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• 保罗霉素(paulomycin)是由链霉菌产生的一类结构特殊的糖苷类天然产物.保罗霉素由A环(ring A)、D-阿洛糖(D-allose)、保罗酸(paulic acid)和八碳分枝糖(paulomycose)四部分组成(图 1)^[1].保罗霉素具有很好的抗革兰氏阳性细菌活性, 尤其对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌活性, 包括对青霉素、链霉素、新霉素、大环内酯类耐药的葡萄球菌^[2].此外, 保罗霉素能够杀死吞噬细胞内的葡萄球菌^[3].动物实验表明, 保罗霉素具有良好的抗肿瘤活性, 经保罗霉素类抗生素proceomycin、U43120 (paulomycin)处理过的实验小鼠的寿命明显高于对照组^{[4, 5]}.

  图 1

  

  图 1.  保罗霉素及其类似物的结构式

  Figure 1.  Structures of paulomycins and its analogues

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  关于保罗霉素类化合物的研究最早可追溯到1964年日本科学家从链霉菌Streptomyces albolongus nov. sp.的培养基中分离到的proceomycin^[4], 次年Mitscher等^[6]分离获得理化性质类似的抗生素senfolomycin, 随后Paul、Haňka和Dietz等从Streptomyces paulus Dietz sp. n (NRRL8115)中分离到U-43120^[5].由于前期实验条件限制及保罗霉素的不稳定性, 直到1984年其化学结构才被解析.保罗霉素是一类混合物, 主要成分是paulomycin A和paulomycin B, 其结构式如图 1所示.随后, 对保罗霉素的研究进入高速阶段, 一系列的保罗霉素类化合物保罗霉素A₂、C、D、E、F及保罗霉素衍生物paldimycin A (273_1α)、paldimycin B (273_1β)、273a_2α、273a_2β和U-77802、U-77803等相继被发现并鉴定^[7~9].保罗霉素良好的生物活性使其一度成为美国Upjohn制药公司的研究焦点, 但保罗霉素的不稳定性阻碍了其成为药物前体分子.保罗霉素结构中保罗酸部位含有异硫氰基团(N=C=S)及碳碳双键使得该类化合物不稳定, 易于在碱性条件下降解失去保罗酸, 形成无活性的保罗霉胺; 酸性条件下, A环上的羟基易脱水而失去生物活性. Argoudelis等利用N-乙酰化的L-半胱氨酸对保罗酸部位进行修饰, 获得比保罗霉素更稳定的paldimycin A、paldimycin B, 但二者的抗菌活性却比保罗霉素A、保罗霉素B要低一个数量级^[8].此外, 2017年, 在Streptomyces albus J1074中分离得到了保罗霉素A、B中保罗酸与一分子N-乙酰半胱氨酸加成后分子内环化的产物——四个含有五元杂环的保罗霉素类化合物.进一步研究发现这四个化合物也比保罗霉素A、B更稳定, 但抗革兰氏阳性细菌的活性却显著降低^{[10, 11]}.

  本实验室对保罗霉素的产生菌Streptomyces paulus NRRL8115进行基因组扫描测序, 通过生物信息学分析及对多个基因的遗传阻断与互补, 确定了保罗霉素的生物合成基因簇, 并推测了保罗霉素的生物合成过程; 同时, 通过过表达正调控基因pau13获得了保罗霉素的高产菌株^{[8, 12]}.基于前期实验室关于保罗霉素的研究, 本研究旨在通过直接向保罗霉素产生菌的发酵液中添加小分子硫醇类化合物, 使其与保罗酸发生加成反应, 以获得稳定性提高的保罗霉素类化合物, 从而避免直接分离不稳定的保罗霉素.通过添加N-乙酰半胱胺(SNAC), 我们获得了新结构保罗霉素衍生物palsimycins A、B、C、D.抗菌活性实验表明, palsimycin A、palsimycin B对金黄色葡萄球菌等测试菌株的最小抑菌浓度(MIC)与paulomycin A、paulomycin B的MIC值在同一水平.酸碱稳定性实验表明, 相同条件下, palsimycins A、B、C、D的稳定性均优于paulomycin A、paulomycin B.

  1.   结果与讨论

  1.1   通过加成获得保罗霉素衍生物

  我们尝试向保罗霉素高产菌株的发酵液中添加苯乙硫醇、苯硫醇钠及SNAC后, 质谱鉴定均检测到发生了修饰的保罗霉素衍生物.其中, 以添加SNAC效果最佳(图 2).通过批量发酵、分离纯化及结构鉴定添加SNAC后的产物, 我们获得了四个新结构的保罗霉素衍生物palsimycins A、B、C、D.

  图 2

  

  图 2.  保罗霉素产生菌发酵液中添加SNAC的HPLC图

  Figure 2.  HPLC analysis of the fermentation broth of paulmycin producing strain with SNAC

  WT, fermentation broth of paulmycin producing strain; WT+SNAC, fermentation broth of paulmycin producing strain with SNAC; A, palsimycin A; B, palsimycin B; C, palsimycin C; D, palsimycin D

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  1.2   Palsimycins结构鉴定

  Palsimycin A:根据HR-MS/ESI结果推测的分子式为C₄₂H₆₄N₄O₁₉S₃ (m/z: [M+Na]⁺为1047.3259, [M+ Na]⁺计算值1047.3327), UV光谱中特征吸收峰λ_max分别在246、277、321 nm, 保罗霉素A的特征吸收峰λ_max为235、274、321 nm, 推测在保罗霉素A的保罗酸部分加成了两分子的SNAC.

  通过与保罗霉素A的¹H NMR谱进行比对, 发现palsimycin A与保罗霉素A的信号非常相似^[12], 只是缺少了保罗霉素A保罗酸中的碳碳双键的信号, 同时多出了两分子SNAC的信号.相比于保罗霉素A, palsimycin A中H-2" (δ 5.08)信号的出现以及H-3"信号位移的降低(δ 6.83到δ 3.53), 表明其中一分子的SNAC与保罗霉素A中保罗酸的双键进行了Michael加成, 并且H-3"与C-1""的HMBC相关进一步确证了以上推断.同时通过H-1"""与C-5"的HMBC相关, 确认了另一分子的SNAC通过亲核加成与保罗酸的异硫氰酸基团相连.详细的2D NMR相关分析(包括HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY谱)确证了palsimycin A的结构, 如图 3所示.

  图 3

  

  图 3.  Palsimycin A的结构式和部分COSY及HMBC信号

  Figure 3.  Structure of palsimycin A and selected COSY and HMBC correlations of palsimycin A

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  Palsimycin B:根据HR-MS/ESI结果推测的分子式为C₄₁H₆₂N₄O₁₉S₃ (m/z: [M+Na]⁺为1033.3068, [M+ Na]⁺计算值1033.3170), UV光谱中特征吸收峰λ_max分别在246、277、322 nm, 推测在保罗霉素B的保罗酸部分加成了两分子的SNAC.

  通过与保罗霉素B的¹H NMR谱进行比对, 发现palsimycin B与保罗霉素B的信号非常相似^[12], 只是缺少了保罗霉素B保罗酸中的碳碳双键的信号, 同时多出了两分子SNAC的信号.相比于保罗霉素B, palsimycin B中H-2" (δ 5.08)信号的出现以及H-3"信号位移的降低(δ 6.82到3.52), 表明其中一分子的SNAC与保罗霉素B中保罗酸的双键进行了Michael加成, 并且H-3"与C-1""的HMBC相关进一步确证了以上推断.同时通过H-1"""与C-5"的HMBC相关, 确认了另一分子的SNAC通过亲核加成与保罗酸的异硫氰酸基团相连.详细2D NMR相关分析(包括HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY谱)确证了palsimycin B的结构, 如图 4所示.

  图 4

  

  图 4.  Palsimycin B的结构式和部分COSY及HMBC信号

  Figure 4.  Structure of palsimycin B and selected COSY and HMBC correlations of palsimycin B

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  Palsimycin C:根据HR-MS/ESI结果推测的分子式为C₃₇H₅₃N₃O₁₈S₂ (m/z: [M+Na]⁺为892.2840, [M+Na]⁺计算值892.2766), UV光谱中特征吸收峰λ_max分别在239、321 nm, 与保罗霉素B区别在于保罗酸部分的吸收, 同时根据分子量, 推测palsimycin C在保罗霉素B的保罗酸部分加成了一分子的SNAC.

  通过与保罗霉素B的¹H NMR谱进行比对, 发现palsimycin C与保罗霉素B的信号非常相似^[12], 只是缺少了保罗霉素B保罗酸中的碳碳双键的信号, 同时多出了一分子SNAC的信号.相比于保罗霉素B, palsimycin B中H-2" (δ 5.10)信号的出现以及H-3"信号位移的降低(δ 6.82到δ 3.51), 表明其中一分子的SNAC与保罗霉素B中保罗酸的双键进行了Michael加成, 如图 5所示.

  图 5

  

  图 5.  Palsimycin C的结构式

  Figure 5.  Structure of palsimycin C

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  Palsimycin D:根据HR-MS/ESI结果推测的分子式为C₃₇H₅₃N₃O₁₈S₂ (m/z: [M+Na]⁺为892.2840, [M+Na]⁺计算值892.2766), UV光谱中特征吸收峰λ_max分别在237、321 nm, 与保罗霉素B区别在于保罗酸部分的吸收, 同时根据分子量, 推测palsimycin D在保罗霉素B的保罗酸部分加成了一分子的SNAC.

  通过与palsimycin C的¹H NMR谱进行比对, 发现palsimycin D与palsimycin C的信号非常相似, 分析palsimycin D的HMBC谱图, 发现有H-3"与C-5"的相关信号, 确认了一分子的SNAC先与异硫氰酸基团发生亲核加成, 随后与碳碳双键进行Michael加成, 在保罗酸部分形成了五元杂环的结构.详细的2D NMR相关分析(包括HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY谱)确证了palsimycin D的结构, 如图 6所示.

  图 6

  

  图 6.  Palsimycin D的结构式和部分COSY及HMBC信号

  Figure 6.  Structure of palsimycin D and selected COSY and HMBC correlations of palsimycin D

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  1.3   抗菌活性评价

  采用肉汤微量稀释法, 以革兰氏阳性菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CGMCC 1.89)、抗甲氧西林葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)^[13]、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC 35984)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis 1.14)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)^[14]、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)^[15]为测试菌株, 评价palsimycins A~D的抗菌活性, 并与paulomycin A、paulomycin B相比较, 同时以万古霉素为阳性对照.实验结果如表 1所示, palsimycin A、palsimycin B对各测试菌株的抗菌活性与paulomycin A、paulomycin B处于同一水平, 而经一分子SNAC修饰的保罗霉素衍生物palsimycin C、palsimycin D的抗菌活性均弱于paulomycin A、paulomycin B.此外, 含有特殊五环结构的palsimycin D的抗菌活性要显著优于在保罗酸的碳碳双键部位加成一分子SNAC的palsimycin C. palsimycin A、palsimycin B及paulomycin A、paulomycin B对大多数测试菌株的最小抑菌浓度(MIC)与阳性对照万古霉素处于同一数量级, 对肺炎链球菌的MIC明显低于万古霉素, 显示了这类化合物良好的抑菌活性.

  表 1

  

  表 1  Palsimycins A~D与paulomycins A、B的抗菌活性比较(μg/mL)

  Table 1.  Comparison of inhibition activities of palsimycins A~D and paulomycins A, B against G⁺ bacteria

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  Compd.	Palsimycin A	Palsimycin B	Palsimycin C	Palsimycin D	Paulomycin A	Paulomycin B	Vancomycin
  Staphylococcus aureus	0.04	0.04	32	0.3	0.04	0.04	0.08
  MRSAa	0.04	0.04	32	0.3	0.04	0.04	0.08
  Staphylococcus epidermidis	0.08	0.08	2.5	0.15	0.08	0.08	0.15
  Enterococcus faecali	0.15	0.15	64	0.6	0.15	0.15	0.08
  Streptococcus pyogenes	0.08	0.08	64	0.3	0.08	0.08	0.08
  Streptococcus pneumoniae	0.08	0.08	64	0.3	0.08	0.08	＞0.3
  aMethicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA.

  1.4   稳定性评价

  与保罗霉素性质类似, palsimycin A-D对热敏感、在酸性及碱性条件下不稳定.酸性条件下, A环羟基脱水, 溶液由无色转变为淡黄色而失去生物活性.由表 2可知, pH=2时, palsimycins A~D降解的速度慢于paulomycin A及paulomycin B, 36 h后palsimycins A~D分别保留大约51%、60%、42%及32%, 而paulomycin A、paulomycin B分别只保留大约12%、23%.碱性(pH=9)条件下, palsimycins A~D在25℃放置12 h后, 分别保留大约76%、83%、89%、84%, paulomycin A、paulomycin B分别保留大约49%及50%;而放置36 h后, 与paulomycin A、paulomycin B的剩余量(33%、31%)相比, palsimycins A~D (48%、50%、54%、58%)的降解速度更慢.因此, palsimycins A~D在酸性及碱性条件下都要比paulomycin A、paulomycin B更稳定.

  表 2

  

  表 2  Palsimycins A~D的稳定性评价(%)

  Table 2.  Evaluation (%) of the stabilities of palsimycins A~D

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  Compd.	pH=2 (12 h)	pH=2 (36 h)	pH=9 (12 h)	pH=9 (36 h)
  Palsimycin A	81.6±2.4	51.0±2.0	76.3±5.3	48.3±1.1
  Palsimycin B	80.3±2.7	60.0±2.7	83.3±2.2	50.0±7.3
  Palsimycin C	80.3±3.6	42.3±1.1	88.7±1.8	54.0±5.3
  Palsimycin D	76.3±2.2	32.3±2.4	84.0±4.0	58.3±6.4
  Paulomycin A	33.1±1.8	11.6±1.8	49.0±2.0	33.0±3.3
  Paulomycin B	44.6±3.1	23.3±2.4	50.3±3.6	31.3±2.4
  a以0 h各化合物的量为100%.

  1.5   讨论

  向保罗霉素的高产菌株发酵液内直接添加小分子硫醇类化合物SNAC, 因SNAC结构中的亲核基团SH可与保罗酸部位碳碳双键及N=C=S发生加成反应而能直接获得保罗霉素衍生物, 所得到的衍生物在稳定性上都优于保罗霉素的主要成分A和B, 避免了直接分离不稳定的保罗霉素.当SNAC与paulomycins A、B发生反应时, SNAC既可加成到N=C=S部位, 也可与碳碳双键部位发生加成.从构效关系来看, 双加成的保罗霉素衍生物抑菌活性明显优于单加成的保罗霉素衍生物.在单加成的palsimycins C和D中, 环化的palsimycin D的抑菌活性明显优于线形的palsimycin C.此外, 在发酵产物中也检测到paulomycin A与一分子SNAC的加成产物, 因产量的限制, 而未进行进一步的分离纯化.

  2.   结论

  通过直接向保罗霉素产生菌的发酵液中添加小分子硫醇类化合物SNAC, 经分离纯化及结构鉴定, 我们获得了新结构保罗霉素衍生物palsimycins A、B、C、D.通过抗菌实验我们发现保罗酸部位加成两分子SNAC的palsimycin A、palsimycin B的抗菌效果与paulomycin A、paulomycin B处于同一水平, 而palsimycin C及palsimycin D的抗菌活性相对较弱.稳定性实验揭示, palsimycins A、B、C、D性质与paulomycin A、paulomycin B类似, 在酸、碱性条件下会降解, 但相同条件下, 均比paulomycin A、paulomycin B更加稳定.因此, 本研究通过保罗酸部位的加成, 在不降低这类化合物抑菌活性的前提下, 提高了保罗霉素的稳定性, 为该类化合物的进一步研究和应用奠定了基础.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  采用Apollo C18分析柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm, Alltech, Deerfield, IL, USA)及C18半制备柱(Zorbax SB- C18, 9.4 mm×250 mm, 5 μm, Agilent Technologies. Santa Clara, CA, USA)进行化合物分析及制备.质谱采用Agilent 1260/6460 Triple-Quadrupole LC/MS系统(Agilent, Santa Clara, CA, USA)、HR-MS/ESI数据采集分析使用Agilent 1260 HPLC/6520 QTOF-MS仪器(Santa Clara, CA, USA), NMR光谱数据采集使用Bruker-500 NMR光谱仪(Billerica, MA, USA).实验所用试剂为化学纯或分析纯, 购买后未做进一步处理, 所用溶剂均为分析纯. SNAC由本实验室王敏老师合成.

  3.2   细菌的发酵与喂养

  采用两段式发酵, 以GS-7 (pharmamedia 20 g/L, 葡萄糖20 g/L, 氨水将pH调节至7.2)为种子液培养基, 以R5α (每升的组成为:蔗糖100 g, 葡萄糖10 g, 六水合氯化镁10.2 g, 3-N-吗啉代丙磺酸21 g, 酵母提取物5 g, 硫酸钾0.25 g, 酸水解酪蛋白0.1 g, 微量元素液2 mL, 氢氧化钠调pH至6.85;其中, 微量元素液/L:氯化锌40 mg, 六水合氯化铁200 mg, 二水合氯化铜10 mg, 四水合氯化锰10 mg, 十水合四硼酸钠10 mg, 四水合钼酸铵10 mg)为发酵培养基.种子液于28 ℃、220 r/min摇床培养48 h, 以体积分数为4%的量接种于R5α发酵培养基内, 同时将SNAC以体积分数为0.1%加入发酵培养基内, 28 ℃、220 r/min摇床发酵培养4 d.

  3.3   化合物的提取与分离

  发酵完成后, 5000 r/min、离心20 min, 弃菌体, 上清经乙酸乙酯萃取、浓缩, 采用硅胶柱色谱及C18反相柱色谱进行初步分离, 得到粗制品.粗制品经高效液制备柱进一步纯化, 获得相应化合物.

  3.4   色谱分析方法

  采用Apollo C18分析柱对分离纯化过程中的保罗霉素衍生物进行检测, 以乙腈以及0.06%的甲酸水溶液为流动相, 流速为0.8 mL/min, 乙腈的浓度: 0~5 min, 10%; 5~25 min, 10%~90%; 25~30 min, 90%~100%; 30~35 min, 100%; 35~38 min, 100%~10%; 38~45 min, 10%.进样体积为20 μL, 检测波长为235、274及320 nm.

  3.5   抗菌活性评价

  选取革兰氏阳性菌株金黄色葡萄球菌(Staphyl-ococcus aureus CGMCC 1.89)、抗甲氧西林葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC 35984)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis 1.14)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)为测试菌株, 评价palsimycins A、B、C、D的抗菌活性, 并与paulomycin A、paulomycin B相比较, 同时以万古霉素为阳性对照.采用Mueller-Hinton (MH)肉汤微量稀释法进行最小抑菌浓度(MIC)值的测定, 以不加菌液组为阴性对照、不加化合物组为阳性对照, 读取MIC值.每组实验重复三次.

  3.6   稳定性评价

  恒定温度25 ℃时, 评价在酸性(pH=2)以及碱性(pH=9)条件下, palsimycins A、B、C、D及paulomycin A、paulomycin B放置12、36 h后, HPLC检测, 测量各化合物峰面积的剩余百分比, 以0 h时各化合物的峰面积为100%, 每组实验重复三次.

  3.7   波谱数据

  (S)-5-((2R, 3R, 4S, 5R, 6R)-5-(((2R, 3R)-3-((2-乙酰氨基乙基)硫基)-2-((((2-乙酰氨基乙基)硫基)羰基)氨基)丁酰基)氧基)-6-(乙酰氧基甲基)-3-羟基-4-(((2R, 4S, 5S, 6S)-5-羟基-4-甲氧基-6-甲基-5-((S)-1-(((S)-2-甲基丁酰基)氧基)乙基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-2-氨基-5-羟基-3, 6-二氧代环己-1-烯-1-羧酸(palsimycin A): ¹H NMR (500 MHz, acetone-d₆) δ: 5.36 (q, J=6.8 Hz, 1H, H-7'), 5.13 (m, 1H, H-1'), 5.08 (d, J=6.6 Hz, 1H, H-2"), 4.77 (dd, J=2 Hz, 10 Hz, 1H, H-11), 4.49 (q, J=6.8 Hz, 1H, H-5'), 4.23 (m, 1H, H-10), 4.10 (m, 1H, H-12), 3.94 (m, 1H, H-13), , 3.88 (m, 1H, H-13), 3.82 (d, J=10 Hz, 1H, H-8), 3.68 (m, 1H, H-9), 3.64 (m, 1H, H-3'), 3.53 (m, 1H, H-3"), 3.40 (m, 2H, H-2"""), 3.35 (s, 3H, H-3'-OMe), 3.31 (t, J=7 Hz, 2H, H-1"""), 3.50 (m, H, H-2""'), 3.26(m, 1H, H-2""'), 3.16 (m, 2H, H-5), 2.77 (m, 1H, H-1""'), 2.64 (m, 1H, H-1""'), 2.45 (m, 1H, H-2"'), 2.00 (s, 3H, H-2""), 2.24 (m, 1H, H-2'), 1.96 (m, 1H, H-2'), 1.94 (s, 3H, H-4"""), 1.88 (s, 3H, H-4""), 1.72 (m, 1H, H-3"'), 1.53 (m, 1H, H-3"'), 1.35 (d, J=6.8 Hz, 3H, H-4"), 1.29 (d, J=6.8 Hz, 3H, H-8'), 1.24 (d, J=6.8 Hz, 3H, H-6'), 1.18 (d, J=7.0 Hz, 3H, H-4"'), 0.96 (t, J=7.0 Hz, 3H, H-5"'); ¹³C NMR (125 MHz, acetone-d₆)δ: 199.6, 199.2, 188.8, 175.6, 175.6, 171.1, 170.6, 170.2, 168.4, 159.8, 99.5, 99.5, 78.6, 76.9, 76.9, 74.9, 74.1, 72.6, 70.4, 69.8, 68.2, 68.2, 64.6, 63.2, 57.1, 48.4, 41.9, 40.4, 39.2, 38.5, 34.6, 31.4, 31.1, 27.1, 22.8, 22.6, 20.5, 18.9, 17.2, 15.8, 15.7, 11.8. HRMS calcd for C₄₂H₆₄N₄O₁₉S₃Na [M+ Na]⁺ 1047.3327, found 1047.3259.

  (S)-5-((2R, 3R, 4S, 5R, 6R)-5-(((2R, 3R)-3-((2-乙酰氨基乙基)硫基)-2-((((2-乙酰氨基乙基)硫基)羰基)氨基)丁酰基)氧基)-6-(乙酰氧基甲基)-3-羟基-4-(((2R, 4S, 5S, 6S)-5-羟基-5-((S)-1-(异丁酰氧基)乙基)-4-甲氧基-6-甲基四氢- 2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-2-氨基-5-羟基- 3, 6-二氧代环己-1-烯-1-羧酸(palsimycin B): ¹H NMR (500 MHz, acetone-d₆) δ: 5.35 (q, J=6.0 Hz, 1H, H-7'), 5.13 (d, J=2 Hz, 1H, H-1'), 5.08 (m, 1H, H-2"), 4.78 (dd, J=2 Hz, 8 Hz, 1H, H-11), 4.51 (q, J=6.0 Hz, 1H, H-5'), 4.23 (m, 1H, H-10), 4.13 (m, 1H, H-12), 3.91 (m, 2H, H-13), 3.83 (d, J=10 Hz, 1H, H-8), 3.70 (m, 1H, H-9), 3.65 (dd, J=4.85 Hz, 11.0 Hz, 1H, H-3'), 3.52 (m, 1H, H-3"), 3.41 (m, 2H, H-2"""), 3.34 (s, 3H, H-3'-OMe), 3.32 (m, 2H, H-1"""), 3.29 (m, 2H, H-2""'), 3.16 (m, 2H, H-5), 2.78 (m, 2H, H-1"'"), 2.65 (m, 1H, H-2"'), 2.00 (s, 3H, H-2""), 2.24 (m, 1H, H-2'), 1.98 (m, 1H, H-2'), 1.94 (s, 3H, H-4"""), 1.88 (s, 3H, H-4""'), 1.35 (d, J=6.85 Hz, 3H, H-4"), 1.28 (d, J=6.85 Hz, 3H, H-8'), 1.24 (d, J=6.0 Hz, 3H, H-6'), 1.20 (d, J=7.0 Hz, 3H, H-4"'), 1.18 (d, J=7.0 Hz, 3H, H-3"'); ¹³C NMR (125 MHz, acetone-d₆)δ: 199, 198, 188.1, 175.5, 175.5, 169.9, 169.7, 169.2, 167.8, 159.2, 99.8, 98.8, 78, 77.9, 76.1, 74.2, 73.5, 71.9, 70, 69.8, 69.2, 67.4, 63.9, 62.4, 56.4, 47.7, 39.7, 39.7, 38.7, 33.9, 30.4, 30.4, 22.1, 21.9, 19.8, 18.7, 18.6, 15.2, 15. HRMS calcd for C₄₁H₆₂N₄O₁₉S₃Na [M+Na]⁺ 1033.3170, found 1033.3068.

  (5S)-5-((2R, 3R, 4S, 5R, 6R)-5-((3-((2-乙酰氨基乙基)硫基)-2-异硫氰酸丁酰基)氧基)-6-(乙酰氧基甲基)-3-羟基- 4-(((2R, 4S, 5S, 6S)-5-羟基-5-((S)-1-(异丁酰氧基)乙基)-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃- 2-基)-2-氨基-5-羟基-3, 6-二氧代环己-1-烯-1-羧酸(palsimycin C) : ¹H NMR (500 MHz, acetone-d₆) δ: 5.36 (q, J=6.8 Hz, 1H, H-7'), 5.10 (d, J=5 Hz, 1H, H-2"), 5.04 (m, 1H, H-1'), 4.77 (dd, J=2 Hz, 9 Hz, 1H, H-11), 4.56 (q, J=6.3 Hz, 1H, H-5'), 4.24 (m, 1H, H-10), 4.15 (m, 1H, H-12), 3.94(m, 1H, H-13), 3.85 (m, 1H, H-13), 3.84 (d, J=10 Hz, 1H, H-8), 3.70 (m, 1H, H-9), 3.65 (m, 1H, H-3'), 3.51(m, 1H, H-3"), 3.50 (m, 2H, H-2""'), 3.34 (s, 3H, H-3'-OMe), 3.31(m, 1H, H-1""'), 3.23 (m, 1H, H-1""'), 3.17 (m, 2H, H-5), 2.64 (m, 1H, H-2"'), 2.00 (s, 3H, H-2""), 1.94 (m, 1H, H-2'), 2.22 (m, 1H, H-2'), 1.88 (s, 3H, H-4""'), 1.35 (d, J=6.8 Hz, 3H, H-4"), 1.29 (d, J=6.8 Hz, 3H, H-8'), 1.24 (d, J=6.3 Hz, 3H, H-6'), 1.21 (d, J=7.0 Hz, 3H, H-3"'), 1.18 (d, J=7.0 Hz, 3H, H-4"'). HRMS calcd for C₃₇H₅₃N₃O₁₈S₂Na [M+Na]⁺ 892.2766, found 892.2840.

  (S)-5-((2R, 3R, 4S, 5R, 6R)-5-(((4R, 5S)-2-((2-乙酰氨基乙基)硫基)-5-甲基-4, 5-二氢噻唑-4-羰基)氧基)-6-(乙酰氧基甲基)-3-羟基-4-(((2R, 4S, 5S, 6S)-5-羟基-5-((S)-1-(异丁酰氧基)乙基)-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-2-氨基-5-羟基-3, 6-二氧代环己- 1-烯-1-羧酸(palsimycin D): ¹H NMR (500 MHz, acetone-d₆) δ: 5.35 (q, J=6.0 Hz, 1H, H-7'), 5.13 (d, J=2 Hz, 1H, H-1'), 5.08 (m, 1H, H-2"), 4.78 (dd, J=2 Hz, 8 Hz, 1H, H-11), 4.51 (q, J=6.0 Hz, 1H, H-5'), 4.23 (m, 1H, H-10), 4.13(m, 1H, H-12), 3.91 (m, 2H, H-13), 3.83 (d, J=10 Hz, 1H, H-8), 3.70 (m, 1H, H-9), 3.65 (dd, J=4.85 Hz, 11.0 Hz, 1H, H-3'), 3.52 (m, 1H, H-3"), 3.34 (s, 3H, H-3'-OMe), 3.29 (m, 2H, H-2""'), 3.18 (m, 2H, H-5), 2.78 (m, 2H, H-1""'), 2.65 (m, 1H, H-2"'), 2.00 (s, 3H, H-2""), 2.24 (m, 1H, H-2'), 1.98 (m, 1H, H-2'), 1.88 (s, 3H, H-4"'"), 1.35 (d, J=6.85 Hz, 3H, H-4"), 1.28 (d, J=6.85 Hz, 3H, H-8'), 1.24 (d, J=6.0 Hz, 3H, H-6'), 1.20 (d, J=7.0 Hz, 3H, H-4"'), 1.18 (d, J=7.0 Hz, 3H, H-3"'); ¹³C NMR (125 MHz, acetone-d₆) δ: 197.5, 187.4, 175.1, 169.3, 168, 167, 158.5, 97.7, 79.1, 77.3, 77.1, 74.6, 73.5, 72.8, 71.2, 69.1, 69, 68.5, 66.6, 61.4, 55.6, 48.5, 47.1, 38.4, 33.2, 31, 29.6, 21.2, 19.1, 18, 17.1, 15.9, 14.5, 14.3. HRMS calcd for C₃₇H₅₃N₃O₁₈S₂Na [M+Na]⁺ 892.2766, found 892.2840

  辅助材料(Supporting Information)  palsimycin A、palsimycin B、palsimycin C及palsimycin D的HRMS、UV光谱、¹H NMR、¹³C NMR、COSY、HSQC和HMBC谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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     Wiley, P. F.; Mizsak, S. A.; Baczynskyj, L.; Argoudelis, A. D. J. Antibiot. 1984, 37, 1273. doi: 10.7164/antibiotics.37.1273

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• 

  图 1  保罗霉素及其类似物的结构式

  Figure 1  Structures of paulomycins and its analogues

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  图 2  保罗霉素产生菌发酵液中添加SNAC的HPLC图

  Figure 2  HPLC analysis of the fermentation broth of paulmycin producing strain with SNAC

  WT, fermentation broth of paulmycin producing strain; WT+SNAC, fermentation broth of paulmycin producing strain with SNAC; A, palsimycin A; B, palsimycin B; C, palsimycin C; D, palsimycin D

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  图 3  Palsimycin A的结构式和部分COSY及HMBC信号

  Figure 3  Structure of palsimycin A and selected COSY and HMBC correlations of palsimycin A

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  图 4  Palsimycin B的结构式和部分COSY及HMBC信号

  Figure 4  Structure of palsimycin B and selected COSY and HMBC correlations of palsimycin B

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  图 5  Palsimycin C的结构式

  Figure 5  Structure of palsimycin C

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  图 6  Palsimycin D的结构式和部分COSY及HMBC信号

  Figure 6  Structure of palsimycin D and selected COSY and HMBC correlations of palsimycin D

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  表 1  Palsimycins A~D与paulomycins A、B的抗菌活性比较(μg/mL)

  Table 1.  Comparison of inhibition activities of palsimycins A~D and paulomycins A, B against G⁺ bacteria

  Compd.	Palsimycin A	Palsimycin B	Palsimycin C	Palsimycin D	Paulomycin A	Paulomycin B	Vancomycin
  Staphylococcus aureus	0.04	0.04	32	0.3	0.04	0.04	0.08
  MRSAa	0.04	0.04	32	0.3	0.04	0.04	0.08
  Staphylococcus epidermidis	0.08	0.08	2.5	0.15	0.08	0.08	0.15
  Enterococcus faecali	0.15	0.15	64	0.6	0.15	0.15	0.08
  Streptococcus pyogenes	0.08	0.08	64	0.3	0.08	0.08	0.08
  Streptococcus pneumoniae	0.08	0.08	64	0.3	0.08	0.08	＞0.3
  aMethicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA.

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  表 2  Palsimycins A~D的稳定性评价(%)

  Table 2.  Evaluation (%) of the stabilities of palsimycins A~D

  Compd.	pH=2 (12 h)	pH=2 (36 h)	pH=9 (12 h)	pH=9 (36 h)
  Palsimycin A	81.6±2.4	51.0±2.0	76.3±5.3	48.3±1.1
  Palsimycin B	80.3±2.7	60.0±2.7	83.3±2.2	50.0±7.3
  Palsimycin C	80.3±3.6	42.3±1.1	88.7±1.8	54.0±5.3
  Palsimycin D	76.3±2.2	32.3±2.4	84.0±4.0	58.3±6.4
  Paulomycin A	33.1±1.8	11.6±1.8	49.0±2.0	33.0±3.3
  Paulomycin B	44.6±3.1	23.3±2.4	50.3±3.6	31.3±2.4
  a以0 h各化合物的量为100%.

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