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• L-半胱氨酸(Cysteine, Cys)是一种非常重要的生物硫醇分子, 作为生命体系中谷胱甘肽^[1]、辅酶A、牛磺酸等的前体^[2]几乎存在于哺乳动物的所有细胞之中, 具有维持细胞和组织健康生长以及延缓衰老的生理功能^[3].人体中Cys浓度异常与心血管综合症^[4]、帕金森及阿尔茨海默病^[5]和不良妊娠等病症有关^[6], Cys的缺乏能引起儿童发育迟缓、头发褪色、水肿、肝损伤、皮肤损伤等不良症状^{[7, 8]}, 因而, Cys常被认为是一种生物标记物以及生理调节剂.正因如此, 生理条件下Cys高选择性高灵敏度的检测在疾病的早期诊断和治疗中显得尤为重要.

  在生物体系中, 结构和反应活性相似的同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)(图 1)是Cys检测的最大干扰硫醇分子^[9~11], 而Cys相对较低的含量(30~200 μmol/L)^[12]使其检测和生物成像难度更高.另外, Cys较低的水合能^[13]虽然有利于其在水溶液中的检测, 但在此条件下, 检测过程也可能受到CN^－的干扰.由此可见, 设计具有专一选择性、高灵敏度的Cys传感分子依旧是一项极具挑战性的工作.

  图 1

  

  图 1.  Cys, Hcy以及GSH的结构式

  Figure 1.  Structures of Cys, Hcy and GSH

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  高效液相色谱(HPLC)法是液体生物样品中Cys检测最为传统的方法, HPLC检测结果准确可靠, 但存在复杂的前处理过程以及柱后衍生技术^[14].与传统的检测方法相比, 荧光传感具有操作简单、灵敏度高、易于实现可视化检测等优势而被广泛应用于生物传感器的设计中^{[15, 16]}. 1981年Sippel^[17]利用巯基与马来酸亚胺基团之间的亲核加成反应, 开创性地设计合成了基于反应型的单分子荧光传感器并实现了Cys的可视化检测.至此, 反应型荧光检测器的设计、合成以及应用研究取得了巨大的发展.这类新型的反应型传感器通常由荧光团与反应位点之间的共价连接而形成, 不同的连接方式直接决定了传感器分子共轭体系的大小以及分子内的电子转移机制, 当与Cys作用后, 以荧光团光物理性质的变化为输出信号实现荧光“turn OFF/ON”与“turn ON/OFF”之间的转变.在Cys荧光传感器的设计中, 最常用到的两种光物理机制为光诱导电子转移机制(PET)以及分子内电荷转移机制(ICT).其中PET是指受激电子从反应位点中N, S等富电子体(电子给体, D)向非共轭相连的荧光团(电子受体, A)转移, 并导致荧光团荧光淬灭的过程^{[18, 19]}, 与Cys作用后PET受阻, 荧光团荧光恢复. ICT机制则是在D和A共轭相连的D-π-A体系中, 共轭电荷受激之后从电子给体向受体的转移过程^{[20, 21]}.与PET相比, ICT机制使传感分子处于能量更低、更稳定的状态, 因而ICT激发态荧光传感器具有更大的Stocks位移, 更长的吸收或发射波长^[22].

  最近, 基于激发态分子内质子转移机制(ESIPT)的荧光传感器也被成功应用于Cys的可视化检测. ESIPT具体是指受激分子中质子通过分子内氢键由烯醇式转移到相邻的O, N, S等杂原子而形成酮式异构体的过程, 该过程可在数个皮秒内完成, 两种构型之间的可逆转化使得ESIPT具有双激发态, 传感器表现出比率荧光发射^[23].另外, ESIPT荧光染料具有较大的Stocks位移, 能够最大程度地降低自吸收以及生物体系自荧光的干扰, 从而提高Cys检测的准确度.常见的ESIPT染料有2-(2-羟基苯基)苯并噻唑^[24]、2-(2-羟基苯基)苯并噁唑^[25]以及3-羟基黄酮^[26].当羟基被反应位点保护以后阻止了ESIPT过程, 传感器荧光较弱, 相反, 与Cys发生特异性反应后羟基脱保护, ESIPT机制使传感器荧光大大增强.遗憾的是, 基于ESIPT机制的Cys传感器报道相对较少^{[27, 28]}.

  就单分子反应型传感器而言, 目前主要有两种策略提高Cys检测的选择性和灵敏度.一是增强巯基的亲核性.结构和反应活性相似的Hcy、GSH和Cys在检测过程中相互干扰, 但Cys较低的pK_a值^[29]使其更容易在生理条件下(pH 7.4)将巯基转变为亲核性更强的硫醇盐, 因而可通过pH值的控制提高传感分子对Cys的检测选择性.二是利用Cys较小的空间效应, 有效缩短其与传感器分子之间的响应时间, 进而提高Cys检测的灵敏度.另外, 传感器分子多个反应位点^{[30, 31]}、氢键^[32]、静电等^[33]超分子弱相互作用力的存在以及分子内的环化反应过程都有利于提高Cys检测的选择性.检测灵敏度一般由传感器与Cys之间的反应速率来决定^[34].

  截止目前, 已有大量特异性检测Cys的荧光传感器被报道, 但总体而言, 这类传感器或多或少存在如下局限性: (1) Hcy和GSH以及其它氨基酸的干扰; (2)相对较长的响应时间导致灵敏度的降低, 最低检出限(LOD)很难达到nmol/L或更低的数量级; (3)较大的细胞毒性以及较差的细胞吸收率; (4)无法消除生物体系自荧光的干扰.近期所报道的基于重金属配合物以及Au或Ag纳米粒子为传感载体的集成型传感体系^[35]在一定程度上能够弥补荧光传感器的局限性, 在纯水中对Cys表现出非常高的选择性和灵敏度, 最低检出限可达nmol/L级别甚至更低^{[36, 37]}.尤其是基于纳米粒子的传感体系因为较好的生物兼容性以及独特的光物理性能, 已表现出巨大的应用潜力.

  根据Cys不同的传感机制, 本文将从基于单分子反应型传感器、基于金属配合物以及纳米材料的传感体系三大类型进行分类综述.其中单分子反应型传感器所涉及的反应类型主要包括亲核加成-环化-消除串联反应、迈克尔加成反应、亲核加成-环化反应、(硫)醚与Cys的亲核取代反应、亲核加成-消除反应以及其它类型的反应.最后, 对Cys化学、生物传感器/体系的发展做了简单的展望.

  1.   反应型单分子传感器

  1.1   基于亲核加成-环化-消除串联反应的Cys传感器

  如Eq. 1所示, 将丙烯酸酯与荧光基团直接相连便可构筑此类反应型传感器, 其中丙烯酸酯既是Cys的反应位点亦是荧光淬灭基团. Cys分子中的巯基和氨基依次和丙烯酸酯发生亲核加成-环化并消除一分子内酰胺七元环状硫醚的串联反应^[24], 同时使传感器分子转化为脱酰基化的酚类物质.丙烯酸酯基团脱保护后, 由于存在ESIPT、ICT或PET机制, 导致荧光基团发光性能的改变.而相对较大的空间位阻以及动力学不利的环化消除反应导致GSH和Hcy与丙烯酸酯的Michael加成产物的环化脱酰基反应的速率较慢^[31], 特定条件下对Cys检测几乎不存在干扰.

  (1)

  2014年, Liu等^[26]以4'-二甲基氨基-3-羟基黄酮为荧光团, 设计了Cys比率荧光传感器S1 (Eq. 2). S1在可见光的激发下只表现出较弱的荧光发射. Cys的加入导致丙烯酸酯键断裂而恢复ESIPT机制, 由此可观察到550 nm处强的绿色荧光发射. S1在水溶液中能快速(约5 min)而高选择性地检测Cys, LOD约为0.2 μmol/L, 同时还在活体细胞中对Cys实现了荧光成像.而且, Cys的检测以及荧光成像不受Hcy以及GSH的影响.由于4-二甲氨基的给电子效应对传感分子共轭体系的贡献, S1比Liu等^[27]报道的荧光比率传感器S2 (Eq. 2)表现出更高的灵敏度, C1比C2具有更大的发射波长.

  (2)

  2016年, Dong等^[38]报道了基于苯并吡喃腈的Cys双光子激发(850 nm)近红外(NIR, 702 nm)荧光传感器S3 (Scheme 1).在H₂O/二甲基亚砜(DMSO) (pH 7.4)磷酸盐(PBS)缓冲溶液中, S3在近红外区几乎无荧光发射(λ_ex＝557 nm), Cys加入后S3在702 nm出现强荧光发射, 由此实现了对Cys的NIR荧光检测.该传感器对Cys具有响应时间短(仅为2 min)、选择性高(不受Hcy、GSH和其它氨基酸的影响)以及Stocks位移大(≈150 nm)的优势, 但灵敏度不高, LOD仅为0.2 μmol/L.采用多光子激光共聚焦成像技术, S3实现了在Hep 3B细胞中的双光子NIR荧光成像(λ_ex＝850 nm).与之前Feng等^[39]报道的结果相比, 这种NIR激发和发射的荧光传感方法能够有效降低背景激发光的影响, 提高Cys检测的灵敏度和选择性, 克服深层组织成像的限制, 扩展在活体研究中的应用范围. Dong课题组^[40]所报道的荧光传感器S4对Cys表现出专一选择性, 同时, 由于4-二乙氨基的强给电子效应使其脱酰基化产物的发射光谱发生红移(λ_em＝710 nm).

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  基于S3, S4的Cys双光子NIR荧光传感

  Scheme 1.  Two-photon NIR fluorescent sensing for Cys based on S3, S4

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  基于半花箐骨架的NIR荧光传感器S5^[41](Eq. 3)在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(pH 7.4)中并无明显的荧光发射.由于Cys与S5之间的串联反应, 生成具有近红外发光性能的C5 (λ_ex＝670 nm, λ_em＝697 nm), 同时, 溶液颜色从紫色(λ_max＝582 nm)变为蓝绿色(λ_max＝674 nm).动力学实验表明, Cys与丙烯酸酯之间的环加成反应为一级反应, 反应常数为0.898 min⁻¹. S5对Cys的这种双通道检测不受其它氨基酸以及常见金属离子的影响, LOD为0.16 μmol/L.该传感器还能用于人体血清中Cys的裸眼、荧光检测.活体细胞成像实验说明S5能够检测内源性Cys分子.

  基于花青素染料的Cys近红外比色和比率荧光探针S6^[42](Eq. 4)在EtOH/HEPES (pH 7.4)溶液中, 最大吸收波长和发射波长分别为775和780 nm (λ_ex＝720 nm), 与Cys反应后, 两者分别蓝移至515和570 nm, 由此可实现Cys的比色、荧光双通道检测.动力学实验表明, S6对Cys的拟一级反应速率常数为0.23 min^－1, 远大于GSH (0.047 min^－1)和Hcy (0.029 min^－1)的对应值, 说明GSH和Hcy对Cys的检测几乎不存在干扰. S6已被应用于活体细胞中Cys的荧光成像.

  (3)

  (4)

  NIR荧光探针S7^[43] (Eq. 5)以萘基荧光素为荧光基团.在DMSO-PBS (pH 7.4)溶液中, S7无近红外吸收和发射. 5 equiv.的Cys加入后生成相应的开环产物C7, 并伴随着620 nm处吸光度逐渐增强, 溶液从无色变为蓝色, 而690 nm (λ_ex＝612 nm)处的荧光强度增大了560倍. Cys的比色、荧光双通道检测不存在干扰.动力学研究表明, 该拟一级反应可在10 min内完成, 反应速率常数为0.27 min^－1.由于S7对Cys的检测具有选择性高、灵敏度高、响应时间短、LOD (0.18 μmol/L)远低于细胞内Cys含量、无背景荧光干扰等优点, 已用于细胞内Cys的荧光成像.

  NIR开关型荧光传感器S8^[44](Eq. 6)具有线粒体靶向功能, 其中亲脂性阳离子为线粒体标记基团.由于PET机制, S8在C₂H₅OH/HEPES (pH 7.4)中无荧光发射, Cys存在下S8转化为具有NIR发光性能(735 nm)的C8. S8对Cys的检测具有高选择性和灵敏度, GSH和Hcy无影响, 响应时间为10 min, LOD低至14.5 nmol/L.这种高选择性和灵敏度正是基于不同硫醇分子与S8的分子内环合反应的动力学速率.生物实验表明, 该传感器具有较好的生物兼容性以及膜渗透能力, 可直接用于线粒体中内源性Cys的检测, 借此评估活体细胞氧化应激状态.有意义的是, 传感器分子在动物活体内实现了内源性Cys的检测和NIR荧光成像.该工作为线粒体Cys在生物体系中的功能研究提供了理论依据.

  (5)

  (6)

  基于部花青的Cys双光子荧光传感器S9^[45](Eq. 7)在DMSO/PBS (pH 7.4)溶液中对Cys表现出高选择性的比率荧光(F₅₁₈/F₄₅₂)传感. S9与Cys加成之后释放出部花青C9, 两者都具有双光子荧光发射性能.另外, S9具有很好的生物兼容性以及光稳定性, 因而能够应用于生物深层组织成像.

  (7)

  以丙烯酸酯为反应位点的传感器能够高选择性地可视化检测Cys, 是目前报道最多的一类反应型传感器, 在此不再一一赘述, 现将代表性传感器附于表 1^[46~57].

  表 1

  

  表 1  以丙烯酸酯为反应位点的传感器分子结构

  Table 1.  Structures of sensors combined with the reaction site of acrylate

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  Compd.	Structure
  S10[28]
  S11[46]
  S12[47]
  S13[48]
  S14[49]
  S15[50]
  S16[31]
  S17[51]
  S18[52]
  S19[53]
  S20[54]
  S21[55]
  S22[56]
  S23[57]

  1.2   基于Michael加成反应的传感器

  α, β-不饱和化合物(α, β-不饱和双键与强极性重键如醛基、硝基、氰基等共轭相连)与巯基发生Michael加成反应, 由于传感器分子共轭体系的破坏(电子转移机制改变), 导致分子发光现象改变.另外, 传感器分子还可通过与Cys中巯基和氨基的Michael加成-分子内亲核重排-成环等串联反应提高Cys检测的选择性.

  双通道荧光传感器S24^[58](Scheme 2)能在活体细胞中检测新陈代谢过程中产生的Cys. S24以香豆素为荧光报告基团, α, β-不饱和双键以及醛基分别为Cys及其代谢产物SO₂的检测位点, 在DMSO/PBS (pH 7.4)溶液中无明显荧光发射, Cys加入后514 nm (λ_ex＝463 nm)处的荧光增强大约130倍, 同时紫外-可见吸收光谱的最大吸收波长从475 nm蓝移至450 nm, LOD为0.46 μmol/L. Hcy较低的含量以及GSH较慢的响应速度使Cys的检测不受影响.相同条件下, SO₃^2-与醛基发生亲核加成反应生成化合物C24, 其在576 nm (λ_ex＝510 nm)出现较强的荧光发射.该传感器对的LOD为6.5 μmol/L.正是基于对Cys的选择性检测, 该传感器首次实现了生物活体细胞中Cys及其代谢物SO₂转化的实时监测.该工作能够加深对生物硫醇分子生理过程以及病理作用的理解.

  Scheme 2

  

  Scheme 2.  基于S24的Cys荧光传感

  Scheme 2.  Fluorescent sensing for Cys based on S24

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  传感器S25^[59](Eq. 8)在PBS (pH 7.4)缓冲液中最大吸收波长和发射波长分别为374和467 nm (λ_ex＝342 nm), 与Cys发生Michael加成后分子内电荷转移被抑制, 荧光显著增强, 传感过程不受其它生物硫醇及氨基酸的干扰.芘基团修饰的查尔酮由于较强的电子接收能力以及酚羟基对反应的活化作用使S25对Cys的响应时间仅为1 min, LOD低至10 pmol/L.该传感器已应用于血清及活体细胞中Cys的检测.

  (8)

  2013年, Wu等^[33]利用Cys较低的空间效应以及较其它生物硫醇更低的pK_a值而设计了基于香豆素和吡啶阳离子的Cys双通道传感器S26 (Eq. 9).在PBS缓冲液中(pH 7.4), S26自身不发光, 随着Cys浓度的增加, 溶液颜色从红色(λ_max＝475 nm)变为黄色(λ_max＝450 nm), 同时在500 nm出现明显的荧光发射.而GSH以及Hcy无类似现象. S26对Cys的检测具有响应时间短(1 min)及灵敏度高(LOD＝25 nmol/L)的优点.该传感器在生理条件下高选择性检测Cys的驱动力主要是巯基盐更强的亲核性以及羧基与吡啶阳离子之间静电吸引的协同作用. S26已被成功应用于蛋白标记以及HeLa细胞的共聚焦成像.

  (9)

  Anila等^[20]报道的Cys比色、荧光双通道传感器S27 (Eq. 10)在CH₃CN/HEPES溶液(pH 7.0)中由于ICT机制并无荧光发射, 最大吸收波长为468 nm. Michael加成产物C27的最大吸收波长蓝移至438 nm, 同时在520 nm (λ_ex＝445 nm)出现强烈的荧光发射, S27对Cys的LOD为23.65 nmol/L, 检测基本不受Hcy、GSH及其它氨基酸的干扰.该传感器能特异性检测HepG2活细胞内N-乙酰化半胱氨酸所释放的自由态Cys.

  (10)

  Kim等^[60]设计合成了基于香豆素和丙二腈共轭体的荧光传感器S28 (Eq. 11).丙二腈的存在使该传感器在DMSO/HEPES (pH 7.4)溶液中仅显示出微弱的荧光, Cys加入后由于共轭体的破坏使其在475 nm出现强烈的荧光发射.遗憾的是, 该传感器无法避免Hcy和GSH对Cys检测的影响, 对这些生物硫醇分子的LOD仅达到μmol/L级别.

  (11)

  基于硼-二吡咯亚甲基染料(BODIPY)的Cys S29^[61] (Scheme 3)以活化的炔基为Michael加成位点, BODIPY染料为荧光基团.氨基和巯基与炔基发生双Michael加成形成动力学有利的五元环状中间体, 随后, 该中间体由于retro-aza-aldol串联反应生成8-甲基BODIPY染料C29. C29在CH₃CN/PBS (pH 7.4)溶液中具有明显的绿色荧光(λ_em＝505 nm), 荧光增强了大约4500倍. Hcy、GSH以及其它氨基酸无干扰, LOD仅为0.38 nmol/L. S29已被应用在人血清以及HeLa细胞中Cys的检测和荧光成像.

  Scheme 3

  

  Scheme 3.  基于S29的Cys荧光传感

  Scheme 3.  Fluorescent sensing for Cys based on S29

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  传感器S30^[32](Scheme 4)在PBS缓冲液(pH 7.4)中对Cys、Hcy以及GSH具有相似的紫外可见光谱响应, PET机制下无荧光发射.羰基活化的炔基与巯基经由Michael加成反应生成中间体C30-1, 其中双键的自由旋转导致化合物荧光淬灭. C30-1分子内环化的亲核重排使其进一步转化为氨基取代产物C30-2, 此时, 氨基和羰基氧原子之间分子内氢键的形成抑制了碳碳双键的旋转, 因而C30-2在492 nm出现强荧光发射. Hcy中氨基较弱的亲核性使分子内亲核重排反应难度加大, 不利于中间体与氨基取代产物之间的转化, 而GSH较大的空间效应以及动力学不利的环化过程使其与传感器分子之间只发生Michael加成反应, 无分子内的亲核重排过程, 所以Hcy以及GSH在特定条件下不干扰对Cys的检测. S30对Cys的LOD为0.9 μmol/L.

  Scheme 4

  

  Scheme 4.  基于S30的Cys荧光传感

  Scheme 4.  Fluorescent sensing for Cys based on S30

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  传感器S31^[34](Eq. 12)以萘二甲酰亚胺为荧光团, 马来酰亚胺为Micheal加成位点. PET (on)和ICT (off)双淬灭机制使S31无荧光发射.马来酰亚胺依次与Cys中的巯基和氨基发生Michael加成及分子内反式环化后转化为C31, 其在ICT机制下荧光增强(473 nm).在Cys传感过程中, 动力学有利(形成六元环)的环化过程大大提高了Cys传感的选择性.而Hcy以及GSH因为动力学不利的环化过程(分别形成七元环或更大的环)使S31只转化为巯基Michael加成产物.传感器S31对Cys超灵敏的响应(LOD＝2.0 nmol/L)取决于快速的环化过程(一级反应速率为0.80 min^－1).

  (12)

  1.3   基于亲核加成-环化反应的传感器

  这类传感器以具有亲核加成反应活性的醛基为Cys的反应位点, 其中醛基依次与巯基和氨基发生加成并生成五元环状化合物, 由此改变传感器的共轭体系和荧光发射光谱.而Hcy和GSH空间位阻较大, 反应活性较低, 特定条件下不影响Cys的选择性检测.

  Diwan等^[62]构筑的基于苯并噻唑-苯基-苯并噻唑盐的大共轭传感器S32 (Eq. 13)由于ICT和ESIPT机制而对Cys具有比色及比率荧光响应.较弱的ESIPT和较强的ICT共同作用的结果使S32在497 nm有绿色荧光发射, Cys与醛基亲核加成环化的同时分子构型从醇式向酮式转变, 由此可使ESIPT增强而ICT效应减弱, 导致C32在625 nm有红色荧光发射, 在此过程中伴随着溶液颜色的明显改变.传感器对Cys的检测具有高选择性和灵敏度(LOD＝46 nmol/L).传感器已被应用在HeLa细胞的荧光成像.

  (13)

  基于BODIPY荧光团的腙类传感器S33^[21] (Eq. 14)对Cys具有比色、荧光响应能力.由于分子内电荷转移(ICT)机制, S33在500 nm以上只有微弱的荧光发射. CH₃CN/PBS (pH 7.4)溶液中, Cys与醛基加成之后由于ICT效应的增强, C33在545 nm出现强烈的荧光发射, 溶液颜色从紫色变为黄色. S33对Cys的LOD为54.6 nmol/L. Hcy、GSH在短时间内(15 min)对Cys的检测不存在干扰.由于良好的生物兼容性以及膜渗透能力, S33实现了Cys的共聚焦荧光成像.

  (14)

  1.4   基于(硫)醚与Cys亲核取代反应的荧光传感器

  Cys分子中巯基的亲核性强于氨基, 但由于动力学有利的分子内亲核重排反应, 巯基对分子内氨基的亲核性具有明显的提升作用(与不含巯基的氨基酸相比, 亲核性增强约10³倍)^[63], 当以硝基取代的芳香(硫)醚或芳香卤原子为反应位点时, 在Cys的传感过程中传感器分子首先与亲核性更强的巯基发生分子间亲核取代反应, 随后氨基与巯基取代产物进一步发生分子内的亲核重排而生成氨基取代的产物.硝基取代的芳香(硫)醚或芳香卤原子表现为吸电子诱导效应, 而氨基表现为给电子共轭效应, 如此便可通过改变激发态电子转移(ICT)的方向, 引起荧光信号的改变, 实现对Cys的检测.

  基于花青素染料的Cys NIR传感器S34^[18](Eq. 15)由于花青素与对硝基硫醇之间的PET机制而无荧光发射, Cys中巯基、氨基分别与S34发生分子间和分子内取代反应并生成化合物C34, 其在DMSO/HEPES (pH 7.4)溶液中表现出近红外荧光发射(λ_ex＝650 nm, λ_em＝750 nm). S34对Cys的LOD为1.26 μmol/L.该传感器已被成功应用于活体细胞中Cys成像.

  (15)

  BODIPY 5号位被对硝基苯(硫)酚取代而形成的两种传感器S35a和S35b^[19](Eq. 16)由于分子内PET而无荧光发射, 其氨基取代产物C35的荧光却大大增强(λ_ex＝528 nm, λ_em＝564 nm).硫醇模型分子与S35之间的反应动力学研究表明该假一级反应在体外荧光检测条件下的速率常数为0.02 s^－1.由于C—O键比C—S键更加稳定, S35a与Cys的反应活性比S35b更低, 对Cys的LOD仅为0.2 μmol/L, 但选择性不好(Hcy和GSH存在一定的干扰).该传感器在HeLa细胞中能够实现Cys的荧光检测.

  (16)

  传感器S36^[64](Eq. 17)以噻唑和嘧啶的二硼化物为荧光信号基团, 芳香氯为反应位点.缺电子的嘧啶环使得氯原子更容易与Cys中的氨基发生亲核取代反应.反应后嘧啶环的电子密度升高, 导致激发态中苯并噻唑向嘧啶环的电子转移程度下降, 进而使荧光发射发生蓝移(从472 nm移到454 nm).在体外荧光测试条件下, 其假一级反应的反应速率常数为0.062 min^－1, LOD为332 nmol/L.

  (17)

  1.5   基于亲核加成-消除反应的传感器

  对硝基苯甲酰基或2, 4-二硝基苯磺酰基(DNBS)均为强吸电子基团, 与荧光团中的羟基或巯基成酯后可作为Cys的反应位点以及传感器荧光淬灭基团. Cys分子中巯基对苯甲酰基或DNBS的亲核进攻使C—O或S—O键断裂而脱保护(DNBS可能会脱去一分子的SO₂), 传感器分子因为PET或ICT机制产生荧光信号变化.在此过程中所涉及到的反应主要有亲核加成-消除或芳香亲核取代反应.遗憾的是, 由于对硝基苯甲酰基或DNBS常与荧光团直接相连, 较大的空间位阻使Cys检测的选择性和灵敏度都不是很好, 而且Hcy以及GSH等存在一定的干扰.

  传感器S37^[65](Eq. 18)以七甲川菁为荧光团, 对Cys表现出NIR比率荧光传感.该传感器在DMSO/HEPES (pH 7.4)溶液中能够裸眼检测Cys(溶液从绿色变为红色). S37与Cys之间的亲核加成-消除产物经由π-电子重排进一步转化为酮式产物C37, 伴随着荧光发射从780 nm向640 nm的蓝移.正是基于对Cys的高选择性高灵敏度(LOD＝0.2 μmol/L), NIR荧光传感器S37可用于线粒体中Cys的检测, 并由此评估活体细胞的氧化应激状态.另外, 老鼠活体中Cys的检测不受GSH和Hcy的影响.该传感器对于生物体系中Cys生理机能的研究具有巨大的潜力.

  (18)

  基于光稳态吡咯并吡咯二酮的荧光传感器S38^[66] (Eq. 19)在DMSO/HEPES (pH 7.4)溶液中只有微弱的荧光发射, 加入Cys后, 巯基的亲核取代使DNBS基团离去, 伴随着化合物红色荧光(615 nm)增强(约15倍).传感器分子对Cys的LOD为5 μmol/L, 遗憾的是, 该传感器分子对Hcy、GSH存在一定的响应能力.由于传感器对Cys的快速检测能力以及红色荧光发射的优势, 已在HeLa癌细胞中实现了Cys的荧光成像.

  (19)

  由于BODIPY与DNBS之间的PET机制, 荧光传感器S39^[67](Eq. 20)在可见光区只有微弱的荧光发射(λ_em＝734 nm).传感器S39与Cys反应导致O—S键的断裂, PET机制受阻, 产物C39在MeCN/H₂O/DMSO (pH 7.5)溶液中表现出强的NIR荧光发射(λ_ex＝670 nm, λ_em＝755 nm).该传感器对Cys的LOD为0.5 μmol/L, 但选择性并不好, 3-氨基苯硫酚以及1-巯基辛烷对Cys的检测存在较大的干扰.

  (20)

  1.6   其它反应类型的传感器

  基于四苯乙烯聚集诱导发光分子的荧光传感器S40^[68](Eq. 21)在PBS缓冲液(pH 7.4)中无发光行为.经由芳香亲核取代生成氨基四苯乙烯, 其在水溶液中进一步聚集并诱导分子发光(λ_em＝490 nm), 在30 min的时间内, 由于GSH和Hcy较大的pK_a值以及空间位阻使其对Cys的检测几乎不存在影响, LOD为0.18 μmol/L.

  (21)

  传感器S41^[69](Eq. 22) 4号位上的氯原子被Cys中巯基作用后, 经分子内的亲核重排而重获自由的巯基进一步与临近双键发生亲核加成反应生成化合物C41.由于化合物共轭结构的破坏, 紫外可见吸收光谱最大吸收波长从573 nm蓝移至373 nm, 同时460 nm处荧光增强. S41对Cys的LOD仅为56 nmol/L, N-乙酰氨基半胱氨酸、GSH以及Hcy无干扰.该传感器已被成功应用于人血清中Cys的检测.研究发现, 传感器在肝细胞中对N-乙酰氨基半胱氨酸的吸收率高于Cys, 这为N-乙酰氨基半胱氨酸在临床上的进一步应用提供了理论依据.

  (22)

  Thanzeel等^[70]利用单分子传感器S42~S44实现了D/L-Cys绝对构型、对映体比例以及水溶液中Cys总量的检测(图 2). S42在碱性乙腈水溶液中通过与Cys之间的亲核加成-消除反应(同时消除了一分子SO₂)生成巯基和氨基分别芳基化的产物C42, 导致紫外可见吸收光谱在355 nm出现明显的吸收峰, 溶液颜色由无色变为黄色.利用355 nm对应的吸光度与浓度之间的线性关系即可检测Cys的总量. D-Cys存在时, 可在圆二色谱中观察到350, 423 nm处正的Cotton效应以及375 nm处负的Cotton效应, L-Cys存在时正好观察到相反的Cotton效应.利用正负Cotton效应的振幅与各对映异构体浓度的线性关系, 可得到Cys两种绝对构型的相对比例.需要说明的是, GSH, Hcy等氨基酸对Cys总量的检测存在一定影响, 但不影响Cys绝对构型的检测. S43以及S44可在相同条件下观察到类似的光谱变化.研究结果对生物体系中D型氨基酸的检测和生物功能的研究具有很好的指导意义.

  图 2

  

  图 2.  基于传感器S42~S44的Cys手性传感

  Figure 2.  Fluorescent chirality sensing for Cys based on S42~S44

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  2.   基于金属配合物的Cys传感体系

  在众多氨基酸中, Cys与Cu²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺等金属离子之间显示出了高于其它金属离子的强键合能力^[71], 这为构筑基于金属配合物的指示剂置换法^[72]的Cys可视化传感体系提供了理论依据.将基于荧光团的传感分子作为“指示剂”并与金属离子配位, 即可构筑“受体/指示剂”传感体系, 由于荧光团与金属离子之间的PET过程导致荧光团荧光淬灭. Cys作为竞争配体得到传感体系中金属离子, 被释放的“指示剂”由于恢复了自由状态而显示其自身的光学信号.

  两性离子配体S45^[36]为近红外荧光传感分子, Cys传感体系2S45-Cu²⁺ (Eq. 23)的N, N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液为浅黄色且无荧光发射. Cys竞争结合Cu²⁺之后释放出传感分子S45, 溶液颜色变为蓝色, 并在875 nm (λ_ex＝670 nm)出现明显的近红外荧光发射.由此实现了Cys的比色、荧光双通道检测, 检测过程不受其它氨基酸和生物硫醇的影响, 在人体血浆中对Cys的LOD为4.07 μmol/L.

  (23)

  Cys传感体系S46-Cu^2+[73](Scheme 5)在HEPES缓冲溶液(pH 7.4)中只表现出较弱的荧光发射, Cys作为第二配体夺取传感体系中的Cu²⁺离子, 由此释放出的荧光素Schiff碱进而被水解产生强荧光的荧光素甲醛(λ_em＝515 nm).该体系对Cys的LOD为9 μmol/L, 已在乳腺癌细胞中实现了Cys的生物成像.

  Scheme 5

  

  Scheme 5.  基于传感体系S46-Cu²⁺的Cys荧光传感

  Scheme 5.  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble S46-Cu²⁺

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  2016年, Singh等^[74]报道了连续检测Cu²⁺和Cys的传感器S47 (Eq. 24).在DMSO/H₂O溶液中, 配合物S47-Cu²⁺溶液颜色为黄色(λ_max＝415 nm), 同时荧光淬灭. Cys夺取Cu²⁺并释放出自由态S47, 因而传感器荧光恢复(λ_em＝495 nm), 同时溶液颜色再次变为无色, 其对Cys的LOD为2.9 μmol/L, 检测不受其它氨基酸或生物硫醇分子的干扰.

  (24)

  最近, Li等^[75]将钙黄素(S48, λ_em＝520 nm)以及核固红(S49, λ_em＝607 nm)两种传感分子平行固定在无机层状氢氧化物(LDH)表面构筑双荧光信号放大的超薄薄膜, 两种荧光分子分别与Cu²⁺配位形成荧光淬灭的传感体系(S48, S49-Cu²⁺-LDH, 图 3).在Cys竞争结合Cu²⁺之后使传感分子荧光恢复, 以520和607 nm为信号输出通道, 得到Cys的LOD分别为50和23 nmol/L.而且传感体系对Cu²⁺和Cys的响应可以多次循环.

  图 3

  

  图 3.  基于传感体系S48, S49-Cu²⁺-LDH的Cys荧光传感

  Figure 3.  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble S48, S49-Cu²⁺-LDH

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  基于光致异构化二芳基乙烯的传感器S50在开环状态下与Fe³⁺配位形成传感体系S50-Fe^3+[76] (Eq. 25), 在溶液中传感体系无荧光发射, 当Cys竞争结合Fe³⁺并释放出游离态S50后荧光恢复(λ_em＝415 nm), 该体系对Cys的高选择性检测几乎不受其它生物硫醇以及氨基酸的干扰, LOD约为29 nmol/L.遗憾的是, 基于光致异构化的二芳基乙烯传感器并没有实现Cys的光可逆可控检测.

  (25)

  Li等^[77]的研究结果表明, Hg²⁺和传感器S51构筑的传感体系S51-Hg²⁺ (Eq. 26)在纯水相中无明显的荧光发射, 当Cys从传感体系中竞争结合Hg²⁺之后, S51恢复自由状态并在401, 425以及450 nm处出现明显的荧光团蒽的特征发射.检测过程不受其它氨基酸及硫醇分子的影响.

  (26)

  3.   基于纳米材料的Cys传感体系

  由于纳米粒子具有独特的光学和电子性能以及良好的光稳定性和生物兼容性等优点, 对于生物分子而言, 纳米材料往往表现出比单分子传感器更加适合传感的光、电、磁、热等性能.通常, 以荧光量子点为信号报告基团, 金(银)纳米粒子(Au/AgNPs)或氧化石墨烯(GO)为载体(或比色信号基团)和荧光猝灭基团构筑可视化纳米传感体系, 其中S-Au/Ag之间的特异性结合是其检测Cys的直接驱动力, 而量子点荧光淬灭-恢复过程以及Au/AgNPs造成的溶液颜色改变是Cys可视化检测的基本机制.这类传感体系对Cys能够实现高选择性高灵敏度(LOD达到nmol/L级别)的可视化检测.

  2011年, Yang等^{[78, 79]}利用I-Au相互作用使Cu/AuNPs在溶液中聚集成为传感体系Cu/AuNPs-I (Scheme 6), 由此使PBS缓冲溶液(pH 5.2)颜色由紫色(λ_max＝520 nm)变为红色(λ_max＝650 nm).当加入Cys后, 由于S-Au的特异性竞争结合, 使Cu/AuNPs-I转化为Cu/AuNPs-Cys, 纳米粒子几何构型的转变导致溶液颜色从红色到紫色再到蓝色的变化. 0~1.5 μmol/L的浓度范围内, Cu/AuNPs-I对Cys裸眼检测的LOD仅为50 nmol/L, 检测过程无其它氨基酸或生物硫醇分子的干扰.

  Scheme 6

  

  Scheme 6.  基于传感体系Cu/AuNPs-I的Cys荧光传感

  Scheme 6.  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble Cu/AuNPs-I

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  2015年, Zhang等^[80]将氮掺杂碳点(NC-dots)吸附于AuNPs表面, 并通过自组装而聚集成为纳米传感体系NC-dots/AuNPs (Scheme 7).在中性水溶液中, 离散的NC-dots具有激发波长依赖的光致发光以及上转化发光性能, 而AuNPs溶液表现为红色. NC-dots/AuNPs的聚集状态导致NC-dots自身的光致发光以及上转化发光性能消失, 同时溶液颜色变为紫色.当加入Cys后, 由于Cys中巯基与AuNPs表面含氮基团之间的竞争, 促使NC-dots/AuNPs的解离并释放出游离态的NC-dots以及表面结合Cys的AuNPs, 因而溶液颜色从紫色变为红色.但NC-dots与AuNPs之间的荧光能量共振转移使其发光性能并没有恢复. GSH以及Hcy由于较大的分子结构而不能通过NC-dots层渗入到AuNPs表面, 从而不能破坏NC-dots/AuNPs的聚集状态, 所以对Cys的检测不存在干扰.该体系已被成功应用于人体血清中Cys的检测, LOD仅为4 nmol/L.

  Scheme 7

  

  Scheme 7.  基于传感体系NC-dots/AuNPs的Cys荧光传感

  Scheme 7.  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble NC-dots/AuNPs

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  最近, Hu等^[37]构筑了基于氨基氮量子点(aN-dots)以及AuNPs的传感体系aN-dots/AuNPs (Scheme 8).分散的aN-dots具有较高量子产率(34%)、很好的光稳定性以及生物兼容性.当aN-dots与AuNPs之间通过N-Au相互作用并在水溶液中进一步聚集为aN-dots/AuNPs, aN-dots荧光猝灭的同时溶液颜色从红色变为紫色. Cys与AuNPs的竞争结合使传感体系聚集态分散, aN-dots荧光恢复, 溶液颜色变为红色, GSH、Hcy以及其它氨基酸对Cys的检测无干扰, LOD为0.1 μmol/L.该体系被成功应用于人体A549肺癌细胞中Cys的共聚焦荧光成像, 在疾病的临床诊断和早期治疗领域显示出了巨大的潜在应用价值.

  Scheme 8

  

  Scheme 8.  基于传感体系aN-dots/AuNPs的Cys荧光传感

  Scheme 8.  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble aN-dots/AuNPs

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  2011年, Qu等^[81]利用氧化石墨烯(GO)、表面金属化的DNA (Ag-DNA1)以及染料标记的单链DNA2共同构筑了荧光传感体系Ag-DNA1+DNA2-GO (Scheme 9).水溶液中DNA2在525 nm处有较强的荧光发射, DNA1与DNA2之间无法杂化成为双螺旋DNA (dsDNA), 而GO与DNA2之间的π-π堆积, 使溶液荧光完全淬灭. Cys加入后, 由于Ag-S强亲和力的作用使DNA1被释放并与DNA2形成dsDNA, GO与dsDNA之间较弱的相互作用使DNA2荧光恢复.而其它生物硫醇的加入并不能观察到明显的荧光变化, 该体系能够高选择性地检测Cys, LOD为2 nmol/L.

  Scheme 9

  

  Scheme 9.  基于传感体系Ag-DNA1+DNA2-GO的Cys荧光传感

  Scheme 9.  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble Ag-DNA1+DNA2-GO

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  4.   总结与展望

  近年来, 在广大科研工作者的不懈努力和精心设计下, Cys可视化传感器/体系得到了快速发展.本文通过对单分子传感器、基于金属配合物以及纳米材料的传感体系的分类综述, 旨在重点介绍Cys的快速、简单、高选择性高灵敏度的可视化传感方法.对比分析发现, 其中反应型传感器以及基于金属配合物的传感体系在传感过程中往往伴随着新的化学物种的产生, 因而需要考虑传感器及其产物的生物兼容性, 更重要的是, 传感过程无法消除细胞或组织自荧光的干扰, 从而严重限制了反应型传感器/体系在生物成像、临床诊断等方面的应用研究.相反, NIR荧光由于良好的深层组织渗透能力、对生物组织较低的光损害以及微弱的组织自荧光干扰等优势^[82], 使NIR荧光传感器/体系成为Cys检测及应用研究中更加理想的替代者, 大有取代非NIR传感器/体系之势.然而, 由于纳米材料良好的光稳定性、生物兼容性以及独特的光、电、磁等性质, 更适合作为传感载体发展新型的Cys传感体系, 已表现出较高的临床应用价值, 这对相关疾病的早期诊断和治疗具有重要的现实意义.除此之外, 各种水溶性的超分子软材料如凝胶、囊泡以及水溶性高分子材料等将为自然体系或纯水相中Cys的检测带来新的发展机遇.

  新型传感技术以及纳米材料、各种超分子软材料以及水溶性高分子材料的大力发展将会对Cys的传感及应用研究注入新的活力, 通过可控制备以及表面功能化所得到的NIR纳米材料在可视化传感体系中的应用将会大力推动Cys的传感及应用研究的进一步发展.

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  图 1  Cys, Hcy以及GSH的结构式

  Figure 1  Structures of Cys, Hcy and GSH

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  Scheme 1  基于S3, S4的Cys双光子NIR荧光传感

  Scheme 1  Two-photon NIR fluorescent sensing for Cys based on S3, S4

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  Scheme 2  基于S24的Cys荧光传感

  Scheme 2  Fluorescent sensing for Cys based on S24

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  Scheme 3  基于S29的Cys荧光传感

  Scheme 3  Fluorescent sensing for Cys based on S29

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  Scheme 4  基于S30的Cys荧光传感

  Scheme 4  Fluorescent sensing for Cys based on S30

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  图 2  基于传感器S42~S44的Cys手性传感

  Figure 2  Fluorescent chirality sensing for Cys based on S42~S44

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  Scheme 5  基于传感体系S46-Cu²⁺的Cys荧光传感

  Scheme 5  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble S46-Cu²⁺

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  图 3  基于传感体系S48, S49-Cu²⁺-LDH的Cys荧光传感

  Figure 3  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble S48, S49-Cu²⁺-LDH

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  Scheme 6  基于传感体系Cu/AuNPs-I的Cys荧光传感

  Scheme 6  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble Cu/AuNPs-I

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  Scheme 7  基于传感体系NC-dots/AuNPs的Cys荧光传感

  Scheme 7  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble NC-dots/AuNPs

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  Scheme 8  基于传感体系aN-dots/AuNPs的Cys荧光传感

  Scheme 8  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble aN-dots/AuNPs

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  Scheme 9  基于传感体系Ag-DNA1+DNA2-GO的Cys荧光传感

  Scheme 9  Fluorescent sensing for Cys based on sensing ensemble Ag-DNA1+DNA2-GO

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  表 1  以丙烯酸酯为反应位点的传感器分子结构

  Table 1.  Structures of sensors combined with the reaction site of acrylate

  Compd.	Structure
  S10[28]
  S11[46]
  S12[47]
  S13[48]
  S14[49]
  S15[50]
  S16[31]
  S17[51]
  S18[52]
  S19[53]
  S20[54]
  S21[55]
  S22[56]
  S23[57]

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