一种基于异长叶烷酮的新型pH荧光探针及其生物荧光成像应用

引用本文: 张燕, 王忠龙, 陶钰, 徐徐, 方华, 王石发. 一种基于异长叶烷酮的新型pH荧光探针及其生物荧光成像应用[J]. 有机化学, 2018, 38(10): 2693-2699. doi: 10.6023/cjoc201803012 shu

Citation: Zhang Yan, Wang Zhonglong, Tao Yu, Xu Xu, Fang Hua, Wang Shifa. A Novel Fluorescent pH Probe Based on Isolongifolanone and Its Application in Bioimaging[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2018, 38(10): 2693-2699. doi: 10.6023/cjoc201803012 shu

一种基于异长叶烷酮的新型pH荧光探针及其生物荧光成像应用

张燕 ^a, ,
王忠龙 ^a, ,
陶钰 ^a, ,
徐徐 ^a,c, ,
方华 ^b, ,
王石发 ^{a,c,
,}

a.
南京林业大学化学工程学院南京 210037
b.
南京林业大学理学院南京 210037
c.
南京林业大学林业资源高效加工利用协同创新中心南京 210037

通讯作者: 王石发, wangshifa65@163.com

基金项目:

国家自然科学基金（No.31470529）和江苏省高校自然科学研究重大（No.14KJ220001）资助项目

摘要: 设计合成了一种基于异长叶烷酮的新型pH荧光探针7-（4'-二甲氨基苯亚甲基）异长叶烷酮（DB），并用氢谱、碳谱、质谱等方法对其结构进行表征.采用紫外吸收光谱（UV）和荧光发射光谱（FL）光谱研究了该探针对H⁺的识别性能.结果表明，DB是对H⁺具有高度选择性和可逆性的荧光探针，其荧光强度可以在一个相对较低的酸性pH范围内线性地降低.此外，DB对H⁺的专一识别能力不会受到金属离子的干扰.DB的荧光强度在酸性pH值1.0~3.5的区间内呈现出良好的线性关系，其线性回归方程为：I=174.134pH－47.836，R²=0.9936.DB在固体状态时依旧可以快速地探知环境中的三氟乙酸（TFA）气体.而且，该pH探针还成功地用于HeLa活细胞内的荧光显微成像.

关键词:

English

A Novel Fluorescent pH Probe Based on Isolongifolanone and Its Application in Bioimaging

Zhang Yan ^a, ,
Wang Zhonglong ^a, ,
Tao Yu ^a, ,
Xu Xu ^a,c, ,
Fang Hua ^b, ,
Wang Shifa ^{a,c,
,}

a.
College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037
b.
College of Science, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037
c.
Co-Innovation Center of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037

Corresponding author: Wang Shifa, E-mail:wangshifa65@163.com

Received Date: 10 March 2018
Revised Date: 22 April 2018
Available Online: 25 October 2018
Fund Project:

Project supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31470592) and the University Science Research Project of Jiangsu Province (No. 14KJ220001)

Abstract: A novel pH probe 7-(4'-(dimethylamino)benzylidene)-isolongifolanone (DB) was designed and synthesized from isolongifolanone and characterized by ¹H NMR, ¹³C NMR, and MS. The recognition properties of the probe towards H⁺ were investigated by UV-Vis and fluorescence spectroscopy. The results showed that DB exhibited highly selective and sensitive fluorescence response towards H⁺ ion, and the fluorescence intensity decreased linearly in a relatively low range of acidic pH. In addition, the recognition ability of DB towards H⁺ was not affected by various metal ions. The fluorescence intensity of DB had a linear relationship in the acidic pH range of 1.0~3.5, I=174.134pH－47.836, R=0.9936. DB was also sensitive to change in surrounding trifluoroacetic acid (TFA) vapor. Moreover, the pH probe was successfully applied to imaging extreme acidity in HeLa cells.

Key words:

pH值参数在许多化学反应和生理生化领域起着非常关键的作用^[1~7], pH值测定对了解反应机理及生理生化调节机制至关重要^{[8, 9]}.与传统的方法相比, 用于pH检测的荧光探针越来越受到关注, 其原因是荧光探针具有响应速度快、灵敏度高、选择性强、信噪比高、操作简便、具有连续检测pH值动态变化的能力等其他测定方法所无可比拟的优点^{[10, 11]}.迄今为止, 许多用于pH检测的特异性高灵敏度荧光探针都是在香豆素、罗丹明以及一些荧光剂的结构基础上开发出来的.然而, 由于荧光探针不稳定或由于在极端pH环境下一些细胞容易失活, 荧光探针的应用范围大多都集中在pH 4~8范围内^[12~17], 而适用于检测pH小于4的荧光探针则非常缺乏, 因此开发能适用于环境和生物科学领域中极端pH介质的小分子荧光探针是荧光探针研究领域的热点^[18~23].此外, 荧光探针与共聚焦激光扫描显微镜结合, 使得荧光成像技术成为连续观察生命系统中动态生化和细胞活动过程的一种最有效手段^[23].

松节油的主要成分之一长叶烯是一种三环倍半萜类化合物, 由于分子中含有活泼的C＝C双键, 可发生异构、氧化、环氧化等化学反应, 其中长叶烯经催化异构可制得异长叶烯, 再经选择性氧化制得异长叶烷酮^[25].异长叶烷酮是一种重要的化学品, 如利用其活泼的C＝O和α-H可合成具有抗肿瘤活性、驱蚊活性、杀虫活性等各种化学品^[26].由于异长叶烷酮合成具有优异生物相容性, 以其为起始物合成具有良好生物相容性的荧光探针对松节油的开发利用有着积极而深远的意义.

本文设计合成了一种基于异长叶烷酮的pH荧光探针7-(4'-二甲氨基苯亚甲基)异长叶烷酮(DB).结果表明DB具有很好的稳定性, 能快速、可逆地检测酸性pH变化. DB在酸性pH值1.0~3.5的区间内能够呈现出良好的线性响应, 其pKa可低至2.39.此外, 该探针还成功地用于HeLa细胞内荧光成像, 表明该探针可用于检测活细胞中的pH变化, 具有潜在的生物应用价值.探针化合物DB的合成路线如图 1所示.

图 1

图 1. 探针DB的合成

Figure 1. Synthesis of probe DB

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1.   结果与讨论

1.1   合成部分

合成α, β-不饱和酮化合物时, 采用的是目前最为经典的羟醛缩合反应, 整个反应进程需在酸、碱催化下完成.由于苯环上有强供电子取代基-甲氨基的存在, 使得亲核加成反应变得相对比较困难, 从而延长了反应时间.本文以有机碱为催化剂, 可以极大的缩短反应时间, 提高反应得率.

1.2   溶剂的影响

DB是一种典型的共轭芳香族化合物, 激发时发生了π→π*跃迁, 其荧光光谱容易受到溶剂极性的影响.通过对DB在不同溶剂的荧光光谱数据的对比, 发现DB的荧光光谱随着溶剂极性变化而不断变化.如图 2a所示, 随着溶剂极性增大, DB的荧光发射峰从438 nm(己烷)红移到485 nm(二甲基亚砜), 说明DB具有明显的溶剂化显色效应.通过发射波长对溶剂极性参数E_T(30)作图, 绘制了相关的作用曲线(图 2b).从曲线可以清晰的看出, 改变溶剂的极性, 化合物的荧光发射波长也随之变化.当化合物溶解在低极性溶剂中, 其发生波长较短, 而溶解在高极性溶剂中, 其发射波长明显变长.

图 2

图 2. (a) DB (1×10^－5 mol/L)在不同溶剂中的荧光光谱和(b) DB的发射波长随溶剂极性参数[E_T(30)]变化关系

Figure 2. (a) Fluorescence spectra of DB (1×10^－5 mol/L) in different solvents and (b) dependence of the emission maxima of DB on polarity parameters [E_T(30)] of solvents

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1.3   理论计算

为了进一步研究化合物DB的光物理性质, 采用密度泛函计算理论对其几何结构进行优化, 其分子最高占据轨道(HUMO)和最低占据轨道(LUMO)如图 3.化合物的分子最高占据轨道主要分布于除部分异长叶烷基以外的其他所有部分, 而其分子最低占据轨道则主要分布于不饱和酮的中心部分, 这表明了化合物存在明显的分子内电荷转移(ICT), 这也是导致其具有明显的溶剂化显色效应的原因.

图 3

图 3. DB的HOMO以及LUMO分子轨道图

Figure 3. Molecular orbital diagrams of HOMO and LUMO of DB

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1.4   不同pH对紫外吸收的影响

将探针DB溶于乙醇/水(V/V＝4/1)的溶液中, 保持为1×10^－5 mol/L的浓度, 加入盐酸配置成不同pH值的溶液, 并测得这些溶液的紫外吸收光谱(图 4).当pH从7.0降低到2.5时, DB在390 nm处吸收峰的吸收强度逐渐减低, 而当体系的pH值低于2.5时, 其吸收峰强度则急剧下降.与此同时, 在290 nm处出现了一个新的吸收峰, 并且明显增强.吸收波长发生的较大幅度的蓝移证实, 随着pH不断减小, 由于H⁺络合作用的增强, 使甲氨基的供电子能力不断下降, 从而导致探针DB的分子内电荷转移作用显著减弱(Scheme 1).此外, 通过在日光条件下对pH＝7以及1的溶液颜色对比发现, 随着溶液中pH的降低, 溶液颜色由橘黄色变成无色, 实验结果表明DB可以作为一种可视的探针用来检测溶液体系内极酸性条件下的pH变化.

图 4

图 4. (a) DB (1×10^－5 mol/L)在乙醇/水(V/V＝8/2)中随pH从7.0降至1.0时紫外吸收光谱变化图和(b) DB在290和390 nm处的吸收强度随pH降低的变化

Figure 4. (a) Change of absorption spectra of DB (1×10^－5 mol/L) in EtOH/H₂O (V/V＝8/2) with decreased pH from 7.0 to 1.0 and (b) absorption intensity changes of DB with pH decrease at 290 nm and 390 nm, respectively

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1.5   不同pH对荧光光谱的影响

为了进一步考察探针DB对pH的识别能力, 测定了DB (1×10^－5 mol/L)在不同pH溶液中的荧光光谱变化(图 5).在中性条件下, 探针DB在482 nm处有一个很强的荧光发射峰, 其斯托克斯位移可以达到92 nm, 较大的斯托克斯位移可以有助于减少激发光干扰.随着pH值的从7.0到1.0不断降低, 体系的荧光逐渐减弱, 同时在365 nm紫外灯下可以观察到溶液的荧光颜色由亮绿色变为无色.此外, 其pH响应性质在水相为主的环境中依旧可以发挥检测作用(图S1).根据482 nm处的荧光强度可以得到一条非线性的pH滴定曲线, 进而通过计算得到pKa＝2.39, 并且其荧光强度在pH值1.0~3.5的区间内呈现出良好的线性关系, 经过拟合得到线性回归方程I＝174.134pH－47.836, R²＝0.9936.通过荧光光谱滴定结果分析, 探针DB可以在对极酸的pH变化做出有效的检测和识别.

图 5

图 5. (a) DB (1×10^－5 mol/L)在乙醇/水(V/V＝8/2)中随pH从7.0降至1.0时荧光光谱变化图(λ_ex＝390 nm)和(b) DB在484 nm处的荧光强度所绘的pH滴定曲线

Figure 5. (a) Fluorescence spectra of DB (1×10^－5 mol/L) in EtOH/H₂O (V/V＝8/2) with decreased pH from 7.0 to 1.0 (λ_ex＝390 nm) and (b) pH titration curve of DB using the fluorescence emission intensity at 484 nm The inset shows the good linearity of DB in the pH range of 1.0~3.5

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1.6   耐光性与可逆性研究

耐光性和可逆性是一个评价荧光探针光学性能优劣的重要指标.因此, 我们通过测试160 min内pH值分别为1, 3, 5, 7时探针DB溶液(1×10^－5 mol/L)在482 nm处的荧光强度变化来考察其耐光性(图 6), 进一步测定了24 h内相同浓度的探针溶液在365 nm紫外灯照射下的荧光强度变化.实验结果证明探针DB不仅可以在30 s内对不同pH做出快速反应, 而且其溶液的荧光强度可以在160 min内保持稳定, 更为可贵的是, 探针溶液的荧光强度在24 h只有轻微衰减.由此可知, 探针DB溶液具有极佳的耐光性能.

图 6

图 6. DB (1×10^－5 mol/L)在pH值分别为7.0, 5.0, 3.0, 1.0时482 nm处的荧光强度变化

Figure 6. Change of the fluorescence intensity at 482 nm for DB (1×10^－5 mol/L) with time course at pH 7.0, 5.0, 3.0, 1.0, respectively

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为了进一步考察探针DB与H⁺之间反应的可逆性, 采用浓盐酸和氢氧化钠水溶液来调控探针DB溶液(1×10^－5 mol/L)的pH值在7.0与2.0之间反复转换(图 7), 并测定了相应的荧光强度.结果表明, 探针DB溶液的荧光强度可以在pH 7.0到2.0实现完全可逆, 说明探针DB可以对变化的pH系统进行检测.

图 7

图 7. DB (1×10^－5 mol/L)在482 nm处的荧光强度在pH 7.0到2.0的可逆变化

Figure 7. Reversible change of the fluorescence intensity at 484 nm for DB (1×10^－5 mol/L) between pH 7.0 and 2.0

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1.7   选择性与响应机理研究

考虑到探针DB包含羰基和氨基, 这些基团可能与金属离子存在一定的络合作用, 故在各种金属离子参与的情况下考察其溶液在pH 7.0和1.0时对H⁺的选择性(图 8).相同浓度(1×10^－5 mol/L)的各种常见的金属离子(Cr³⁺, Co²⁺, Ag⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, K⁺, La³⁺, Mg²⁺, Na⁺, Pb²⁺, Fe³⁺, Zn²⁺, Al³⁺)并没有对探针DB溶液在pH 7.0和1.0时的紫外吸收强度比(A₄₀₉ /A₃₄₂)造成显著的影响, 此外,通过测定探针DB在碱性环境中的荧光光谱, 发现碱性环境(pH＝9)不会对探针荧光性质产生影响, 表明DB是一种对H⁺具有高度选择性的荧光探针.

图 8

图 8. 金属离子存在时DB (1×10^－5 mol/L)在pH 7.0和1.0时的紫外吸收强度比(A₄₀₉/A₃₄₂)

Figure 8. Ratio of absorption intensity of DB (1×10^－5 mol/L) at A₃₉₀/A₂₉₀ at pH 7.0 and 1.0 in the presence of various metal ions

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为了研究探针的pH响应机理, 我们对比研究了加入盐酸前后探针DB的氢谱变化.甲氨基上的H-a以及苯环上邻近甲氨基的H-b, H-c的化学位移值都发生了明显的移动, 而此结构中其他位点上的氢原子则只是有轻微的偏移.实验结果表明盐酸溶液的加入使得探针DB的甲氨基上的氮原子发生了质子化, 从而抑制了探针的分子内电荷转移作用, 最后导致荧光猝灭.

1.8   应用研究

为了测定探针DB对周围酸性气体环境的灵敏性, 将DB放置于无背景光的滤纸上, 然后暴露在三氟乙酸(TFA)蒸汽中5-10s (图 9).在未熏蒸之前, 探针DB本身具有亮绿色的固体荧光, 而经过TFA熏蒸5 s之后荧光强度明显减弱, 继续熏蒸5 s之后荧光强度则完全消失, 进而继续用三乙胺(TEA)熏蒸10s后荧光强度有所恢复.此外, 探针DB还可以对不同体积分数的TFA气体的产生对应程度的荧光猝灭效应.实验结果表明固态的探针DB可以快速地对环境中的TFA蒸汽进行检测.

图 9

图 9. (a) DB在TFA蒸气熏蒸5和10 s前后的荧光图片; (b) DB经过TFA蒸气熏蒸的荧光光谱变化; (c) DB经过TFA蒸气熏蒸的荧光强度变化

Figure 9. (a) Fluorescence images of DB before and after fuming with TFA vapor for 5 and 10 s, (b) the change of fluorescence spectra of DB upon fuming with TFA vapor, and (c) the change of fluorescence intensity of DB upon fuming with TFA vapor

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采用粉末X射线衍射研究固态的探针DB对pH的响应机制(图 10).当探针1暴露在TFA蒸汽中, 随着质子化进程, 其固体表面迅速地形成一层液化膜, 导致熏蒸之后的固体粉末再难以固化. X射线衍射结果同样可以验证这一过程, 未经过任何处理的探针DB具有许多强而尖锐的衍射峰, 而经过TFA蒸汽处理(10 s)的样品则只有少数很弱的衍射峰, 这也表明TFA处理会引起化合物晶格的显著坍塌, 进而导致固体荧光强度的突然消失.

图 10

图 10. DB在TFA熏蒸前后的粉末X射线衍射谱图

Figure 10. Powder XRD patterns of DB before and after fuming with TFA vapor

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1.9   细胞成像

细胞毒性是化合物是化合物能否运用于生体内的荧光标记的首要条件, 如图S7所示, 化合物DB表现出明显的低毒以及无毒性能.为了测试探针DB能否检测活细胞内的pH变化, 将20 μmol/L的探针溶液加入到已经培养好的HeLa细胞中, 在不同pH条件下(pH＝7.0, 3.0和1.0)的培养基中于37 ℃下培养30 min后进行荧光成像(图 11), 发现pH＝7.0培养基培养的HeLa细胞发出了明亮的绿色荧光, 这说明化合物DB具有很好的细胞渗透性, 经过pH＝3.0培养基培养的HeLa细胞的荧光强度明显减弱, 而pH＝1.0培养基培养的HeLa细胞则没有观察到任何明显的荧光, 这说明化合物可以用于HeLa细胞中对极酸条件下pH变化的荧光成像, 这对检测生物体内极酸条件下pH的变化等方面有潜在的应用价值.

图 11

图 11. 20 μmol/L DB在pH为7.0, 3.0和1.0的HeLa活细胞内的荧光成像

Figure 11. Fluorescence images of 20 μmol/L DB in HeLa cells at pH 7.0, 3.0 and 1.0

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2.   结论

以异长叶烷酮为原料设计合成了一种简单新颖的pH荧光探针DB, 并采用用氢谱、碳谱、质谱等方法对其结构进行表征.随着pH值从7.0下降到1.0, 探针DB的荧光强度逐渐降低. DB的荧光强度在酸性pH值1.0~3.5的范围内具有良好的线性回归关系, 其pKa可低至2.39, 这表明探针DB可以用于强酸的pH环境的检测.探针DB在固体状态时还可以灵敏地检测周围TFA蒸气.荧光成像实验证明探针DB可以检测HeLa细胞中极酸条件下的pH变化.此外, 良好的稳定性、专一性、可逆性极大地提高了pH探针DB的潜在的应用价值.

3.   实验部分

3.1   仪器与试剂

美国Agilent 7890A气相色谱仪; 美国Agilent 5975c质谱仪; 德国Bruker AV 500核磁共振仪(TMS为内标, CDCl₃或DMSO-d₆为溶剂); 美国Nicolet 380 FT-IR红外光谱仪; 北京泰克X-6显微熔点测定仪(温度计未经校正); 2450紫外分光光度计(SHIMADZU); LS 55荧光光谱仪(PerkinElmer); 上海雷磁PHS-3C酸度计; 德国Elementar Vario EL cube元素分析仪.

异长叶烷酮购自福建省武夷香化建阳香料香精公司, 纯度80%; ZnCl₂、KCl、CaCl₂、Fe(NO₃)₃•9H₂O、Mn(NO₃)₂、Ni(NO₃)₂•6H₂O、CuCl₂•H₂O、AgNO₃、Co(NO₃)₂•6H₂O、Cd(NO₃)₂•4H₂O、CrCl₃•6H₂O为分析纯; 其他试剂均为市售分析纯, 未处理直接使用.

3.2   7-(4'-二甲氨基苯亚甲基)异长叶烷酮(DB)的制备

将2.2 g (8 mmol)异长叶烷酮, 1.49 g (10 mmol)对二甲氨基苯甲醛, 30 mL叔丁醇和0.56 g (5 mmol)叔丁醇钾依次加入配有搅拌器、温度计和回流冷凝器的50 mL三口烧瓶中, 搅拌均匀, 回流反应数小时, 至异长叶烷酮转化率达95%以上(GC跟踪检测).反应液用乙酸乙酯萃取, 经饱和食盐水洗至中性, 无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩后得到粗产物, 再经乙醇重结晶得到化合物DB.产率90.4%. m.p. 119.5~120.2 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 0.77 (s, 6H), 1.03 (s, 3H), 1.06~1.09 (m, 1H), 1.15 (s, 3H), 1.23 (d, J＝8 Hz, 1H), 1.42~1.49 (m, 1H), 1.55~1.61 (m, 1H), 1.69~1.70 (m, 1H), 1.73~1.75 (m, 2H), 1.81 (s, 1H), 2.53~2.57 (m, 1H), 2.82 (d, J＝16 Hz, 1H), 2.96 (s, 6H, Ar-N(CH₃)₂), 6.74 (d, J＝8 Hz, 2H), 7.34~7.45 (m, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 24.08, 24.47, 25.46, 25.63, 28.40, 29.92, 31.40, 37.28, 39.82, 41.76, 44.20, 47.65, 55.11, 62.28, 111.87, 122.91, 130.17, 132.68, 136.75, 150.64, 200.47; IR (KBr) ν: 2960, 2923, 2891, 2872, 1656, 1606, 1565, 1522, 1466, 1440, 822 cm^－1; EIMS m/z (%): 351 (M⁺, 100), 336 (5), 282 (10), 269 (22), 240 (4), 158 (28), 134 (28), 121 (11), 91 (9), 55 (10). Anal. calcd for C₂₄H₃₃NO: C 82.00, H 9.46, N 3.98; found C 80.97, H 9.52, N 3.82.

辅助材料(Supporting Information)  DB的核磁共振谱图和质谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
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图 1 探针DB的合成

Figure 1 Synthesis of probe DB

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图 2 (a) DB (1×10^－5 mol/L)在不同溶剂中的荧光光谱和(b) DB的发射波长随溶剂极性参数[E_T(30)]变化关系

Figure 2 (a) Fluorescence spectra of DB (1×10^－5 mol/L) in different solvents and (b) dependence of the emission maxima of DB on polarity parameters [E_T(30)] of solvents

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图 3 DB的HOMO以及LUMO分子轨道图

Figure 3 Molecular orbital diagrams of HOMO and LUMO of DB

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图 4 (a) DB (1×10^－5 mol/L)在乙醇/水(V/V＝8/2)中随pH从7.0降至1.0时紫外吸收光谱变化图和(b) DB在290和390 nm处的吸收强度随pH降低的变化

Figure 4 (a) Change of absorption spectra of DB (1×10^－5 mol/L) in EtOH/H₂O (V/V＝8/2) with decreased pH from 7.0 to 1.0 and (b) absorption intensity changes of DB with pH decrease at 290 nm and 390 nm, respectively

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图 5 (a) DB (1×10^－5 mol/L)在乙醇/水(V/V＝8/2)中随pH从7.0降至1.0时荧光光谱变化图(λ_ex＝390 nm)和(b) DB在484 nm处的荧光强度所绘的pH滴定曲线

Figure 5 (a) Fluorescence spectra of DB (1×10^－5 mol/L) in EtOH/H₂O (V/V＝8/2) with decreased pH from 7.0 to 1.0 (λ_ex＝390 nm) and (b) pH titration curve of DB using the fluorescence emission intensity at 484 nm The inset shows the good linearity of DB in the pH range of 1.0~3.5

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图 6 DB (1×10^－5 mol/L)在pH值分别为7.0, 5.0, 3.0, 1.0时482 nm处的荧光强度变化

Figure 6 Change of the fluorescence intensity at 482 nm for DB (1×10^－5 mol/L) with time course at pH 7.0, 5.0, 3.0, 1.0, respectively

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图 7 DB (1×10^－5 mol/L)在482 nm处的荧光强度在pH 7.0到2.0的可逆变化

Figure 7 Reversible change of the fluorescence intensity at 484 nm for DB (1×10^－5 mol/L) between pH 7.0 and 2.0

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图 8 金属离子存在时DB (1×10^－5 mol/L)在pH 7.0和1.0时的紫外吸收强度比(A₄₀₉/A₃₄₂)

Figure 8 Ratio of absorption intensity of DB (1×10^－5 mol/L) at A₃₉₀/A₂₉₀ at pH 7.0 and 1.0 in the presence of various metal ions

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图 9 (a) DB在TFA蒸气熏蒸5和10 s前后的荧光图片; (b) DB经过TFA蒸气熏蒸的荧光光谱变化; (c) DB经过TFA蒸气熏蒸的荧光强度变化

Figure 9 (a) Fluorescence images of DB before and after fuming with TFA vapor for 5 and 10 s, (b) the change of fluorescence spectra of DB upon fuming with TFA vapor, and (c) the change of fluorescence intensity of DB upon fuming with TFA vapor

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图 10 DB在TFA熏蒸前后的粉末X射线衍射谱图

Figure 10 Powder XRD patterns of DB before and after fuming with TFA vapor

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图 11 20 μmol/L DB在pH为7.0, 3.0和1.0的HeLa活细胞内的荧光成像

Figure 11 Fluorescence images of 20 μmol/L DB in HeLa cells at pH 7.0, 3.0 and 1.0

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