English

• 羊耳蒜属(Liparis L. C. Rich)为兰科植物, 全球约250种, 我国有45种, 约19种产自台湾, 其余主要分布在西南地区^[1].其中多种植物如羊耳蒜、见血青、小花羊耳蒜、大花羊耳蒜等在历代本草中都有记载, 民间多以全草入药^[2].该属植物主要含生物碱、酚酸、黄酮及苷、萜、甾醇等结构类型的成分^[2].镰翅羊耳蒜(Liparis bootanensis Griff.)广泛分布于江西南部、福建、台湾、广东、海南、广西、四川西南部等地, 附生于海拔800-2300米的林中或山谷岩石上, 具有解热止咳、止血、止痛作用, 主治肺热咳嗽、痰中带血、月经过多、风湿腰腿痛等症^[3～4].目前还未见镰翅羊耳蒜化学成分及生物活性的报道.为更好地开发利用羊耳蒜属植物的药用资源, 我们课题组首次系统开展镰翅羊耳蒜化学成分研究, 通过正、反相硅胶柱层析、制备高效液相色谱等技术从其乙醇提取物的正丁醇部分中分离纯化得到两个单体化合物, 运用HR-ESIMS, 1D和2D NMR等多种光谱手段确定了它们的结构(图 1), 分别为山奈酚3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[6-(4-羟基-3-异戊二烯基苯甲酸酯)-β-D-葡萄糖]-(1→2)-α-L-鼠李糖(1)和山奈酚-3, 7-O-α-L-二鼠李糖(2).化合物1是首次报道的含有4-羟基-3-异戊二烯基苯甲酸酯片段的黄酮苷类化合物.

  

  图1 化合物1和2结构图

  1. Structures of compounds 1 and 2

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  1    结果与讨论

  

  图2 化合物1的关键HMBC与¹H-¹H COSY相关

  2. Key HMBC and ¹H-¹H COSY correlations of compound 1

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  化合物1为黄色粉末, m. p. 213 ℃, 三氯化铁反应呈阳性; [α]_D²⁰-28.8 (c 0.50, CH₃OH); HR-ESIMS显示化合物分子式为C₄₅H₅₂O₂₁ (m/z: 929.3078; calcd for [M+H]⁺ 929.3079), 不饱和度为20.红外光谱显示有羟基(3408 cm^-1)、羰基(1704, 1655 cm^-1)和芳环(1512, 1602 cm^-1)的存在.¹H NMR谱中氢信号[δ_H 6.20 (d, J=1.8 Hz, 1H); 6.42 (d, J=1.8 Hz, 1H); 7.81 (d, J=9.0 Hz, 2H); 6.95 (d, J=9.0 Hz, 2H)], ¹³C NMR谱中的羰基信号[δ_C 179.9 (s)], 推测该化合物是黄酮醇类^[5]. ¹³C NMR数据中的15个碳信号[δ_C159.8 (s), 136.6 (s), 179.9 (s), 162.9 (s), 100.5 (d), 163.0 (s), 95.4 (d), 158.0 (s), 107.7 (s), 122.5 (s), 132.0×2 (d), 116.6×2 (d), 161.7 (s)], 与山奈酚碳谱数据基本一致, 区别在于C-3和C-7的化学位移分别向高场移动了δ 3和5, 推断该化合物中的黄酮苷元为山奈酚, 且3, 7位形成了糖苷^[6].化合物1通过酸水解得到糖部分, 衍生化后, 再通过GC与标准物比对, 结合¹H NMR谱[δ_H 5.41 (d, J=1.8 Hz, 1H), 5.17 (d, J=1.8 Hz, 1H), 4.54 (d, J=7.8 Hz, 1H)], 推测该化合物存在一个β-D-葡萄糖和两个α-L-鼠李糖^[7].进一步分析NMR图谱可知, 化合物中存在一个异戊二烯基段片[δ_C 17.9 (q), 25.9 (q), 123.2 (s), 29.1 (t), 133.6 (s)]和一个3, 4二取代的苯甲酸结构片段[δ_H 6.51 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.68 (dd, J=8.4, 1.8 Hz, 1H), 7.69 (br s, 1H); δ_C 115.2 (d), 121.6 (s), 129.0 (s), 130.2 (d), 132.3 (d), 161.4 (s), 168.3 (s)], 结合2D NMR和文献[8]对比, 确定化合物中存在一个4-羟基-3-异戊二烯基苯甲酸酯结构片段. HMBC图谱(图 2)中鼠李糖Rha Ⅰ的端基氢H-1''[δ_H5.41 (d, J=1.8 Hz, 1H)]与苷元山奈酚的C-3[δ_C 136.6 (s)]相关, 鼠李糖Rha Ⅱ的端基氢H-1'''[δ_H5.17 (d, J=1.8 Hz, 1H)]与苷元的C-7[δ_C 163.0 (s)]相关, 证明鼠李糖Rha Ⅰ和鼠李糖Rha Ⅱ分别与黄酮醇母核的C-3, C-7位相连; 葡萄糖Glc Ⅰ端基氢H-1''''[δ_H 4.54 (d, J=7.8 Hz, 1H)]与鼠李糖Rha Ⅱ中C-2'''[δ_C83.3 (d)]相关, 可知葡萄糖位于鼠李糖Rha Ⅱ的C-2'''位; 此外, 葡萄糖Glc Ⅰ中的H-6''''[δ_H 4.51 (dd, J=8.4, 12.0 Hz, 1H), 4.61 (dd, J=2.4, 12.0 Hz, 1H)]与4-羟基-3-异戊二烯基苯甲酯结构中羰基[δ_C 168.3 (s)]相关.综上所述, 化合物1的结构鉴定为山奈酚3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[6-(4-羟基-3-异戊二烯基苯甲酸酯)-β-D-葡萄糖]-(1→2)-α-L-鼠李糖.

  化合物2核磁数据与文献[9]一致, 故将它鉴定为山奈酚-3, 7-O-α-L-二鼠李糖.

  2    实验部分

  2.1    仪器与试剂

  核磁共振谱仪Brucker AVANCE DRX-600;超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC I-Class)与四级杆飞行时间质谱(Xevo G2-S QTof) (waters公司); NP700C制备液相色谱仪(江苏汉邦科技有限公司), 制备柱为Herera ODS-2 (10 μm, 50 mm×250 mm); 旋光光度仪(Perkin-Elmer Polarimeter 341);红外光谱仪(Thermo Fisher Nicolet 6700);气相色谱仪(Agilent 6890N); 差示扫描量热仪(耐驰DSC 214 Polyma); 层析用硅胶G和H (青岛海洋化工厂).其余试剂为分析纯.

  2.2    实验样品

  镰翅羊耳蒜于2014年8月采自广西百合, 经西南交通大学宋良科副教授鉴定为镰翅羊耳蒜(L. bootanensis), 标本(No. 361520140802Y)保存于西南交通大学生命科学与工程学院.

  2.3    提取与分离

  镰翅羊耳蒜8 kg用3倍体积的95%乙醇冷浸提取3次, 提取液减压浓缩得1.15 kg褐色粘稠状浸膏.取1.1 kg浸膏悬浮于50 ℃的热水中, 依次用石油醚萃取(1 L×3)、乙酸乙酯萃取(1 L×3)、正丁醇萃取(1 L×3), 减压浓缩后得到石油醚浸膏A (200 g)、乙酸乙酯浸膏B (260 g)、正丁醇浸膏C (360 g).正丁醇浸膏C经D-101大孔树脂色谱, 分别用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脱得C₁~C₃三个部分, C₁ (90 g)部分经过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯-甲醇, V:V=50:1→0:1)分为C_1-1~C_1-6六个部分. C_1-1 (3 g)部分经过正相硅胶柱色谱(氯仿-甲醇, V:V=15:1→1:1)得到C_1-1-1~C_1-1-5部分. C_1-1-5部分经过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯-甲醇, V:V=50:0.5→1:1)得到C_1-1-5-1和C_1-1-5-2部分. C_1-1-5-2经过正相硅胶柱色谱(乙酸乙酯-甲醇-水, V:V:V=30:0.5:0.5)和高效液相色谱制备(甲醇-水, V:V=1:4→1:1, 流速10 mL/min, 检测波长240 nm)得到化合物1 (12 mg)和化合物2 (200 mg).

  2.4    酸水解

  将化合物1 (2 mg)溶于1.5 mL的4 mol/L盐酸的二氧六环溶液中, 加热到90 ℃保持4 h.冷却后, 用水(3 mL)稀释, 再用2 mol/L氨水中和, 最后用氯仿(3 mL×3)萃取, 剩余水部分用氮气吹干, 加入三甲基硅烷(0.1 mL)和吡啶(0.2 mL)在60 ℃下搅拌20 min.将得到的溶液用色谱柱为L-CP-Chirasil-Val (0.32 mm×25 m)的GC进行分析, 设置注样器温度和检测器温度为200 ℃, 柱箱温度为60 ℃维持2 min, 然后以15 ℃/min持续升温到250 ℃检测样品.将样品与通过相同条件处理的β-D-葡萄糖(13.04 min)和α-L-鼠李糖(11.10 min)的标准品具有相同的保留时间, 且峰面积比接近1:2.由此, 推断该化合物中含有一个β-D-葡萄糖和两个α-L-鼠李糖^[7].

  2.5    结构测定

  山奈酚-3, 7-O-α-L-二鼠李糖(2):黄色无定型粉末. m.p. 201~205 ℃; ¹H NMR (600 MHz, CD₃OD) δ: 6.45 (d, J=3.0 Hz, 1H, H-6), 6.72 (d, J=3.0 Hz, 1H, H-8), 7.78 (d, J=13.2 Hz, 2H, H-2', 6'), 6.93 (d, J=13.2 Hz, 2H, H-3', 5'), 5.56 (br. s, 1H, Rha Ⅰ-H-1''), 0.93 (q, J=7.6 Hz, 3H, Rha Ⅰ-H-6''), 5.39 (d, J=1.8 Hz, 1H, Rha Ⅱ-H-1'''), 1.26 (q, J=8.0 Hz, 3H, Rha Ⅱ-H-6'''); ¹³C NMR (150 MHz, CD₃OD)δ: 159.8 (s, C-2), 136.5 (s, C-3), 179.8 (s, C-4), 163.0 (s, C-5), 100.5 (d, C-6), 163.5 (s, C-7), 95.6 (d, C-8), 158.1 (s, C-9), 107.5 (s, C-10), 122.4 (s, C-1'), 132.0 (d, C-2', 6'), 116.6 (d, C-3', 5'), 161.8 (s, C-4'), 103.5 (d, Rha Ⅰ-C-1''), 72.1 (d, Rha Ⅰ-C-2''), 71.9 (d, Rha Ⅰ-C-3''), 73.6 (d, Rha Ⅰ-C-4''), 73.1 (d, Rha Ⅰ-C-5''), 17.7 (q, Rha Ⅰ-C-6''), 99.8 (d, Rha Ⅱ-C-1'''), 72.0 (d, Rha Ⅱ-C-2'''), 71.7 (d, Rha Ⅱ-C-3'''), 72.1 (d, Rha Ⅱ-C-4'''), 71.3 (d, Rha Ⅱ-C-5'''), 18.0 (q, Rha Ⅱ-C-6'''); HR-ESI-MS calcd for C₂₇H₃₁O₁₄[M+H]⁺ 579.1714, found 579.1716.以上数据与文献[9]报道一致.

  山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[6-(4-羟基-3-异戊二烯基苯甲酸酯)-β-D-葡萄糖]-(1→2)-α-L-鼠李糖(1):黄色粉末. m.p. 213 ℃; [α]_D²⁰-28.8 (c 0.50, CH₃OH); ¹H NMR (600 MHz, CD₃OD) δ: 6.20 (d, J=1.8 Hz, 1H, H-6), 6.42 (d, J=1.8 Hz, 1H, H-8), 7.81 (d, J=9.0 Hz, 2H, H-2', 6'), 6.95 (d, J=9.0 Hz, 2H, H-3', 5'), 5.41 (d, J=1.8 Hz, 1H, Rha Ⅰ-H-1''), 4.23 (dd, J=1.2, 3.6 Hz, 1H, Rha Ⅰ-H-2''), 3.37 (dd, J=3.0, 9.0 Hz, 1H, Rha Ⅰ-H-3''), 3.33 (m, 1H, Rha Ⅰ-H-4''), 3.39 (m, 1H, Rha Ⅰ-H-5''), 0.96 (d, J=6.0 Hz 1H, Rha Ⅰ-H-6''), 5.17 (d, J=1.8 Hz, 1H, Rha Ⅱ-H-1'''), 4.12 (dd, J=1.2, 3.6 Hz, 1H, Rha Ⅱ-H-2'''), 3.79 (dd, J=3.0, 9.0 Hz, 1H, Rha Ⅱ-H-3'''), 3.82 (dd, J=3.6, 3.0 Hz, 1H, Rha Ⅱ-H-4'''), 3.58 (m, 1H, Rha Ⅱ-H-5'''), 1.21 (d, J=6.0 Hz, 1H, Rha Ⅱ-H-6'''), 4.54 (d, J=7.8 Hz, 1H, Glc Ⅰ-H-1''''), 3.38 (m, 1H, Glc Ⅰ-H-2''''), 3.45 (m, 1H, Glc Ⅰ-H-3''''), 3.32 (m, 1H, Glc Ⅰ-H-4''''), 3.72 (m, 1H, Glc Ⅰ-H-5''''), 4.51 (dd, J=8.4, 12.0 Hz, 1H, Glc Ⅰ-H-6''''), 4.61 (dd, J=2.4, 12.0 Hz, 1H, Glc Ⅰ-H-6''''), 7.69 (br.s, 1H, H-2'''''), 6.51 (d, J=8.4 Hz, 1H, H-5'''''), 7.68 (dd, J=8.4, 1.8 Hz, 1H, H-6'''''), 3.08 (m, 1H, H-1''''''), 5.19 (m, 1H, H-2''''''), 1.71 (s, 1H, H-4''''''), 1.63 (s, 1H, H-5''''''); ¹³C NMR (150 MHz, CD₃OD) δ: 159.8 (s, C-2), 136.6 (s, C-3), 179.9 (s, C-4), 162.9 (s, C-5), 100.5 (d, C-6), 163.0 (s, C-7), 95.4 (d, C-8), 158.0 (s, C-9), 107.7 (s, C-10), 122.5 (s, C-1'), 132.0 (d, C-2', 6'), 116.6 (d, C-3', 5'), 161.7 (s, C-4'), 103.6 (d, Rha Ⅰ-C-1''), 70.8 (d, Rha Ⅰ-C-2''), 72.2 (d, Rha Ⅰ-C-3''), 73.2 (d, Rha Ⅰ-C-4''), 72.1 (d, Rha Ⅰ-C-5''), 17.7 (q, Rha Ⅰ-C-6''), 99.0 (d, Rha Ⅱ-C-1'''), 83.3 (d, Rha Ⅱ-C-2'''), 72.1 (d, Rha Ⅱ-C-3'''), 72.0 (d, Rha Ⅱ-C-4'''), 70.9 (d, Rha Ⅱ-C-5'''), 18.1 (q, Rha Ⅱ-C-6'''), 106.1 (d, Glc Ⅰ-C-1''''), 75.2 (d, Glc Ⅰ-C-2''''), 77.7 (d, Glc Ⅰ-C-3''''), 72.5 (d, Glc Ⅰ-C-4''''), 75.7 (d, Glc Ⅰ-C-5''''), 64.9 (t, Glc Ⅰ-C-6''''), 121.6 (d, C-1'''''), 132.3 (d, C-2'''''), 129.0 (d, C-3'''''), 161.4 (d, C-4'''''), 115.2 (d, C-5'''''), 130.2 (d, C-6'''''), 168.3 (s, C-7'''''), 29.1 (t, C-1''''''), 123.2 (d, C-2''''''), 133.6 (d, C-3''''''), 25.9 (q, C-4''''''), 17.9 (q, C-5''''''); IR (KBr) v_max: 408, 2954, 2924, 2854, 1704, 1655, 1602, 1512, 1494, 1452, 1373, 1278, 1206, 1174, 1112, 1089, 1061, 1025, 973 cm^-1; HR-ESI-MS calcd for C₄₅H₅₃O₂₁[M+H]⁺929.3079, found 929.3078.

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  图 1  化合物1和2结构图

  Figure 1  Structures of compounds 1 and 2

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  图 2  化合物1的关键HMBC与¹H-¹H COSY相关

  Figure 2  Key HMBC and ¹H-¹H COSY correlations of compound 1

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