蛋白质的翻译后修饰指经过核糖体翻译后得到的蛋白质发生共价化学修饰的过程.这些翻译后修饰广泛地存在于细胞核蛋白、胞质蛋白及胞膜蛋白上[1].由于蛋白质组学与串级质谱技术的发展, 越来越多的新型翻译后修饰模式被发现[2], 它们调控了细胞的结构与功能.例如组蛋白上含有的大量翻译后修饰, 其对染色体结构[3]和基因转录具有重大的调控作用[4].其中, 赖氨酸侧链氨基可以进行烷基化、酰基化等一系列翻译后修饰.例如一种最为常见的赖氨酸烷基化修饰是甲基化(包括单甲基化Kme、双甲基化Kme2和三甲基化Kme3)[5, 6], 它广泛存在于组蛋白、转录因子和非组蛋白中[7]并起到重要作用[8](图 1, a).而酰基化具有极高的结构多样性, 到目前为止人们已经发现至少有二十种不同的修饰模式(图 1, b)[9].例如最近由组学新发现的丁二酰化赖氨酸广泛存在于多种模式生物的蛋白质组[10], 尤其是细胞的代谢酶类和线粒体中参与三羧酸循环的酶类[11].
(a) Lys methylation as example of alkylation; (b) Lys acylation
为了进一步在分子水平上探索翻译后修饰蛋白质的作用机制[12], 首先需要获得足量的含有特定翻译后修饰的蛋白质[13].但是, 这些翻译后修饰蛋白的天然含量极低且分布分散, 很难直接分离纯化得到.且翻译后修饰通常处于高度动态变化中, 因此难以得到均一修饰的蛋白质样品[14].同时, 传统的基因工程手段也很难从基因转录上直接控制异源表达蛋白的翻译后修饰模式.利用生物化学的方法, 在细胞内过表达修饰酶[15]或细胞外酶促反应[16], 可以实现一些目标蛋白质的翻译后修饰[17], 但是由于已知的翻译后修饰酶的种类有限, 且大部分酶对于氨基酸位点选择性很差, 酶法合成含有翻译后修饰蛋白质的策略仅仅适用于少数几种特殊位置的修饰[18], 尤其是对于赖氨酸这样在蛋白质中广泛存在的氨基酸更是难以实现位置特异性地修饰.
为克服翻译后修饰的蛋白质难以获取的问题, 合成化学与化学生物学家们发展了以蛋白质的化学合成与非天然氨基酸引入法为例的一系列解决方法.具体地, 包括: (1)蛋白质化学合成方法, 该方法基于自然化学连接的全合成或者基于表达蛋白连接的半合成法; (2)基于终止密码子改造的非天然氨基酸引入法[19]; (3)基于生物正交化学反应以及其拓展[20].本文将总结赖氨酸翻译后修饰蛋白质样品制备方法的最新研究进展, 特别是“非天然氨基酸修饰法”, 即在目标蛋白中引入非天然氨基酸后, 进而进行化学修饰的方法[21], 并讨论其在制备含有翻译后修饰蛋白质特别是特殊和新型赖氨酸翻译后修饰蛋白质[22]中的应用.
随着多肽与蛋白质合成化学的不断发展[23], 尤其是以自然化学连接(NCL)反应及其衍生反应为代表的蛋白质化学连接法[24]已得到长足的发展[25, 26], 使得蛋白质化学全合成或半合成理论上可以制备任何具有天然或非天然结构的蛋白质[27].同时, 人们还发展了基于收敛法的新型连接策略[28].目前, 化学全合成技术已经实现了很多带有重要翻译后修饰(例如乙酰化修饰、泛素化修饰)的蛋白质样品的制备[29].典型例子如Ottesen课题组[30]利用三片段法首先合成了在56位含有乙酰化的组蛋白H3 (Scheme 1).尤其是带有三甲基化赖氨酸结构的蛋白质, 目前只有用蛋白质全合成手段进行有效制备的报道[31].化学合成方法通常需要经过多肽连接反应, 所合成得到的蛋白质粗品需要经过高效液相色谱(HPLC)纯化, 该步骤导致总体效率降低.而纯化后的蛋白质通常需要复性后才能用于进一步的生物化学实验[32], 这使得化学合成方法通常比蛋白质的生物表达更加繁琐而耗时.当然, 随着多肽固相合成(SPPS)和蛋白连接技术的日益完备, 人们可以轻易地在多肽链中引入的翻译后修饰或其类似物的种类逐渐增加, 这也预示着蛋白合成方法的应用范围将会越来越广.
对于含有翻译后修饰赖氨酸的蛋白质, 一个最为直接的制备方法是在蛋白质的生物表达过程中直接引入.在“终止密码子改造技术”中, 人们首先需要通过筛选或改造得到特定的正交氨酰tRNA合成酶/tRNA配对[33], 进而抑制三种终止密码子之一的“琥珀密码子”(TAG)以实现非天然氨基酸通过核糖体蛋白质合成机器的引入[34].
随着终止密码子改造技术的发展, 到目前为止已有约两百种不同的非天然氨基酸被位置选择性地引入到蛋白质中(图 2)[35].由于结构与吡咯赖氨酸(1)的相似性, 非天然氨基酸嵌入技术成功实现了一些结构简单的赖氨酸翻译后修饰的引入[36], 例如乙酰化赖氨酸(2), 丙酰化赖氨酸(3), 丙烯酰化赖氨酸(4), 丁酰化赖氨酸(5)等传统的翻译后修饰[37]以及一些近年来发现的新型修饰如反-丁烯酰化赖氨酸(6)和β-羟基丁酰化赖氨酸(7)等[38].但非天然氨基酸嵌入方法需要针对每一种非天然结构筛选对应的氨酰tRNA合成酶, 该正反筛选过程耗时耗力.同时, 由于氨酰tRNA合成酶具有非极性的活性位点, 因此很难实现带有负电荷的修饰, 如丙二酰化、丁二酰化(琥珀酰化)以及戊二酰化等的定点引入.此外, 由于氨酰tRNA合成酶的活性位点空间有限, 该酶无法识别结构复杂或体积巨大的翻译后修饰, 包括以棕榈酰化为代表的长脂肪链的酰化修饰和以泛素化为代表的多肽酰基化修饰等[39].因此, 我们需要发展新策略实现这些特殊翻译后修饰的引入.
在传统的生物正交反应策略中, 我们可以将蛋白质中的半胱氨酸都突变为丙氨酸而仅仅保留其中一个我们感兴趣的半胱氨酸进行化学修饰[40].然而, 由于赖氨酸的天然丰度远高于半胱氨酸, 故而无法直接通过将其他赖氨酸突变的策略来保留一个特定位置的赖氨酸进行修饰.同时, 基于赖氨酸的突变也可能对蛋白质的基本电荷属性如等电点(pI)及水溶性等产生太大影响.所以人们一直在研究如何能够实现特异化修饰单一赖氨酸而不与其他赖氨酸侧链氨基或N-末端氨基反应的化学方法.
一种可行的策略是通过在特定的位点引入一种带有保护基团的赖氨酸, 并进行一步至多步的化学反应以实现特定的修饰.这些侧链带有特殊保护基的赖氨酸也被称为“掩蔽赖氨酸”, 可以发生类似于脱保护反应的“键切割反应”[41], 进而暴露出反应活性位点. “掩蔽赖氨酸”法首先通过生物表达方法在赖氨酸修饰位点引入一个含有特定保护基团的赖氨酸, 再进行一步脱保护处理或进一步化学修饰得到目标翻译后修饰蛋白.以下是两个例子, 分别采取脱保护基法制备单甲基化赖氨酸和双甲基化赖氨酸.
非天然氨基酸嵌入策略不仅可以实现Lys酰基化修饰的定点引入, 也可以用于Lys烷基化修饰, 例如单甲基化和双甲基化赖氨酸的引入.但是, 由于单甲基化赖氨酸与双甲基化赖氨酸的结构与天然赖氨酸非常相似, 它们都难以被氨酰tRNA合成酶选择性识别, 故这些修饰氨基酸不能直接通过非天然氨基酸策略引入.为解决这一问题, 2009年Chin课题组[42]基于保护-脱保护的策略.首先实现了甲基化赖氨酸的引入.他们首先使用非天然氨基酸Nε-叔丁基氧羰酰基-Nε-甲基-L-赖氨酸(8)为单甲基化赖氨酸的前体, 引入到目标组蛋白H3, 然后通过酸脱保护出去叔丁基氧羰酰基(Boc)保护基直接得到了含甲基化赖氨酸的目标蛋白.利用相同策略, Schultz课题组[43]引入了烯丙基氧羰酰基(Alloc)保护的甲基化赖氨酸9到组蛋白H2B-K27中, 再利用钌催化的Alloc脱保护得到目标修饰蛋白.此外, Liu课题组[44]在目标蛋白质中引入了一种光保护基团掩蔽的单甲基化赖氨酸.该课题组利用绿色荧光蛋白(GFP)为模型蛋白来测试该氨基酸的引入效率, 而后者在紫外光脱保护下得到甲基化赖氨酸10.此外, 还发展了多种新型的光保护基团如对-缩醛-临-硝基苄氧羰基衍生物(PCK)保护的甲基化赖氨酸11.例如Chin等[45]设计出新型光保护基团, 可以在生物兼容性的条件下脱除形成天然的赖氨酸.他们在模型蛋白有丝分裂源-激活蛋白(Mitogen- activated protein)激酶激酶(MEK)的保守序列的活性位点上引入了这一光保护的赖氨酸以调控蛋白质活性(Scheme 2).此外, 他们也将同样的光化学调控用于RNA聚合酶活性控制以调控基因转录[46].
除了上述直接脱保护得到修饰赖氨酸外, 还有一类是在脱保护后得到官能团进行后续反应进而得到天然修饰.以双甲基化为例, 虽然上述直接脱保护的方法可以有效地制备单甲基化赖氨酸, 然而Nε, Nε-双甲基化赖氨酸酸却不能用此法制备.这是因为侧链保护后的双甲基化赖氨酸将含有一个四级铵阳离子, 而氨酰tRNA合成酶活性位点具有疏水的结构难以识别这一阳离子.
2010年Chin课题组[47]首先报道了一种多步蛋白质化学反应的策略, 实现了第九位赖氨酸处含有双甲基化赖氨酸的组蛋白H3 (H3K9me2)的制备(Scheme 3, a).该方法先在需修饰位点引入Nε-叔丁基氧羰酰基-L-赖氨酸(12), 再在其他所有赖氨酸氨基上进行“全局性”的Cbz保护, 然后在酸作用下[V(TFA): V(H2O)=9: 6]将Boc保护基脱基脱保护而释放得到特定位点的赖氨酸侧链氨基, 新释放的氨基进一步与过量甲醛的还原氨基化反应得到双甲基化赖氨酸(Scheme 3, a).最后, 所有的Cbz保护基统一脱除[V(TFMSA): V(DMS): V(TFA)=1: 3: 6]得到天然赖氨酸结构.此外, Chin课题组[48]报道了另一个类似的“全局性”保护-脱保护策略合成含有第29位赖氨酸异肽键连接的双泛素蛋白.在该策略中, 由基于内涵肽的半合成策略制备所得的供体泛素蛋白含有C-末端硫酯, 而所有的赖氨酸侧链都被Cbz保护基所保护.而受体蛋白除了第29位赖氨酸为Nε-叔丁基氧羰酰基-L-赖氨酸外其他位置的赖氨酸同样被Cbz完全保护.在进行银催化的多肽连接后, 他们脱除所有的Cbz保护基后得到了天然的双泛素结构并进一步用于去泛素化酶的活性研究(Scheme 3, b).
(a) The site-specific installation of di-methyllysine; (b) the site-specific installation of ubiquitinated Lys
特别地, 虽然单甲基化和双甲基化赖氨酸都实现了间接地引入, 但是三甲基化赖氨酸的特异性引入却仍然是一个问题.一方面, 正如前文多次提到, tRNA合成酶具有疏水的活性位点, 故季铵盐阳离子难以其被所识别而直接引入.另一方面, 基于还原氨基化或者还原烷基化的间接引入策略也难以奏效, 类似的原因是无法形成带有三个烷基取代基的亚胺阳离子前体并进行还原反应.
除了上述直接脱保护得到修饰赖氨酸外, 随着最近几十年的技术进展, 蛋白质化学与生物正交反应已经成为了一个独立且丰富多彩的化学生物学分支学科[49].生物正交反应具有反应效率高、反应条件温和高效等特点, 常常被用于生物大分子的定点修饰、交联、标记、定位等[50], 是蛋白质化学生物学中一类无法替代的研究手段[51].为获得翻译后修饰蛋白质, 首先发展了基于天然氨基酸侧链的各类修饰方法[52].例如, 利用半胱氨酸巯基的亲核取代反应进行烷基化(Scheme 4, a)或巯基-烯反应, 可以实现赖氨酸翻译后修饰类似物的制备.但是这些类似物中含有硫原子, 在键长与键角上都与天然的赖氨酸有所不同[53].其次, 人们发展了脱氢丙氨酸策略用于翻译后修饰的引入.正是由于最近发展出基于金属催化的碳-碳键偶联反应[54], 脱氢丙氨酸修饰策略可以有效地避免了硫原子的引入(Scheme 4, b)[55].但所得的产物是消旋化的异构体[56].
(a) The synthesis of modified Lys mimic via Cys alkylation; (b) the direct incorporation of modified Lys via metal catalyzed cross-coupling reaction on Dha
由于基于天然蛋白质氨基酸侧链的生物正交反应有限, 并不能满足目前蛋白质化学的需求.同时, 越来越多的有机化学反应从玻璃瓶中发展至生物体内, 成为名副其实的生物正交反应[57].因此, 如果能够在表达蛋白中引入唯一的一个非天然的反应基团, 进而在该基团上发生生物正交反应, 有可能实现定点翻译后修饰蛋白的制备.得益于非天然氨基酸的引入技术的发展, 这些官能团可以发生的生物有机化学反应得以极大地拓展[58].这种非天然氨基酸嵌入——生物正交反应方法保留了非天然氨基酸引入策略与生物正交反应二者本身的优点, 既将非天然的反应基团引入到蛋白质中任意特定的位点, 同时修饰过程在近生理条件下进行, 以保证蛋白质的天然结构与功能.故而, 本方法可以极大地拓展含有翻译后修饰蛋白质的合成能力[59], 并相对于前文提到的其他方法具有不可替代的优越性, 尤其是针对一些难以制备的新型翻译后修饰.
本文将这种利用生物正交反应与非天然氨基酸引入技术相结合, 并用于制备赖氨酸翻译后修饰天然结构及其类似物的策略命名为“非天然氨基酸修饰法”.我们将分类简要介绍其原理, 进而将分类讨论这类“非天然氨基酸修饰法”在制备含有天然赖氨酸翻译后修饰蛋白质的应用.前文提到的“掩蔽赖氨酸”法也可视为第一类最为单纯的“非天然氨基酸修饰法”, 即所引入的氨基酸是仅带有一个特定的保护基团.
考虑到第2.2节“全局性”策略中Cbz保护基的统一保护与脱保护过程[V(TFMSA): V(DMS): V(TFA)=1: 3: 6]以及Boc保护基的酸脱保护[V(TFA): V(H2O)=9: 6]过程, 这些条件可能导致蛋白质变性等问题, 人们仍然需要发展其他策略. Liu课题组[60]设计并合成了一类新型的非天然氨基酸Nε-(4-叠氮苄氧羰基)-δ, ε-脱氢赖氨酸(AcdK), 在还原条件下可以发生自解离反应, 所得烯胺可以进一步水解形成醛基赖氨酸(AlK).而产物可以与外加的烷基胺类发生还原氨基化反应得到对应的烷基化修饰赖氨酸.利用本策略, 该课题组成功地在模型蛋白绿色荧光蛋白及组蛋白H3第4、9和36位点引入了双甲基化赖氨酸.由于Staudinger还原反应和还原氨基化反应都可以在生理条件下发生, 故而该策略有效地避免了蛋白质变性的问题, 而产物蛋白可以直接用于去甲基化酶的活性研究(Scheme 5, 13).值得一提的是, 此方法不仅仅适用于甲基化赖氨酸的引入.理论上说通过改变外加的烷基胺类化合物, 在还原氨基化反应后均能制得对应的烷基化赖氨酸产物.伴随着日益增长数目的赖氨酸保护-脱保护策略, 越来越多的氨基酸侧链可以实现选择性的调控[61].此策略在蛋白质化学生物学中的应用性得到了极大地拓展[62].这些新的方法为在不同的条件下制备各种不同的赖氨酸翻译后修饰提供了可能性[63].
如上文所述, 一些天然的酰基化修饰由于其大的体积导致空间位阻无法直接被氨酰tRNA合成酶所识别, 尤其是最近才被发现的一大类通过异肽键连接的小蛋白质修饰模式如泛素化(Ubiquitination)和类泛素蛋白化修饰(如Neddylation)等.泛素蛋白是一个具有76个氨基酸的小蛋白, 其在多步酶促反应作用下被引入底物蛋白的赖氨酸侧链形成异肽键[64].研究表明泛素化修饰对底物蛋白的功能调控及命运具有重大的影响.例如多泛素化修饰导致底物蛋白被蛋白酶体降解[65].蛋白质全合成与半合成[66]已经制备了在特定位置上含有泛素化修饰及其类似物的蛋白质.但是, 目前利用非天然氨基酸引入技术人们还无法实现.
考虑到异肽键本质上还是一种赖氨酸侧链上的酰胺键, 同样可以利用蛋白质全合成中的核心反应自然化学连接[67]进行制备. 2009年Chan课题组[68]首先在模型蛋白钙调蛋白(Calmodulin)中引入了两个基于半胱氨酰的非对映异构体吡咯赖氨酸类似物, 即D-半胱氨酰化- ε-L-赖氨酸和L-半胱氨酰化-ε-L-赖氨酸(14) (Scheme 6, a).在该策略中, 他们首先利用蛋白质内含子的方法表达出含有几丁质结合域(CBD)的泛素蛋白, 并通过几丁质(Chitin)亲和柱进行纯化分离.最终以2-巯基乙基磺酸钠(MESNa)反应将其转化为对应的多肽硫酯.然后, 他们在CaM的特异位点引入D-半胱氨酰化-ε-L-赖氨酸, 并进行自然化学连接反应得到泛素化的CaM.该产物与由酶催化制备的天然的泛素化CaM具有同样的生物学活性. Chin课题组[69]利用氨酰tRNA合成酶突变体引入了同样的非天然氨基酸, 并用于半胱氨酸-氰基苯并噻唑(CBT)对蛋白质进行荧光标记.
另一个类似的策略是通过在赖氨酸侧链上引入一个δ-巯基官能团, 与其本身的ε-氨基官能团共同组成类似于N-末端半胱氨酸的结构以发生硫酯交换反应. Chin课题组[70]首先于2011年报道了引入δ-巯基-L-赖氨酸与δ-羟基-L-赖氨酸两个非天然氨基酸结构, 并用于合成异肽键连接的泛素化蛋白质.但是, 由于该结构与天然赖氨酸类似, 他们并不能直接筛选出能够特异性识别的这两种氨基酸的氨酰tRNA合成酶突变体.因此, 他们设计合成出了两种前体氨基酸δ-巯基-Nε-(叔丁氧酰基)-L-赖氨酸或者δ-巯基-Nε-(p-硝基苯氧酰基)-L-赖氨酸(15) (Scheme 6, b).通过简单的脱保护反应, 二者可以解离保护基团并形成δ-巯基-L-赖氨酸, 进而发生自然化学连接反应形成异肽键.重要的是, 所得的连接产物可以进一步发生脱硫反应得到天然结构.通过本策略, 该课题组首次实现了具有天然结构的泛素二聚体与泛素化的SUMO (small ubiquitin-like modifier)蛋白的合成.
自然化学连接及其相关反应被广泛用于赖氨酸的酰基化反应.最近, Kawashima课题组[71]报道了一个基于自然化学连接的赖氨酸酰基化策略以用于制备天然或非天然的翻译后修饰.此方法可以直接用于染色体上赖氨酸的修饰.类似地, 在蛋白质全合成与半合成领域, 人们也大量地使用基于NCL (native chemical ligation, 自然化学连接)的蛋白质连接方法来制备泛素化蛋白, 例如光敏感的辅基辅助的自然化学连接[72], γ-巯基辅助自然化学连接并锌粉还原策略[73], γ-巯基辅助自然化学连接并N—O键切割策略[74]等.
除了利用自然化学连接反应外, 还有一系列其他的多肽连接方法[75].这些水溶液的连接反应最终的结果都是实现在两片段或多片段的多肽之间高效地形成酰胺键, 故而具有生物正交反应的基本特点[76], 从而具有利用到蛋白质化学中的可能性. Liu课题组还报道了一个基于叠氮基团的酰基化策略, 通过无痕Staudinger反应转化为不同酰基化赖氨酸, 以实现在蛋白质中引入不同的酰基化赖氨酸.为此, Liu课题组[77]首先进行了正负双筛选以寻找特定的吡咯赖氨酸tRNA合成酶突变体来高效地引入叠氮正亮氨酸(AznL) (16) (Scheme 7).在制备了含有叠氮正亮氨酸的蛋白质后, 他们将二苯基膦烷基硫酯与之发生无痕Staudinger反应, 并将叠氮基团转化为不同的酰基化赖氨酸.本方法相对便捷, 可以通过简单替换所使用的硫酯来制备不同种类的赖氨酸酰基化.例如, 利用二苯基膦烷基-乙酰基硫酯反应可以在特定位点引入乙酰化赖氨酸.然而直接使用二苯基膦烷基-丁二酰基硫酯却得到缺乏位置选择性的产物, 这正是由于游离的末端羧基可能进攻硫酯而形成丁二酸酐, 进一步与天然的赖氨酸侧链反应.所以, 该课题组设计了光保护的二苯基膦烷基-丁二酰基硫酯衍生物, 以掩蔽其末端的游离羧基, 在无痕Staudinger反应后通过紫外光照实现切割, 形成天然的丁二酰基化的赖氨酸.
值得一提的是, 对于丙二酰化、丁二酰化及戊二酰化等修饰, 由于它们的侧链负电荷难以被含有疏水性活性位点的吡咯赖氨酸tRNA合成酶所识别, 故难以直接引入这些修饰.这正是利用结合非天然氨基酸引入技术与生物正交反应技术的“非天然氨基酸修饰法”在天然蛋白质中间接引入丁二酰化赖氨酸的首例报道. Liu课题组在泛素蛋白上验证了方法的可行性后, 进一步在组蛋白H3上进行测试.他们选取H3K4位点并引入叠氮正亮氨酸, 通过反应制备的丁二酰化蛋白可以在体外进行折叠形成组蛋白H3-组蛋白H4四聚体(H3K4su-H4). Sirtuin是一类以NAD为辅酶的组蛋白去酰基化酶[78].前人报道Sirtuin5可以特异性地脱去丁二酰化修饰, 不过该研究以含有丁二酰化赖氨酸的多肽模型为底物[79].该课题组利用所得的组蛋白四聚体为底物证明Sirtuin5可以有效地脱去丁二酰化修饰, 而Sirtuin2却没有活性.丁二酰化是一类近来才发现的新型赖氨酸酰基化修饰模式.其在人体的蛋白质组中广泛存在, 尤其是线粒体中的三羧酸循环代谢酶上[80].该策略为进一步研究丁二酰化修饰对底物蛋白质的结构与功能调控提供了有效的途径.
值得注意的是, 由于叠氮正亮氨酸具有非极性的链状, 其结构相似于甲硫氨酸, 故直接利用大肠杆菌的甲硫氨酸-tRNA合成酶也可以竞争性地引入叠氮正亮氨酸[81], 进而用于蛋白质标记或形成蛋白质铰链产物用于蛋白质组学研究[82].然而, 这种残基替换的方法可能导致所有的甲硫氨酸都被替代, 这对于蛋白质合成化学及蛋白质组学的目的是不符合的.同时, 叠氮基团在化学生物学领域乃至整个化学学科中具有极为广泛的用途.首先, 叠氮基团可以发生Staudinger还原反应得到天然赖氨酸结构.该反应高效快速, 作为一种赖氨酸保护基与常见的酸脱保护Boc保护基、钯脱保护Alloc保护基以及紫外脱保护的光保护基, 脱保护条件都正交[83].其次, 叠氮基团可以发生铜催化的点击反应或无铜点击反应, 在生命科学中已经得到了充分的应用.综上所述, 正是由于叠氮基团与醛基都是重要的化学生物学官能团[84], Liu课题组发展了两种非天然氨基酸, 可进一步用于更为广泛的化学生物学领域.
综上所述, 直接利用非天然氨基酸引入法只能实现某些含有简单结构的酰基化赖氨酸蛋白质的制备.通过结合生物正交反应, 更多的赖氨酸翻译后修饰可以被位置特异性地引入蛋白质中. “非天然氨基酸修饰法”起源于“非天然氨基酸引入法”, 通过改变生物正交反应的试剂, 适用范围大幅度提升.不仅仅克服了筛选各自的吡咯赖氨酸tRNA合成酶过程繁琐缺点, 而且可以用于一系列无法直接引入的翻译后修饰模式, 例如丙二酰化赖氨酸、丁二酰化赖氨酸(琥珀酰化赖氨酸)、戊二酰化赖氨酸、棕榈酰化赖氨酸和泛素化赖氨酸等[85], 故在方法学上极大地提升了我们的合成能力.
从蛋白质化学的角度看, 传统的生物正交反应大多单纯基于天然氨基酸侧链或C-末端羧基与N-末端氨基.由于自然界所使用的20种蛋白质氨基酸结构非常有限, 即便添加第二十一硒代半胱氨酸或第二十二吡咯赖氨酸, 仍然只有少数的亲核性基团如半胱氨酸可以被修饰.而赖氨酸对应的生物正交反应又无法实现位置的选择性, 故人们只能使用半胱氨酸修饰法以制备翻译后修饰赖氨酸类似物, 成为潜在的研究瓶颈.在通过利用非天然氨基酸技术引入更多的官能团后, 我们所能使用的生物正交反应被极大地拓展, 并使得很多新型的有机化学反应可以从玻璃瓶中进入蛋白质化学生物学领域[86].
但是, 本方法的一个主要问题是生物正交反应的产率与机制并非如此理想化.大部分生物正交反应都需要有机溶剂的参与, 产率不够高, 且产物与反应物具有结构的相似性; 一般难以分离.同时, 绝大多数生物正交反应主要用于纯化的蛋白质的反应或细胞裂解液中的反应, 少有生物正交反应可以用于活细胞内的过程[87].这对于进一步深入地研究翻译后修饰的生物作用是十分不利的.故发展新型的生物正交反应, 拓宽其在生命科学中的应用是本领域的两大主要发展方向[88].
“后基因组”时代越来越多的发现表明, 蛋白质的各类翻译后修饰对蛋白质结构与功能的重要调控作用, 对精准翻译后修饰蛋白样品的需求也日趋迫切[89].随着翻译后修饰蛋白相关的化学生物学技术的进一步发展(包括基于天然氨基酸侧链的生物正交反应、蛋白质的化学全合成与半合成及非天然氨基酸引入法等, 详见表 1), 将深入推进蛋白质修饰的生物功能研究[90].本文总结了本领域在最近十年内的技术发展和应用进展, 详细介绍近期基于非天然氨基酸嵌入技术和生物正交反应联用策略实现Lys翻译后修饰蛋白样品制备和生物研究实例[91], 丰富蛋白质翻译后修饰研究的技术和手段[92, 93].在蛋白质合成领域, 如何能更加高效快捷地制备定点修饰的目标蛋白质仍是目前的主要研究方向之一.在优化人工蛋白合成技术的同时, 我们还需要在提高分离效率等方面努力实现蛋白质的大量制备.而对于非天然氨基酸修饰法, 发展和引入新型官能团实现新的生物正交反应仍然是一个主要研究方向.最后, 结合人工化学合成、非天然氨基酸嵌入技术以及生物正交反应等蛋白质化学生物学技术后, 我们预期所得的修饰蛋白质可以在生物化学和细胞生物学研究中得到更大规模的利用[94, 95].
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| 技术a | 优点 | 缺点 |
| 生物正交反应法 | 修饰天然氨基酸侧链, 无需蛋白质变复性 | 作为翻译后修饰类似物并非天然结构 |
| 蛋白质化学合成 | 可以制备各种天然或非天然结构 | 一般适用于中或小型蛋白质, 且需要复性 |
| 非天然氨基酸引入法 | 直接通过生物表达引入天然的翻译后修饰结构, 便捷易操作 | 需要筛选特定的tRNA合成酶, 且并不一定适用于一切翻译后修饰 |
| 非天然氨基酸修饰法 | 结合非天然氨基酸引入与生物正交反应特点, 形成天然翻译后修饰, 便捷且应用范围广 | 反应需要优化, 所得产物难以分离提纯 |
| a此处列举主要的化学生物学方法, 未包括多肽类似物法等. | ||
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图 1 赖氨酸各类翻译后修饰的结构
Figure 1 Structures of different Lys PTMs
(a) Lys methylation as example of alkylation; (b) Lys acylation
图式 1 蛋白质化学全合成方法制备乙酰化的组蛋白
Scheme 1 Preparation of acetylated histone via protein total synthesis
图 2 通过非天然氨基酸引入法直接引入的翻译后修饰赖氨酸
Figure 2 Preparation of proteins with Lys modifications via the direct incorporation of modified Lys
图式 2 单甲基化赖氨酸的间接引入方法
Scheme 2 Indirect incorporation of mono-methylated Lys via protected mono-methyllysine
图式 3 “全局性”保护赖氨酸策略以制备翻译后修饰赖氨酸示意图
Scheme 3 Scheme for the preparation of post-translationally modified Lys via "Global" protection strategy
(a) The site-specific installation of di-methyllysine; (b) the site-specific installation of ubiquitinated Lys
图式 4 利用生物正交反应方法制备翻译后修饰赖氨酸类似物示意图
Scheme 4 Preparation of Lys modification mimics via bioorthogonal reactions
(a) The synthesis of modified Lys mimic via Cys alkylation; (b) the direct incorporation of modified Lys via metal catalyzed cross-coupling reaction on Dha
图式 5 含有保护基的官能团的非天然氨基酸AcdK用于制备双甲基化赖氨酸示意图
Scheme 5 Scheme for the preparation of di-methyllysine via AcdK with non-natural functional group
图式 6 两种巯基化的赖氨酸通过自然化学连接用于制备酰基化赖氨酸示意图
Scheme 6 Preparation of acylated Lys via NCL based on two thiol-containing Lys derivatives
图式 7 叠氮正亮氨酸AznL通过无痕Staudinger反应用于制备酰基化赖氨酸示意图
Scheme 7 Preparation of acylated Lys via traceless Staudinger reaction on AznL
表 1 各种化学生物学技术在制备含有翻译后修饰蛋白质中的优缺点对比
Table 1. Comparison of advantages and disadvantages for different chemical biology techniques in the preparation of proteins with PTMs
| 技术a | 优点 | 缺点 |
| 生物正交反应法 | 修饰天然氨基酸侧链, 无需蛋白质变复性 | 作为翻译后修饰类似物并非天然结构 |
| 蛋白质化学合成 | 可以制备各种天然或非天然结构 | 一般适用于中或小型蛋白质, 且需要复性 |
| 非天然氨基酸引入法 | 直接通过生物表达引入天然的翻译后修饰结构, 便捷易操作 | 需要筛选特定的tRNA合成酶, 且并不一定适用于一切翻译后修饰 |
| 非天然氨基酸修饰法 | 结合非天然氨基酸引入与生物正交反应特点, 形成天然翻译后修饰, 便捷且应用范围广 | 反应需要优化, 所得产物难以分离提纯 |
| a此处列举主要的化学生物学方法, 未包括多肽类似物法等. | ||
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