因的表达.比如通过细胞膜去极化毒蛋白Hok来实现对细菌生死的控制[20], 当细胞培养基中缺少高浓度的色氨酸时, 细菌就会表达Hok毒蛋白, 从而造成细菌死亡. Contrera等[21]在恶臭假单胞菌中设计的自杀开关由3-苯甲酸甲酯调控.在缺少3-苯甲酸甲酯时, 蛋白Gef的表达会导致细胞死亡.同时能够抑制关键代谢产物、使细胞无法高效利用营养物质的基因也可以作为毒性基因的替代. Szafranski等[22]开发的自杀开关中毒性蛋白基因改为链霉亲和素的过表达.链霉亲和素可以和关键代谢物—生物素结合并且阻止其发挥作用, 最终导致细胞死亡.
同时还可以利用诱导型开关控制必需基因的表达. Ronchel等[23]利用相应木糖启动子控制恶臭假单胞菌体内的天冬氨酸半醛合成酶基因asd的表达. Asd基因的缺失使得细菌依赖于二氨基庚二酸、甲硫氨酸和赖氨酸等外源添加物.在诱导剂存在的条件下, 细菌可以正常存活, 而在不含诱导剂的环境中, 细菌则会死亡.在植物中, Oliver等[24]则利用化学诱导型启动子控制植物种子发育相关的关键基因, 限制工程化改造植物的繁殖能力, 建立起了基因利用限制技术(Genetic use restriction technology, GURT). GURT技术的主要目的是限制工程化改造的植物的无意和未批准的传播.目前GURT仍在农业领域具有广泛的应用.
研究表明, 质粒等可移动遗传系统可以通过接合转移等方式在不同细菌之间进行传播[25].同时, 遗传改造生命体的死亡也并不代表着其重组DNA的消失, 残余核酸也有可能通过各种主动或被动方式进入到其他的生物之中. Lyon等[26]研究表明, 残余遗传物质也有可能保持活性, 并且具有在不同细菌间进行基因转移的能力.所以要实现对遗传改造生命体的防逃逸, 我们不仅仅需要消灭逃逸出受控环境的生命体, 同时也要开发相应的系统破坏其残余遗传物质的活性, 在人工生命体和自然生物之间建立起基因流的屏障, 避免人工改造的遗传物质进行横向基因转移.
构建基因流屏障通常需要在工程化改造的遗传系统中加入“杀手”基因, 并将其置于可以免疫“杀手”基因的宿主之中.宿主拥有对此系统免疫能力源于其表达的抑制蛋白.一旦其他的宿主吸收了重组DNA, 那么“杀手”基因就会因为失去了抑制蛋白的表达, 从而造成新宿主死亡(图 1D). Torres等[27]利用基于毒蛋白-抗毒蛋白的组合阻止质粒在野生群体中的传播.他们在质粒上表达核酸酶EcoRI基因, 在基因组上表达EcoRI甲基化酶用于保护遗传改造生命体DNA免于EcoRI核酸酶的切割作用.一旦其他的宿主获得了含有重组基因的质粒, 由于其基因组不存在EcoRI甲基化酶基因, 核酸酶EcoRI的表达就会破坏新宿主的基因组和含有重组基因的质粒, 最终造成新宿主死亡, 这也就避免了重组基因在自然群体间的传播.
基因编辑技术的发展, 特别是基于Cas9的编辑系统革命性发展, 为我们提供了定向移除和破坏相关基因的手段. Caliando等[28]基于Cas9编辑系统开发了DNAi系统, 此系统可以用于降解遗传改造生命体相关的DNA.此系统中Cas9蛋白的表达受到效应分子的调控.当没有效应分子存在时, Cas9蛋白可以导致特定基因片段的破坏和降解. DNA系统可以用来靶向含有“重组DNA”的质粒或者基因组区域, 一旦细菌逃逸出受控环境, 就可以破坏靶向区域的DNA, 避免遗传物质如质粒进行横向基因转移.
然而, 以上提到的三种传统的遗传改造生命体防逃逸策略往往存在非常明显的缺点:遗传改造生命体往往可以通过基因突变、代谢物交互共生等方式, 突破此类简单的防逃逸屏障.同时, 细菌也可能通过基因横向转移重新获取被删除的必需基因片段, 从而导致防逃逸系统失效.例如Wright等[29]相关研究表明胸腺嘧啶缺陷的大肠杆菌在不含有胸腺嘧啶的培养基中加入一部分灭菌的土壤可以很好的生长, 这表明自然环境中的物质可以很好的弥补代谢上的缺陷.为了进一步提升生物防控的效率, 遗传法则的正交化是一个目前来说更加可行、高效的方案.
生命遗传中心法则适用于每一个生物体的每一个基因.生物系统利用共同的遗传编码单元分子(包括核糖核酸、脱氧核糖核酸与氨基酸), 同时采用普适的编码原理(DNA复制、转录和翻译过程)对生命信息进行储存、解码等操作(图 3).
(A) The central dogma applies to most living organisms. Genetic information is stored by DNA replication, decoded into functional proteins by a transcription-translation process, and ultimately guides the life process; (B) the orthogonalization of central dogma includes two aspects, the introduction of non-natural chemicals into nucleic acids and proteins, and the orthogonalization of macromolecular machines
有一类重要的人工遗传改造生命体防逃逸的策略便是对中心法则进行设计和改造, 通过利用人造的编码单元和编码原理(包括非天然核苷酸、非天然氨基酸以及正交化的DNA复制、转录与翻译过程)实现遗传中心法则的正交化, 构建正交化的人工生命体.
在工程中, 正交化是一种系统设计属性, 有助于提升复杂设计的可行性并使系统简单化.正交化属性保证了修改一个组件时, 不会将系统中其他组件出现未预期的副作用.对于生命系统的遗传中心法则来说, 正交化可以定义为工程化改造的大分子机器(例如正交化的DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体和氨酰tRNA合成酶等)应用于特定工程化的生物分子网络(比如正交化的DNA、RNA、蛋白质和小分子等).而这些正交化遗传系统并不会对宿主已有遗传系统产生影响, 同时也不会被天然遗传系统所识别.
正交化的遗传中心法则为防逃逸系统提供了相比于传统防逃逸策略更加高效的方案.由于正交化生命体利用了野生生命体不兼容的遗传编码机制, 切断人工遗传改造生命体和野生生物体之间的联系, 形成了有效的“防火墙”, 阻止人工生命体将合成的遗传信息传递给野生生物系统, 也就消除了遗传改造生命体潜在的逃逸可能性[30].同时利用正交化的设计理念, 研究者可以最小化宿主-合成基因之间的相互影响, 从而获得前所未有的自由度对合成生物进行设计改造, 扩展细胞的功能, 这也进一步增大了遗传改造生命体与野生生物体之间的差异, 可以进一步增加彼此之间的遗传交流阻力.
利用中心法则的正交化构建防逃逸系统包括两方面:一方面是将非天然化学分子引入遗传大分子如核酸以及蛋白质中; 另一方面是遗传中心法则中各种复制、转录与翻译过程聚合酶、转移酶等大分子蛋白机器的正交化.
相比自然界化学分子的多样性, 自然生命体的化学多样性是相当狭窄的.有机化学和化学生物学的迅速发展, 使得生物系统可探索的有机分子空间获得了极大地拓展.这也为中心法则中DNA、RNA、蛋白质等基础分子正交化提供了重要的物质基础.正交化中心法则中的非天然物质利用的是与自然系统不兼容的生物基本组分[30, 31], 主要包含三种方面:非天然氨基酸、非天然核苷酸、合成辅因子.
遗传改造生命体可能通过细菌群体间的代谢物交互共生突变传统的营养缺陷型防逃逸系统.而工程化改造生命体使其依赖于非天然物质如非天然氨基酸则可以完全避免传统营养缺陷型防逃逸系统存在的上述弊端, 实现更高等级的营养缺陷型防逃逸系统.
工程化构建非天然氨基酸依赖型生命体的主要策略是利用定向进化方法, 在细胞内引入编码某种特定非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS)及其对应的tRNA组合, 通过特异识别终止密码子(UAG), 最终实现目标蛋白质中具有特殊功能的非天然氨基酸的定向插入[32].至今, 种类繁多的非天然氨基酸(除了20种天然氨基酸以外)已经通过有机合成方法获得, 其中超过100种非天然氨基酸已经被成功地引入到原核或真核生物系统, 编码为各种功能蛋白质[32, 33].
对于细菌来说, 细胞内主要存在三种终止密码子, 即UAG、UAA、UGA.三种密码子分别对应两种释放因子, 其中终止因子1 (release factor1, RF1)识别UAG和UAA, 终止因子2 (RF2)识别UAA和UGA.由于细胞内存在释放因子RF1识别终止密码子UAG, 非天然氨基酸在翻译过程需要与终止因子相互竞争UAG密码子位点, 同时加之外源aaRS的催化效率较低, 导致非天然氨基酸的插入目标基因的效率很低; 另一方面, 非天然氨基酸插入到部分内源基因的UAG终止密码子位置也会影响内源基因功能的正常发挥, 从而导致细胞毒性. 2013年Lajoie等[8c]利用MAGE[34]和CAGE[35]等技术, 将大肠杆菌体内的321个UAG密码完全替换为了UAA密码子, 同时敲除了终止因子1基因pfrA, 成功构建了E. coli C321△A菌株.此菌株内不含有RF1终止因子, 所以通过在细胞内重新引入UAG密码子和正交化的转录机制可以实现非天然氨基酸在蛋白质中的高效插入.
为了在同一个细胞内增加可插入的非天然氨基酸的种类, Ostrov等[36]正在尝试将基因组中冗余密码子从大肠杆菌基因组去除掉, 构建只含有57个密码子的大肠杆菌.一旦这项工作完成, 它将会作为一种特殊的底盘生命体整合多种具有特殊功能的非天然氨基酸, 比如光敏型、荧光型和铜催化型等.另外, 四联体密码子也被用于非天然氨基酸的插入过程[37].这种四联体密码子进一步修改了遗传编码的规则, 增加了遗传密码子的种类, 有潜力在蛋白质序列中引入更多的非天然氨基酸.
通过在必需蛋白中引入非天然氨基酸, 可以实现对人工遗传改造生命体的防逃逸控制(图 4A). Mandell等[8b]创造了一种依赖于非天然氨基酸的大肠杆菌, 其中六种必需基因的蛋白产物依赖于非天然氨基酸bipA (L-4, 4'-biphenylalanine).研究人员利用计算机辅助蛋白设计探索了可以容忍bipA插入的蛋白位点.利用工程化的tRNA和氨酰tRNA合成酶组合, bipA可以被定向插入到多种必需蛋白的位点上.这种防逃逸策略最终实现了遗传改造生命体逃逸概率小于2×10-12.在现有实验室检测条件下, 已经无法检测到逃逸现象, 甚至在连续培养14 d之后依然如此.
(A) Unnatural amino acid; (B) unnatural nucleotide; (C) synthetic ligand
利用同样的策略, Rovner等[8a]探索了不同的策略实现非天然氨基酸的插入.除了计算机的辅助设计, 他们也将ncAA的插入位点设定在了蛋白质的起始位置和必需蛋白的活性位点.同样应用多层策略, 结果显示细菌的逃逸概率也降到了几乎无法检测的水平, 在长达多天的实验中, 结果也很稳定.其中必需蛋白MurG、DnaA和SerS中带有突变的菌株在培养基中生长几乎不受影响, 但是逃逸概率却几乎降到了不可检测的程度.
不同于计算机辅助设计, Tack等[38]利用进化使得β-内酰胺酶更加依赖于非天然氨基酸, 实验结果表明, 细菌对于非天然氨基酸的依赖性可以维持几百代而出现任何的逃逸个体.同时他们也证明, 通过进化使遗传改造生命体依赖于非天然氨基酸的策略也可以在多种生物中实现预期的防逃逸效果, 如弗氏志贺菌、肠道沙门氏菌、鲁氏耶尔森菌、不动杆菌等.
同时这种策略也可以用来解决病毒疫苗的安全性. Wang等[39]首先在HIV病毒的必需蛋白中引入了UAG终止密码子, 在体外构建了非天然氨基酸依赖型的HIV-1病毒.在非天然氨基酸存在的条件下, 病毒可以实现正常的复制过程.而病毒在非天然氨基酸缺失的情况下, 则无法形成成熟的病毒个体.利用同样的策略, Si等[40]成功构建了复制受限的活体流感疫苗.通过在病毒体内引入三个及以上的终止密码子, 非天然氨基酸依赖型的病毒最终的逃逸概率降到了可以检测的水平之下(小于10-11).改造后的病毒在体内存在复制缺陷, 但是可以引起较好的免疫反应.这位构建安全、高效的病毒疫苗开拓了新的方向.
除了引入翻译层次的非天然氨基酸, 人们还试图在人工生命体的DNA复制层次引入非天然核苷酸.研究人员已经开发出了多种人工合成的核苷酸对, 并且验证了它们能够在体外和体内环境下, 被复制扩增和转录为RNA序列.例如, Kimoto等[41]发展的合成碱基对: Ds & Px, 能够通过PCR过程被掺杂入被复制的DNA双链; Yang等[42]开发的全新的人工碱基对: Z & P, 并有效地将其插入到双螺旋中, 通过PCR进行复制[43], 并且进一步实现了通过T7 RNA聚合酶进行转录[44].另一组研究团队开发的合成碱基对: d5SICS-dMMO2[45] & d5SICS-dNAM[46], 同样能够被扩增和被转录.另一方面, 在大肠杆菌体内, 合成碱基对可以特异地和相对稳定地插入到质粒序列中, 并且保持很高的复制保真度, 可以跟随宿主DNA复制很多代[47].
为了实现遗传改造的人工生命体的防逃逸控制, 人工设计的正交型复制遗传因子, 还需要和下游的翻译元件联系起来, 才能行使完整的核心生命功能. Zhang等[48]报道了第一个可以将非天然核苷酸编码的遗传信息, 解码为蛋白质序列的人工生命遗传系统(图 4B).与自然碱基对通过氢键互补配对不同, 他们所采用的核苷酸对(dNaM-dTPT3)通过疏水作用实现特异性配对[49].此人工生命遗传系统中包含正交性复制密码、交性转正录密码和正交性翻译码, 因此实现了整个中心遗传法则的正交化设计, 只是这样的正交化密码子还是嵌合在占主导地位的自然密码子之中.这代表人工生命体的正交化程度得到了极大的提高.如果将功能蛋白质与细胞核心的功能关联起来, 这将会变成一种更加高效的人工生命体防逃逸系统.
除了非天然氨基酸和非天然核苷酸之外, 由于小分子对酶进行变构调节的现象广泛存在于生物中, 我们也可以通过让生物依赖于合成的辅因子, 从而控制人工生命体的逃逸现象. Lopez等[50]建立一个定向进化平台(SliDE)筛选工程化的大肠杆菌必需蛋白发挥作用所需外源添加的辅助分子.利用SliDE平台, 研究人员工程化改造了大肠杆菌BL21菌株, 使其3个必需基因(tyrS、metG、pheS)依赖于苯并噻唑(benzothiazole)发挥作用(图 4C).这种防逃逸技术相对于基因组重编码更加经济, 同时我们可以利用SLiDE平台靶向更多的基因, 使其功能依赖于在结构或者化学机制上离自然代谢产物相差更大的合成化学物质.由相关的研究表明, 变构调节相关的位在不同的同源蛋白质结构上相对保守, 这使得在模式生物中的先关研究可以应用到其他的物种.
中心法则的复制、转录和翻译过程与生物每一个基因的维持和表达都有关系.通过对中心法则中涉及复制、转录与翻译过程的分子机器的正交化设计与改造, 正交化系统的遗传信息不仅宿主相互隔离开, 同时也阻绝了与其他生物的遗传信息交流.这样可以更加深层次地实现遗传改造生命体与自然生物的正交化, 增强遗传防火墙的防逃逸能力, 为构建生物防逃逸系统提供了更多的可能.
DNA复制是生命的最基础的过程之一, 正因如此, 宿主自身的复制系统难以在体内进行大规模的操控和修改. 2014年, Ravikumar等[51]发现并且改造了一种来自酵母线性质粒pGKL1和pGKL2的自私复制系统pGKL1/2, 此系统针对线性基因组进行复制, 拥有完全独立于宿主的复制机制.在K. lactis pGKL1/2系统中, pGKL1(约9.8 kb)和pGKL2(约13.5 kb)均为线性、高拷贝的双链DNA质粒, 其在K. lactis细胞质中通过蛋白质起始的复制过程进行扩增(图 5A).两种质粒的5’端均与末端蛋白共价连接作为末端蛋白介导的DNA扩增过程的复制原点.所以在复制和转录过程所需的组成均在编码于pGKL2质粒, 而第二种DNA聚合酶, TP-DNAP1则编码于pGKL1质粒.由于此系统为蛋白质起始的复制过程并且与细胞核基因组存在物理隔离, 所以pGKL1/2系统与自然的复制系统是相互正交的.
(A) Orthogonal DNA polymerases; (B) orthogonal RNA polymerases; (C) orthogonal ribosomes and orthogonal mRNA translation system; (D) Ribo-T; (E) mirror genetic system
最常见的正交化转录系统是噬菌体RNA聚合酶[52].噬菌体编码的RNA聚合酶首先在大肠杆菌的T7噬菌体中发现.噬菌体RNA聚合酶可以识别噬菌体基因组的启动子, 进而启动一系列与噬菌体复制和繁殖相关基因的表达.噬菌体T7 RNA聚合酶是一种单一肽链的聚合酶, 分子大小约为100 kDa, 大约只有细菌RNA聚合酶复合物的四分之一.由于噬菌体RNA聚合酶只能识别特定的启动子序列, 造成T7 RNA聚合酶-启动子组合可以形成与宿主隔离的调控网络, 用于转录特定的基因, 从而实现与宿主转录系统的正交化(图 5B).
原核生物的翻译起始由30S核糖体亚基(与相关联的起始因子结合)与核糖体结合位点调节. RBS序列和30S亚基中16S核糖体RNA的3'末端互补配对, 进一步在多种因子的作用下起始翻译过程.正交化核糖体(O-核糖体)特定的转录正交化的mRNA(O-mRNA), 而不与内源的核糖体与mRNA产生相互干扰(图 5C).通过对核糖体RNA的小亚基与对应的mRNA的引导序列进行改造, Rackham等[53]开发了相应的方法用于O-核糖体- O-mRNA组合的筛选与表征.随后Chubiz等[54]开了计算机设计方法用于细菌中O-核糖体的理性化设计. An等[55]则通过将正交化的T7 RNA聚合酶和O-核糖体相互组合创建了正交化的基因表达通路.
原核中的核糖体主要由两部分组成, 分别是30S和50S亚基.在上述O-核糖体设计中, 改造的30S亚基仍需要与细胞内原本的50S亚基相互作用, 因此O-核糖体的相关设计仍无法独立于宿主本身. Orelle等[56]设计了一种名为“Ribo-T”核糖体避免了这个问题. Ribo-T核糖体将16S和23S RNA(分别为30S和50S亚单位的组分)连接成单一的共价RNA链, 最终30S和50S亚基在细胞内将作为一个整体发挥作用.细菌内的Ribo-T核糖体不仅可以正常执行翻译过程(图 5D).同时Ribo-T可作为细胞中唯一的核糖体, 维持正常的细菌生长.
O-核糖体为构建正交化的合成生物系统提供了重要的基础, 同时也为构建遗传改造生命体防逃逸系统提供了可行的思路. Jia等[57]利用正交化的核糖体构建了O-核糖体防火墙系统.此系统包含两部分:激活线路和降解线路.激活线路利用的是一个“与”门, 它利用O-核糖体对加密的通路进行特定的激活.同时研究人员同时设计了一种降解线路, 其受控于特定的环境信号, 作用是对O-rRNA质粒进行切割.在缺失某些特定的信号时, 比如IPTG, 降解线路会被诱导从而移除O-rRNA质粒, 从而避免O-rRNA质粒的横向基因转移. O-核糖体防火墙系统在遗传改造生命体防逃逸、生物技术知识产权保护上具有广泛的应用价值.
虽然存在极少数的情况, 生命体利用D型氨基酸如动物大脑中的D型天门冬氨酸或者L型糖如植物体内的L型阿拉伯糖, 但是中心法则以及绝大多数生物大分子都遵循单一的手性原则:即蛋白质由L型氨基酸, 而DNA/RNA由D型核苷酸构成.虽然自然生命体在进化过程中选择了单一手性的原因我们还未探究清楚, 但并没有一种已知的物理或者化学定律阻止生命体利用互为镜像的分子系统.这也为实现人工生命体的防逃逸提供了可能:构建依赖于D型氨基酸或者L型核酸的镜像生命体可以实现与自然生命体的正交化, 由于自然的遗传中心法则中生物大分子无法利用镜像分子, 这也就隔绝了自然与人工生命体之间的遗传信息交流, 从而实现人工生命体的防逃逸.
Wang等[58]从头合成了一种由D型氨基酸组成的镜像聚合酶-D型非洲猪瘟病毒聚合酶X (D-ASFV pol X).这一镜像聚合酶能以L型DNA为模板, 完成L型DNA或者L-RNA链的合成, 即D-ASFV pol X同时具有L型DNA与RNA的聚合酶活性, 使得镜像版本的DNA复制和转录这两个中心法则的关键步骤得以实现(图 5E).虽然D-ASFV pol X的持续合成能力较低且热稳定性差, 目前还不能在生命体内发挥作用, 但这为构建镜像生命体提供了可能, 也为实现人工生命体防逃逸提供了一种潜在的选择.
上述各种人工生命体防逃逸策略, 包括营养缺陷型生物、设计自杀开关、基因流屏障和部分正交化生命设计策略, 大多针对的都是单一的靶点.一般来说, 这种策略都不足以实现高效的生物防逃逸效果, 工程改造的微生物可以通过突变、重组等进化方式使防逃逸系统失效[59]或者产生对抗毒性基因的免疫能力[60], 这使得人工设计的细胞能够在非受控的环境中繁殖富集, 导致最终逃逸概率超过环境释放允许的上限.有研究表明在人工设计的生物防逃逸系统中引入冗余性可以增强防逃逸能力的稳定性和鲁棒性.通过在系统中引入冗余性, 遗传改造生命体想要实现逃逸必须在多个位点进行基因组或者表观基因组的突变才能突破所有的防逃逸系统.同时由于存在多种独立的防逃逸系统, 细胞突破防逃逸系统的时间和分裂代数均明显增加, 进而逃逸率大幅降低.所以要实现高效稳健的人工生命体防逃逸效果, 通常需要利用复杂的基因网络设计, 在系统中综合利用多种防逃逸策略, 建立具有多层次、复杂逻辑的人工生命体防逃逸系统.
Chan等[61]利用复杂的基因线路, 设计“Deadman”和“Passcode”防逃逸系统.其中, “Deadman”基因线路由两个相互抑制转录的抑制蛋白组成的双稳系统.为了让细菌在逃逸后翻转到死亡状态, 通过修改核糖体结合位点RBS的强度, 研究人员使得整个线路更倾向于TetR抑制蛋白的表达.我们需要在体系中加入脱水四环素(aTc)促进抑制蛋白(LacI)的表达, 而LacI抑制蛋白会进一步抑制毒性蛋白的表达或者促进必需基因的转录.一旦细菌逃逸到不含aTc的环境中, 毒性蛋白就会表达, 同时关键的必需基因表达也会受到抑制, 从而快速地清除逃逸的个体(图 6A).当“Deadman”基因线路单独控制必需基因或者毒蛋白表达时, 并没有达到理想的效果.之后研究人员通过将两种策略组合, 此种策略的防逃逸效果得到了显著的提升.
(A) Deadman; (B) passcode; (C) geneGuard; (D) biocontainment based on multiple genetic networks
Chan等[61]设计的另一种防逃逸系统称为“Passcode”基因线路.它利用人工设计的杂合转录因子, 通过响应不同的环境信号对基因表达和细胞生死状态进行调控(图 6B).基于“Passcode”系统, 我们可以根据多个环境信号调控转录因子的活性, 从而调控毒性基因或者必需基因的表达, 实现对遗传改造生命体的逃逸控制.通过整合多种环境信号, 提高了系统的灵敏性和鲁棒性, 倘若其中一个信号丢失, 系统就会表达毒蛋白或者抑制必需基因的表达, 造成人工生命体的死亡.
Wright等[29]开发了一种名为“GeneGuard”的人工生命体防逃逸系统, 此系统中不同质粒均依赖于特定的宿主细菌, 同时对其他的宿主具有毒性作用. “GeneGuard”系统利用多种调控策略, 包括条件性复制起始, 营养缺陷型和毒性基因-抗毒性基因组合等(图 6C). “GeneGuard”将质粒复制起始因子置于宿主基因组, 必需基因thyA或者dapA则从基因组转移到了质粒, 这确保了质粒和宿主之间的依赖性.同时研究人员也利用毒性基因-抗毒基因组合确保了承载重组DNA的质粒会在其他的宿主中表达毒性蛋白, 避免重组DNA在不同宿主之间转移的可能性.
Gallagher等[62]同样也开发一种基于多种策略的复杂系统用于生物防逃逸, 此系统整合了核糖调控子(多种外源信号分子调控必需基因的表达), 核酸酶—甲基化酶系统, 营养缺陷型和外源提供的抑制因子(进一步限制防逃逸系统的错误激活)(图 6D).添加有四层防逃逸措施的遗传改造菌种在长期的培养中展现了较高的鲁棒性, 同时逃逸概率小于2×10-12, 这是运用基因线路策略至今文献报道的最低的逃逸率.
在真核细胞酵母中, Cai等[63]利用转录和重组酶等多种方式控制多种必需基因的表达, 开发了一种多层次的防逃逸系统.其中组蛋白基因受到诱导型启动子的控制, 而工程化改造基因则由不同的重组分别调控.结果表明单独的防逃逸系统逃逸概率小于10-6, 而多种防逃逸系统同时激活后额逃逸概率则降到了无法检测的水平(＜10-10).
利用复杂的基因网络, 整合多种防逃逸策略会使细胞产生逃逸突变所需的时间和群体数量都会大大增加, 从而逃逸几率也随之大大下降.在未来的防逃逸系统中, 我们还可以将正交化的遗传中心法则策略整合进复杂的基因网络之中, 从而实现更加高效的人工遗传改造生命体防逃逸系统.
合成生物学领域是近20年以来发展最快的领域之一, 有报告称到2025年合成生物学在化工产物、医药、能源和农业等领域市场将会超过560亿美元.但是合成生物学快速发展也带来一定的社会问题和生态挑战.遗传改造生命体应用的推广, 将伴随着应用场景走向更开放的环境.这也将带来潜在生物安全问题, 所以我们需要在遗传改造生物中设计和建立高效的防逃逸机制.人工遗传改造生命体满足严格的生物安全标准, 不仅仅是为了消除潜在风险, 也为合成生物学在开放环境的应用铺平道路, 同时也是可以提高工业生产的效率, 比如, 使细菌能够免于噬菌体的侵染, 或者保护工业菌株的专利财产.
近期在合成生物学领域的发展, 尤其是生命体基因组编辑和从头化学合成技术、正交性遗传密码技术以及高鲁棒性遗传开关的设计与构建, 使得我们可以设计高效鲁棒的防逃逸系统.这些系统不仅相比于原来更加有效, 同时相对来说在不同生物系统间更加相互兼容.然而, 尽管我们已经设计了多种遗传改造生命体防逃逸系统, 更大的问题是:这些系统在实际的应用中能够有多好的表现?虽然我们开发的系统在很大程度上已经考虑到了防逃逸技术的各个方面, 但仍有很大的提升空间.首先, 利用传统的防逃逸系统如营养缺陷、自杀开关以及基因流屏障往往可以通过基因突变、代谢物交互共生等方式突破此类简单的防逃逸屏障, 不可避免地会导致逃逸个体的出现.其次, 尽管利用正交化的遗传中心法则策略在构建防逃逸系统上可以实现极高水平的防逃逸效率[8a, 8b], 但在生命体内引入完成合成的化学物质也存在一定的问题, 如合成化学物质对生命体的在进化上的影响现还未研究清楚, 同时还有潜在的毒性和免疫原性[64].最后, 尽管复杂基因网路的优势在于引入冗余的策略, 通过多种策略综合应用提高防逃逸系统的效率; 但是, 基因网络复杂性的提高可能占用过多的细胞资源, 对细胞的生长带来负担, 造成遗传改造生命体原有的功能无法实现或者受到负面影响.
同时, 现阶段对遗传改造生物的安全标准的评价比较单一.现有的实验室评价方法在逃逸率低于10-11时就已经无法再检测出逃逸的个体[8b].但实验室的细胞培养数量相对于工业生产是非常小的.另一方面, 缺少标准的培养基测试防逃逸系统在不同环境下的实际效果是我们面临的另一个难题.比如Rover等[8a]在血液培养基和土壤提取物中测试了其防逃逸系统的效果, 但是这些只是人工遗传改造生命体可能应用的几个有限的场景之一.
所以我们仍然需要开发新的人工遗传改造生命体防逃逸系统, 通过引入冗余策略的同时, 避免占用过多的资源对细胞的生长产生影响.同时我们还需要建立统一的标准、多样化的模拟环境对防逃逸系统的效率进行测试, 让人工遗传改造生命体可以应用到更多的开放式的环境之中.
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图 1 传统遗传改造生命体的防逃逸策略
Figure 1 Established biocontainment strategies of genetically modified organisms
(A) Auxotroph; (B) simple kill switches; (C) inducible gene switch to control essential gene; (D) gene flow barrier
图 2 构建Pt/HPT分子依赖型大肠杆菌。
Figure 2 Creation of engineered dependency on Pt/HPt
(A) Schematic of the engineered P metabolic pathway for biocontainment; (B) concept for the biocontainment strategy using engineered dependency on Pt/HPt
图 3 正交化遗传中心法则的示意图。
Figure 3 Schematics of orthogonal central dogma
(A) The central dogma applies to most living organisms. Genetic information is stored by DNA replication, decoded into functional proteins by a transcription-translation process, and ultimately guides the life process; (B) the orthogonalization of central dogma includes two aspects, the introduction of non-natural chemicals into nucleic acids and proteins, and the orthogonalization of macromolecular machines
图 4 正交化中心法则中的非天然物质
Figure 4 The introduction of non-natural chemicals into the central dogma
(A) Unnatural amino acid; (B) unnatural nucleotide; (C) synthetic ligand
图 5 正交化的分子机器
Figure 5 Orthogonalization of macromolecular machines
(A) Orthogonal DNA polymerases; (B) orthogonal RNA polymerases; (C) orthogonal ribosomes and orthogonal mRNA translation system; (D) Ribo-T; (E) mirror genetic system
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