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  最近几年,一些检测HClO的荧光探针被报道,通常按照荧光基团的不同分为: BODIPY、罗丹明、荧光素、花菁、对甲氧基苯酚、香豆素和金属配合物等荧光探针. 本文综述了近几年HClO荧光探针的研究进展,这些探针大都具有荧光量子产率高、摩尔消光系数大、选择性好、灵敏度高、低毒性和突出的光化学稳定性等优点.

  一般来说,荧光探针由两部分组成: 一部分是荧光信号基团,另一部分是识别基团. 当探针识别目标,化学反应可以被转换成一个光谱信号,为提高检测的灵敏度,特别要求有效的转换. 按照这个要求,分子内电荷转移(ICT)、光致电子转移(PET)和荧光共振能量转移(FRET)等不同的物理机制,被用来设计各种具有优越特性的荧光探针. 然而,这些物理机制取决于分子轨道的能级,通常难以准确确定,导致很难预测探针的性能. 相反,通过化学反应直接改变光谱探针的共轭体系,往往伴随着明显的光谱信号改变,这可以作为开发优秀的光谱探针的有效措施^[27～31]. 荧光探针包括荧光淬灭型探针和荧光增强型探针,相对于荧光淬灭型探针,增强型探针有诸多优点,比如干扰相对较少,检测限相对较小等^[32～37]. 迄今,已有较多综述文章概述了检测金属离子、生物硫醇、硫化氢、阴离子、pH等被识别物的荧光探针研究进展^[38～42]. 鉴于近几年次氯酸荧光探针研究快速发展,本文着眼于次氯酸荧光探针的进展,期望对该领域读者有所借鉴.

  设计次氯酸荧光探针的一个共同的策略是将与次氯酸反应的部分连接到一个有机荧光团上,从而作为一个调节器控制荧光团的荧光强度. 一些官能团,如烷氧基苯胺、甲氧基苯酚、肟、硒化物和硫醇在次氯酸探针设计中常被用作反应部分. 此外,荧光生物成像技术可以映射活性氧和活性氮在活细胞中的时空分布,大多数荧光探针是非生物超分子结构,一般通过非共价键作用与分析物结合,如氢键、静电吸引力和配位现象^[43～45].

  活性氧(ROS)包括超氧自由基、羟基自由基、过氧化氢、单线态氧(¹O₂)和次氯酸/次氯酸盐等,在生命系统中起着关键作用^[1～4]. 次氯酸(HClO)是一种弱酸性的活性氧,在生理条件下部分解离成次氯酸盐阴离子. 在一定浓度范围内,由于其强氧化性,HClO作为一种有效的抗菌剂和漂白剂广泛用于日常生活中; 另外,HClO也是正常的细胞代谢的副产品之一,对生物体有着重要影 响^[5～8],在白细胞包括巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞中,氯离子和过氧化氢在髓过氧化物酶(MPO)的催化下反应产生内源性次氯酸. 尽管HClO有助于生物体内对细菌的破坏,但过量的HClO会引起氧化应激,导致许多疾病如炎症性疾病、动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症和肾脏疾病等^[9～14]. 鉴于HClO在生物学上的重要性,监测生命系统中次氯酸浓度的变化,研究活细胞中次氯酸的动态分布,成为当今细胞生物学和医疗诊断等领域的一项重要课题.

  可用于选择性检测次氯酸/次氯酸盐的方法有很多,如碘量滴定法、比色法、化学发光法、库仑法、极谱法和辐解法等^[15～17]. 然而,这些方法往往比较繁琐,同时,一些工作必须在有机介质或有机/水介质中进行,限制其应用. 与上述方法相比,荧光探针被认为是生物研究理想的手段,因为荧光检测所需的仪器相对简单,选择性和灵敏度高,检测范围广,响应时间快速,而且检测过程对样品没有破坏,对细胞危害也很小,荧光检测结合显微镜可以提供实时结果^[18～26].

  2    在不同荧光团基础上设计HClO荧光探针

  2.1    基于BODIPY的HClO荧光探针

  BODIPY类化合物是合成HClO荧光探针最常用的荧光染料之一,具有突出的优点,如较窄的吸收和发射峰、高摩尔吸光系数、光和化学稳定性好、高荧光量子产率等,因而越来越引起科研人员的兴趣^[46]. 通过改变共轭链和取代基,对其中心骨架结构加以修饰,实现在紫外可见光区以及红外或近红外光区改变其吸收和发射波长,得到各种不同的染料,进而合成相应的HClO荧光探针.

  Gai等^[47]合成的BODIPY衍生物2,中间位置加了一个羟甲基,被HClO氧化形成吸电子取代基甲酰基,导致S₁状态的非辐射显著衰减,因此荧光发射强度大幅降低,可以作为在水介质中检测次氯酸盐的荧光探针. 在HClO氧化后发生荧光淬灭可以归因于中间位置的甲酰基和荧光团的最低未占轨道之间的相互作用,提高ICT的S₁状态可能形成与基态的锥型交叉,从而导致非辐射大幅衰减. 探针2通过共聚焦荧光显微镜对活细胞中的次氯酸成像,在细胞生物学上显示了其潜在的适用性.

  Liu等^[46]合成的BODIPY荧光探针1,利用HClO促进甲基苯基硫醚的氧化,生成硫氧双键,从而抑制了甲基苯基硫醚到BODIPY上的光诱导电子转移(PET),伴随着荧光量子产率160倍的增加量(从0.003～0.480),并且不受其他离子的干扰,因此能够对次氯酸进行高灵敏度和选择性检测,检测限为23.7 nmol/L. 荧光强度的变化与1～10 μmol/L范围内HClO的浓度成正比. RAW264.7细胞的共聚焦荧光显微镜成像表明探针1可以应用于生物体HClO的监测.

  Park等^[49]设计了由BODIPY和2-二氰亚甲基-3-氰基-2,5-二氢呋喃(DCDHF)通过共轭组成的比色和比率荧光探针4,烯烃链在HClO的作用下氧化裂解,使荧光强度和颜色都发生变化,从而对HClO/ClO^-进行高灵敏度和选择性的检测,检测限为5×10^-7mol/L. 烯烃链的氧化裂解引起探针吸收和发射光谱的蓝移,DCDHF的引入导致了吸收和发射光谱的红移. 另外烯烃链的氧化裂解会诱发BODIPY和DCDHF的快速分离,在HClO存在时提供荧光信号显示光谱变化. 探针4能够在 RAW264.7巨噬细胞中比率成像,并且采用双发射成像模式.

  氟化硼络合二吡咯甲川类(boron-dipyrromethene,简称BODIPY)化合物基本结构是中间一个硼氮六元杂环、左右两个吡咯环,三个环呈非常好的共轭平面结构,与硼原子相连的两个氟原子位于BODIPY核心平面的两侧.

  Hu等^[51]研发了HKOCl-2系列基于BODIPY结构的荧光探针7～9,检测次氯酸,比探针6 (HKOCl-1系列)灵敏度更高,选择性更好,在活细胞中更加有效成像 (Eq. 1),特别是HKOCl-2b尤为突出,能快速、选择性地检测巨噬细胞中的内源性HClO. HKOCl-2a,HKOCl-2b和HKOCl-2c的检测限分别为42,18和37 nmol/L. HKOCl-2的结构比HKOCl-1在1、7位置多了两个甲基,是为了在4-甲氧基酚附近增加空间位阻,造成醌结构部分的转动自由度受到进一步限制,使HKOCl-2的量子产率比HKOCl-1更高. HKOCl-2b和HKOCl-2c在羟基邻位用卤素取代是为了阻止醌类产物C和D的氧化. 在0.1 mol/L和pH=7.4的磷酸钾缓冲溶液中,无HClO时,探针没有荧光,有HClO时,就会观察到荧光强度迅速增加,在15 min内达到一个稳定值.

  Emrullahoğlu等^[50]合成了基于醛肟识别基团的荧光探针5,用于检测次氯酸. 探针5遇到HClO会氧化脱氢,引起明显的荧光增强伴随着从红色到橙色的改变,检测限低至0.5 μmol/L,在生理条件下能有效操作,能够在活细胞中对HClO进行成像,这对生物成像研究至关重要. 探针5的荧光响应适用于4.0～9.0的pH值范围,pH＞9.0时,荧光响应急剧下降. 值得注意的是,在生理pH (pH=7.2)荧光增强显著,说明该探针适合生物应用.

  尽管已经报道了一定数量基于BODIPY的HClO荧光探针,但利用硒的氧化还原机理设计的HClO荧光探针以往尚未研究. Liu等^[52]成功开发了基于BODIPY的荧光探针10 (HCSe,Eq. 2),可以快速、高选择性地检测HClO,通过HClO氧化HCSe中二苯硒化物的程度反映HClO的含量. 使用共聚焦荧光显微镜对RAW264.7细胞成像表明,探针10可以有效地检测活细胞中的HClO. 由于从Se到BODIPY部分的光致电子转移(PET)的作用,HCSe本身显示无荧光,遇到HClO后Se被氧化,阻断了PET过程,BODIPY荧光恢复. HCSeO的量子产率是HCSe的138倍. 值得注意的是,一部分HCSeO可以与谷胱甘肽GSH作用还原为HCSe. 探针10展示了在水溶液中对HClO检测的高选择性和高灵敏度,检测限为7.98 nmol/L,优于其他ROS和RNS物质的检测.

  Zhu等^[48]报道了一种基于BODIPY的HClO荧光探针3 (Scheme 1). 该探针是通过丙烯酰氯和2,4-二甲基吡咯的迈克尔加成反应合成,吡咯部分作为识别基团,在吡咯环上有一个增强的PET作用到BODIPY荧光团上. 探针3具有超灵敏度、快速响应(1 s)、高选择性等优点,检测限低至0.56 nmol/L. 探针3首次被应用到癌细胞基底HClO成像,能够监测MCF-7细胞中由于抗癌药物伊利司莫逐渐产生的HClO,可以帮助我们研究肿瘤生物学以及伊利司莫的作用机理.

  Venkatesan等^[53]开发出一种基于BODIPY结构的荧光探针11 (HCTe,Eq. 3),利用二苯基碲化物被HClO氧化的程度反映HClO的含量. 探针被氧化的过程伴随着发射光谱的增强,其快速、高选择性和灵敏度都超过了其他活性物质,荧光量子产率增加了82倍. 荧光响应机制是通过对二苯基碲化物到BODIPY的光致电子转移的抑制作用实现的. HCTe与HClO反应后荧光强度的变化和1～10 μmol/L范围内HClO的浓度呈线性关系,检测限低至41.3 nmol/L.

  

  图图式1 BODIPY的HClO荧光探针3

  Figure 图式1. HClO fluorescent probe 3 of BODIPY

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  2.2    基于罗丹明的HClO荧光探针

  

  图2 用探针孵化细胞的荧光成像[(a)蓝色通道、(b)红色通道]、加LPS细胞的荧光成像[(c)蓝色通道、(d)红色通道]和(e)荧光强度的比值

  Figure 2. Fluorescence images of cells incubated with a 10 μmol/L probe from (a) blue channel and (b) red channel; Fluorescence images of cells pretreated with lipopolysaccharide (LPS),then incubated with 10 μmol/L probe for 4 h from (c) blue channel and (d) red channel; (e) The ratio of fluorescence intensity

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  Yuan等^[59]设计开发了一种基于罗丹明B的硫代氨基脲化合物17,作为荧光探针检测ClO^-. 该探针和NaClO反应会发生脱硫环化,转变为罗丹明的噁二唑化合物(Eq. 4). NaClO浓度在1.0×10^-7～1.0×10^-4mol/L范围内与荧光强度成线性关系,检测限为5.2×10^-8mol/L. 选择性好、灵敏度高、快速响应、低毒性和膜通透性等优点使之成为生物和环境领域值得期待的检测ClO^-的工具之一.

  Zhan等^[56]开发了基于罗丹明B的硫代螺内酯荧光探针13,对人体中性粒细胞产生的HClO荧光成像,可以高灵敏度、高选择性地检测次氯酸. 探针与HClO反应后,螺环打开,从无色变为粉红色,561 nm吸收和579nm荧光发射峰逐渐增强. 荧光强度和0.5～7.0 μmol/L范围内的HClO浓度成线性关系,检测限低至0.3 μmol/L. 根据探针13遇到ClO^-后产生的荧光和颜色的变化,发现“关-开”切换位置在硫原子和螺碳原子之间.

  Hu等^[58]报道了一种含硫的罗丹明6G类的荧光探针16,在水介质中展示了对HClO高度的选择性和灵敏度,通过HClO的诱导使硫代内酰胺开环,在水的作用下脱硫生成酰胺,荧光强度显著增强,与1～100 μmol/L范围内次氯酸的浓度呈线性正比关系,检测限为0.1 μmol/L. 探针16同样应用到检测HClO在活细胞中(以大肠杆菌为例)的荧光成像,证明了其在生物系统中的应用价值.

  Zuo等^[60]同样设计合成了一种基于罗丹明6G的硫代氨基脲荧光探针18,检测活细胞中的HClO,探针本身无荧光,遇到HClO则会有明显的荧光增强现象,检测限1.5×10^-8mol/L,可见更有优势.

  Zhou等^[62]基于罗丹明B硫代内酯研发了一种新的HClO荧光探针20,探针表现出精确的线粒体靶向能力、快速响应、极好的选择性和灵敏度等诸多优势,检测限低至9 nmol/L,能够在痕迹量级监测HClO的存在,并且研究线粒体中HClO在各种细菌感染事件中起到的细胞功能.

  Koide等^[57]基于含硅罗丹明结构设计合成了一种新型远红外至近红外的荧光探针14 (MMSiR),能够实时检测HClO,具有高灵敏度和选择性,检测限为5 μmol/ L. 结构中Si取代了O,使其在性能方面比探针15 (Hy- SOx)更优越. MMSiR与HClO反应,形成氧化产物SM- SiR (Abs_max/E_mmax=652/670 nm,ε=1.2×10⁵ L•mol^-1•cm^-1,Φ_fl=0.31,PBS),量子产率46%,荧光强度迅速增强,其变化与HClO浓度成线性关系. 相比之下,其他活性氧几乎没有荧光增加.

  Tang等^[65]以罗丹明B和苯并噻唑肼设计合成了一种荧光探针(Eq. 6). 探针本身无荧光,遇到HClO则会有明显的红色荧光增强现象,其检测限低至1.06 nmol/L,并成功应用于检测细胞内源性次氯酸(图 2).

  

  图图式2 罗丹明B的双功能荧光探针21

  Figure 图式2. Fluorescence probe 21 of rhodamine B

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  Zhang等^[61]开发了基于罗丹明6G酰肼的荧光探针19,用来检测水介质和活细胞中HClO的含量. 由于酰肼结构,探针对HClO表现出很高的选择性,超过了一系列与生物学相关的活性氧和活性氮以及中性缓冲液中的大部分金属离子. 由于细胞膜通透性和低毒性,探针能够通过荧光成像和流动血细胞计数法反映活细胞中HClO含量的变化,检测限低至3.3 nmol/L.

  Zhang等^[55]设计合成了罗丹明6G酰肼化合物12,用作荧光探针对HClO进行检测. 罗丹明酰肼被HClO氧化后,可以将无荧光的内酰胺结构转变为有荧光的开环结构. 探针12显示了在水介质中检测HClO灵敏度高(检测限0.06 μmo/L)、选择性和光稳定性都很好的特点. 此外,该探针具有细胞膜的渗透性,应用于活细胞中外源性和内源性HClO的生物成像,细胞增殖测定表明此探针对细胞的毒性很低.

  罗丹明类化合物是以氧杂蒽为母体具有螺环结构的碱性染料,因其特殊的结构和优异的荧光特性,在环境化学和生物分析领域中常被用于合成“关-开”型荧光探针. 罗丹明类荧光染料具有波长范围宽、荧光量子产率高、不受pH影响以及光稳定性好等突出特点. 罗丹明的基本骨架主要由带有3,6位取代氨基的氧杂蒽母体和9位碳原子所连接的芳环两个片段组成. 其中带氨基的氧杂蒽母体是最重要的一个结构片段,罗丹明的荧光特性与它的结构有着密切的关系. 芳环上引入卤素、烷基、芳基、磺酸基等不同的反应性基团,可以改变此类荧光物质的最大发射和吸收波长,从而改善它们的应用性能; 如果对氨基进行修饰,就会影响荧光效应或者增色等,比如不对称修饰和添加水溶性基团使结构刚 化^[54]. 罗丹明类荧光探针具有内酰胺结构,是非荧光、无色的,一旦和被分析物作用就会引起开环,产生强烈的荧光发射,并且伴随着颜色的变化.

  

  图1 用探针孵化RAW264.7细胞的荧光成像[(a)蓝色通道、(b)红色通道]、加LPS的RAW264.7细胞的荧光成像[(c)蓝色通道、(d)红色通道]、(e)荧光强度的比值和(f)经过探针孵育后细胞的生存能力

  Figure 1. Fluorescence images of RAW264.7 cells incubated with a 10 μmol/L probe for 4 h from (a) blue channel and (b) red channel; Fluorescence images of RAW264.7 cells pretreated with lipopolysaccharide (LPS) for 12 h,then incubated with 10 μmol/L probe for 4 h from (c) blue channel and (d) red channel; (e) The ratio (red to blue) of fluorescence intensity; (f) Viability of RAW264.7 cells after treatment with the probe for 4 h at a concentration of 10 μmol/L

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  Zhang等^[64]设计合成了一种基于罗丹明B的硫代双酰肼化合物Naph-Rh (Eq. 5),作为荧光探针检测ClO^-.该探针是基于TBET机理检测ClO^-,罗丹明B与ClO^-反应后,其螺环结构变为开环结构,在激发波长为350 nm时,作为TBET的能量接受者接受能量,发出红色荧光,能够检测细胞内源性次氯酸(图 1).

  Liu等^[63]设计合成了一种基于罗丹明B的双功能荧光探针21,可以在不同溶剂体系中分别选择性检测 Cu²⁺和ClO^- (Scheme 2). 该探针的结构包含两部分,一部分是具有荧光特性的罗丹明B,另一部分是既可以和Cu²⁺螯合的吡啶酰胺,也可以和ClO^-反应的双酰肼. 和以前报道的Cu²⁺或ClO^-荧光探针相比,这是第一个基于小分子能够在1 nmol/L水平上检测Cu²⁺和ClO^-的荧光探针.

  2.3    基于荧光素的HClO荧光探针

  Jin等^[70]设计合成了两个新颖的基于荧光素结构的荧光探针24和25 (Scheme 3). 这两个荧光探针利用 ClO^-的不可逆氧化反应引发荧光的变化,对ClO^-有高度选择性,并表现出实时响应. 无ClO^-时,因为螺环关闭,探针没有明显的荧光发射,随着ClO^-浓度的增加,由于ClO^-的选择性氧化,促使螺环打开,荧光强度显著增加. 探针25被氧化成25a呈现出586.8倍荧光增强,荧光强度和1～10 μmol/L范围的ClO^-浓度成线性关系,检测限为20 nmol/L (Scheme 4). 探针24、25成功应用到自来水中ClO^-的检测和红细菌属SW2细胞中ClO^-荧光成像,表明此类探针在饮用水病原菌质量分析和研究饮用水系统ClO^-的消毒机理方面有着很大的潜力.

  Best等^[69]报道了一个基于含硅荧光素衍生物的荧光探针23 (Hypo-SiF),用于检测次氯酸,检测限为9.5 μmol/L. 探针通过“关-开”模式控制,硫醚螺环化合物无荧光,当HClO存在时会开环形成荧光物质. 探针23与一定化学计量的HClO反应,得到两个受pH影响的荧光物质,SiF二硫醚和SiF磺酸. HClO过量时,SiF荧光团经由氯醇中间体结构变成氯化物,导致荧光光谱的红移. SiF荧光团经HClO氯化产生荧光,这一过程也被用来监测pH值较低时MPO的活性.

  Yin等^[71]设计合成了一个新的基于荧光素并且含有儿茶酚结构的荧光探针26 (Eq. 7). 具有螺环结构的探针本身不显荧光,和ClO^-反应后发生开环显示强烈的黄绿色荧光,大多数金属离子和阴离子不会干扰ClO^-的检测,检测限可以达到40 nmol/L. 探针26与NaClO反应的量子产率Φ=0.87,是反应之前(Φ=0.0007)的1240倍. RAW264.7细胞的共聚焦荧光显微镜成像表明,该探针可以有效检测活细胞中的HClO.

  荧光素又称荧光黄,属于呫吨类染料. 荧光素及其衍生物具有光致荧光特性,作为荧光示踪物被广泛应用于荧光探针的设计合成中^{[66, 67]}. 分子具有刚性共平面结构,因为氧桥键把两个苯环固定在一个平面上. pH的变化会影响到它的结构及荧光性质,在酸性条件下,分子内形成螺环结构,无荧光; 在碱性条件下,螺环打开,产生荧光.

  

  图图式4 荧光探针25与NaClO的作用

  Figure 图式4. Reaction of fluorescent probe 25 and NaClO

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  Huo等^[68]设计合成了2-吡啶甲醛荧光素腙(FHP),再与Cu⁺形成配合物FHP-Cu⁺ 22,可以作为荧光探针定性定量地检测次氯酸盐. ClO^-把Cu⁺氧化成Cu²⁺从而形成Cu²⁺配合物来发挥探针作用. 在紫外可见光谱中主要波段集中在502 nm,ClO^-的检测限在10^-5～10^-6mol/L,在此浓度时颜色变化明显. 在325 nm激发,荧光光谱集中在450～650 nm,荧光显著增强,ClO^-的检测限在10^-7～10^-5mol/L. 其他常见的阴离子不会干扰次氯酸盐的检测,如F^-,Cl^-,ClO₃^-,NO₂^-,CN^-,S^2-,SCN^-,P₂O₇^4-,Ac O^-,CO₃^2-,SO₄^2-,ClO₄^-等. 探针22与次氯酸盐反应所产生的颜色变化快速,可以应用于自来水中次氯酸盐的检测.

  

  图图式3 基于荧光素的HClO荧光探针24和25

  Figure 图式3. HClO fluorescent probes 24 and 25 based on fluorescein

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  2.4    基于花菁染料的HClO荧光探针

  Cheng等^[74]成功合成了基于连硒七甲川花菁染料的近红外(NIR)荧光探针29 (SeCy7) (Eq. 8). 通过在七甲川花菁染料中引入S和Se,得到了两种HClO荧光探针28 (SCy7)和29. SeCy7在水溶液中高度集聚,表现很弱荧光,与HClO反应后,SeCy7转换成SeOCy7,二价Se变成四价Se,集聚态逐渐消失,荧光发射光谱在786 nm处增强并逐渐到达了一个平稳值,荧光增强19.4倍. SeCy7与SCy7相比表现出更大的集聚度,从而对HClO检测更灵敏,检测限达到了0.31 μmol/L. 另外通过荧光成像技术成功将探针29应用于检测小牛血清和活鼠中的HClO.

  

  图图式5 基于花菁的HClO荧光探针27

  Figure 图式5. HClO fluorescent probe 27 based on cyanine

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  花菁染料由于其独特的性能,已成为高新技术领域中非常重要的一类有机功能分子,尤其作为荧光探针的应用. 1856年,WUliamsf发现了花菁染料,1873年,Vogel发现该类染料具有异常灵敏的感光能力,从此花菁染料得到迅速发展^[72]. 它们的吸收和发射波长通常在近红外区,在此波长范围内光对细胞损伤最小,并且可以避免组织吸收和细胞自发荧光的影响,提高光在组织中的渗透深度和检测灵敏度. 另外,菁类染料还具有摩尔吸收系数大、荧光量子产率高、光谱范围广和水溶性好等优点. 略显不足的是菁类染料容易光漂白. 一般的花菁染料包含两个N中心,其中一个显示正电荷,通过一条含有奇数碳原子的共轭链与另一个N原子相连,这一显著特征被表述为“推-拉”烯烃,构成了基本的发色基团-聚亚甲基菁. 以聚亚甲基单元所带的电荷为基础,菁染料可以分为: 菁染料(又称花菁或多次甲基染料)、半菁染料(又称苯乙烯菁染料)、份菁染料、苯乙烯型染料等.

  Lou等^[73]研发了一系列基于七甲川菁染料的比率探针27 (Scheme 5) (Cy7-NR). Cy7-NR的吸收光谱主要集中在近红外波长范围,在添加NaClO之后,长波段的吸收减少,540 nm处出现了新的吸收峰,质谱测试表明Cy7-NR上双键被氧化后产生环氧化合物. 从紫外-可见滴定实验中也可以看出,随着NaClO浓度的增加,682 nm处的吸收减少,同时从蓝色变为粉红色. 另外,荧光强度与NaClO的浓度成线性关系,回归方程是I₅₆₆/ I₇₈₀=0.2938×[NaClO]-0.4565. 该探针不仅具有高灵敏度(检测限为1.95×10^-8 mol/L)和对次氯酸的高选择性,而且能够在活细胞HeLa和Raw 264.7中对次氯酸比率荧光成像.

  Sun等^[75]设计合成了一种双功能的近红外荧光探针30 (Eq. 9),用来检测中性粒细胞中由髓过氧化物酶MPO产生的HClO,通过HClO在细胞中的NIR荧光成像,同时测定吸光度的变化可以评估酶活性的大小. 该探针被HClO氧化引起荧光淬灭,荧光强度发生明显变化. 无论比色法还是荧光法在检测HClO过程中探针30都显示出高选择性和灵敏度,检测限分别达到0.13和0.70 μmol/L. 在活细胞荧光成像方面该探针也表现出很好的膜通透性和低毒性.

  2.5    基于对甲氧基苯酚的HClO荧光探针

  Zhang等^[77]利用类似方法在聚芴结构单元上引入对甲氧基苯酚基团,设计合成了一系列水溶性的共轭聚合物N-PFP_x (x=10,25,50),分别是探针32、33、34,它们能被HClO氧化成对苯醌结构,引起分子内电荷转移,使荧光强度发生改变,并产生超淬灭效应,因而能作为荧光探针灵敏、选择性地检测次氯酸. 当x=10,25时,聚合物的最大吸收峰和发射峰分别在390和430 nm,x=50时,两峰发生变化,分别是353和415 nm. N-PFP10,N-PFP25,N-PFP50和FMOPF(探针35)的检测限分别是0.06,0.09,0.1和0.3 μmol/L,可见,x=10,25时的探针具有较大的优越性.

  对甲氧基苯酚能够选择性地被HClO氧化成对苯醌. 基于这一点,Zhang等^[76]设计合成了一个简单的对甲氧基苯酚的衍生物PMOPP,即探针31. 基于水溶性的目的,两端的苯基部分形成了季铵盐的结构. 对甲氧基苯酚被氧化能够引起从末端苯基到中间苯醌部分的分子内电荷转移(ICT),也能造成色度和荧光的变化(双信号). 加入HClO后,原来314 nm的吸收峰降低,出现一个新的波段393 nm,色度也从无色变为黄色. 探针对HClO有较强的选择性和灵敏度,检测限低至0.8 μmol/L.

  时隔半年,Zhang等^[78]又通过在聚对亚苯基结构单元引入对甲氧基苯酚基团设计合成了一系列水溶性的共轭聚合物N-PPP_x (x=10,25,50),分别是探针36、37、38 (Eq. 10). 甲氧基苯酚被HClO氧化导致聚合物荧光光谱的变化,N-PPP_x在350 nm的吸收峰会明显降低,发生荧光淬灭. N-PPP10,N-PPP25,N-PPP50和PMOPP (探针31)的检测限分别是0.02,0.03,0.2和0.8 μmol/L,可见,在灵敏度方面,N-PPP10和N-PPP25作为检测次氯酸的荧光探针是最有希望的.

  2.6    基于香豆素的HClO荧光探针

  香豆素属于邻羟基桂皮酸内酯,其母核结构是苯 并-α-吡喃酮,母核自身没有荧光,但我们把香豆素环用相关取代基修饰之后,可以让香豆素的最大吸收和发射波长产生红移,由此得到不同颜色和荧光特性很强的物质,香豆素类衍生物具有光物理和化学性质可调、荧光量子产率高、Stokes位移大(70～100 nm)和光稳定性好等优点^[79],因此被广泛用于荧光探针的设计合成.

  Yu等^[80]研发了一种基于香豆素的荧光探针39 (HS1) (Scheme 6). 探针结构中存在肟的部分,正是肟被HClO氧化导致探针的荧光强度增加7倍,荧光强度和HClO浓度(1～20 μmol/L)之间存在很好的线性关系,检测限低至25 nmol/L. 通过RAW264.7巨噬细胞的共聚焦荧光显微成像证明了HS1探针有很好的细胞膜通透能力,能高效地检测活细胞中的HClO.

  Zhang等^[82]设计研发了两种比率荧光探针检测HClO/ClO^-,探针42在碱性条件下表现出对ClO^-的快速响应,与ClO^-反应产生香豆素-罗丹明酸即探针43 (Eq. 12),导致荧光变化. 所以,基于罗丹明-香豆素联合体氯化诱导的环化作用和FRET荧光转换机制,我们提出了一种新的检测HClO的策略. 探针43具有较高的灵敏度、选择性、实时检测能力和生理条件下好的膜渗透性,最后这一点在RAW264.7活细胞的HClO荧光成像中得到了印证. Hou等^[83]同样利用香豆素与罗丹明的结合设计了RMClO-1和RMClO-2两种比率荧光探针44、45,其中RMClO-2是检测ClO^-的首例线粒体靶向比率荧光探针.

  Yuan等^[85]设计研发了一种新型的比例性检测HClO的荧光探针,是根据2,4-二硝基苯腙衍生物能够被HClO氧化为醛设计合成的(Eq. 14). 随着HClO的加入,2,4-二硝基苯腙逐渐转变为醛,发射波长随之蓝移.

  

  图3 用探针孵化细胞的荧光成像[(a)蓝色通道、(b)红色通道]、加LPS细胞的荧光成像[(c)蓝色通道、(d)红色通道]、(e)荧光强度的比值

  Figure 3. Fluorescence images of cells incubated with a 10 μmol/L probe from (a) blue channel and (b) red channel; Fluorescence images of cells pretreated with lipopolysaccharide (LPS),then incubated with 10 μmol/L probe for 4 h from (c) blue channel and (d) red channel; (e) The ratio of fluorescence intensity

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  图图式6 基于香豆素的HClO荧光探针39

  Figure 图式6. HClO fluorescent probe 39 based on coumarin

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  Li等^[81]报道了基于Grieco消除反应检测HClO的荧光探针40和41 (Eq. 11). 当ClO^-存在时,随着芳硒基团的离去,探针从无荧光转变为有强烈浅蓝色荧光的物质. 这类探针具有快速响应、高选择性和灵敏性(检测限是10 nmol/L)、不受pH影响等优点,可以检测水溶液和活细胞中的ClO^-,在中性粒细胞和巨噬细胞中的荧光成像试验均已获得成功.

  Zhang等^[84]设计合成了一种新的比例型的检测HClO的荧光探针CRSH (Eq. 13),当在探针溶液中加入HClO,罗丹明硫代酰肼开环,在350 nm激发下,香豆素发出的荧光经过FRET传递到开环的罗丹明,进而发出红色荧光,并成功用于比率检测细胞内源性次氯酸(图 3).

  2.7    基于金属配合物的HClO荧光探针

  Ye等^[90]也成功研制了一种功能性钌(Ⅱ)配合物[Ru(bpy)₂(AN-bpy)](PF₆)₂ (48),作为荧光探针检测HClO (Scheme 8). 由于PET作用,此配合物几乎没有荧光,与HClO反应后得到它的衍生物[Ru(bpy)₂(HM- bpy)](PF₆)₂,荧光强度提高了110倍. 该探针具有高选择性和灵敏度、优秀的光物理特性,成功应用到HeLa活细胞中外源性HClO的荧光成像和猪的中性粒细胞中内源性HClO的检测,检测限为33 nmol/L.

  Xiao等^[91]利用邻硝基苯胺与次氯酸的特异性反应,设计合成了两种新型的对次氯酸具有高度特异性响应的基于镧系元素铕、铽配合物的时间分辨荧光探针49 (Scheme 9),首次将3-氨基-4-硝基苯基通过酚醚键与联三吡啶基团相连. 由于存在3-氨基-4-硝基苯基到联三吡啶的分子内PET作用,探针分子自身仅发射出极微弱的本底荧光,但是当探针与2 equiv.的次氯酸分子作用之后,酚醚键被切断,生成了相应的HTTA配合物,PET作用消失,进而发出很强的时间分辨荧光. ANMTTA-Eu³⁺和ANMTTA-Tb³⁺的检测限分别达到了1.3和0.64 nmol/L. 通过对探针的羧酸结构进行酯化,成功地将探针49用于活细胞的标记,毒性很小,分别实现了HeLa细胞中外源性次氯酸的荧光成像,嗜中性粒细胞和单核巨噬细胞中内源性次氯酸的荧光成像,为考察生物样品中次氯酸的生理和病理作用提供了一种有价值的分析手段.

  

  图图式9 镧系元素的时间分辨HClO荧光探针49

  Figure 图式9. HClO time resolved fluorescent probe 49 based on lanthanide complex

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  Zhang等^[89]设计合成了一种新的钌配合物[Ru(bpy)₂(DNPS-bpy)](PF₆)₂ (bpy: 2,2′-联吡啶,DNPS- bpy: 4-(2,4-二硝基苯基硫代)-亚甲基-4′-甲基-2,2′-联吡啶)(47),可作为一种高灵敏度和高选择性的荧光探针检测活细胞中的HClO (Eq. 15). 此配合物有较大的Stokes位移(170 nm)、长的发射波长(626 nm)和低的细胞毒性. 由于从Ru(Ⅱ)中心到2,4-二硝基苯基(DNP)存在有效的光致电子转移(PET),联吡啶-Ru(Ⅱ)配合物的红色荧光发射被彻底抑制. 在水介质中,HClO能够引发氧化反应,迫使DNP从Ru(Ⅱ)配合物上分裂下来,导致一个荧光强度大的联吡啶-Ru(Ⅱ)配合物衍生物的形成[Ru(bpy)₂(COOH-bpy)](PF₆)₂,伴随着190倍的荧光强度的增加. 这类钌配合物探针的研发不仅提供了监测生命系统中的HClO的有效方法,而且加强了基于过渡金属配合物设计合成的荧光探针生物成像的应用.

  Liu等^[88]设计合成了基于钌的三(2,2-联吡啶)配合物以共价键连接吩噻嗪的探针46,通过在体内外的氧化还原循环反应对ClO^-/H₂S测定(Scheme 7). 当探针与ClO^-反应后,荧光强度明显增加,归因于探针46被氧化成亚砜衍生物,然而遇到H₂S之后,荧光强度很快恢复到最初水平,原因是探针又被H₂S还原. 这个氧化还原的循环过程能够重复至少12次. 在最优条件下,荧光强度与一定范围的ClO^- 和H₂S浓度呈线性关系,检测限为0.018 (ClO^-)和0.012 nmol/L (H₂S),这比已知的探针低很多. 此法操作简单、响应迅速,适合体内外ClO^-和H₂S的高选择性的可逆测定.

  基于金属配合物设计的荧光探针是在荧光分析方法中经常使用的一种,尤其是过渡金属和稀土金属,本身具有高荧光强度、荧光寿命长、Stokes位移大以及光稳定性好等优点^{[86, 87]},另外在应用于生理分子或离子的时间分辨荧光检测时可以有效地消除复杂环境背景荧光的干扰,进而极大地提高检测的特异性与灵敏度.

  

  图图式8 基于钌的HClO荧光探针48

  Figure 图式8. HClO fluorescent probe 48 based on Ru-complex

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  图图式7 基于钌配合物的HClO荧光探针46

  Figure 图式7. HClO fluorescent probe 46 based on Ru-complex

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  2.8    其他HClO荧光探针

  Zhang等^[94]研发了一种新型的可逆双光子荧光探针52 (Eq. 16),双光子共聚焦显微镜可以采用波长比较长的、在生物体内穿透能力比较强的红外激光作为激发光源,因此可以解决生物组织中深层物质的成像问题. 该探针适合实时且有选择性地监测HClO的含量,成功应用到斑马鱼和活鼠中HClO的双光子荧光成像,可探测到深层组织的HClO,检测限0.35 μmol/L.

  Li等^[95]研发了一种基于荧光染料紫罗兰DV26的比色荧光探针53,用来检测ClO^-,选择性和灵敏度都很高,检测限低至0.037 μmol/L. 当探针与ClO^-作用时,其荧光强度和吸光度都会发生很大变化,可用于ClO^-的生物成像.

  Wang等^[98]以喹啉为荧光团设计合成了一种双光子次氯酸荧光探针57 (Eq. 19),这个探针是以ClO^-能够氧化碳氮双键为基础设计的. 当该探针加入ClO^-时,其荧光强度能够增加23.5倍,此外,该探针还具有很好的选择性.

  Li等^[96]报道了一种以咔唑为荧光团的次氯酸探针54和55 (Eq. 17),该探针能够定位线粒体,很好的水溶性,具有很高的灵敏度和选择性,该探针为荧光增强型探针,当探针与ClO^-作用时,荧光强度增大了很多.

  在三苯胺结构单元中,与氮原子相连的三个苯环具有较高的活性、结构多样性和易裁剪修饰的特性,因此可以通过在苯环上适当的位置外接不同的基团,得到一系列具有特定功能的三苯胺类荧光材料. Shi等^[92]提出了一个简单方法,合成三苯胺肟作为荧光探针50检测ClO^- (Scheme 10). 利用氧化脱肟基反应,将有蓝色荧光的肟基转变为无荧光的醛基,检测限低至5.0×10^-5mol/L(图 4).

  Yuan等^[99]以萘环为荧光团设计合成了两个次氯酸探针58和59 (Scheme 12),分别能够定位线粒体和溶酶体,这两种探针都对ClO^-具备很快的响应时间,很高的选择性和灵敏度. 更重要的是,这两种探针还分别定位到了发炎小鼠的线粒体和溶酶体中.

  

  图4 探针在不同浓度的次氯酸中的量子产率

  Figure 4. Quantum yields of the probe in the presence of different concentrations of hypochlorite anion

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  Xu等^[97]以咪唑啉为荧光团设计合成了以咪唑啉为荧光团的次氯酸探针56 (Eq. 18),该探针本身没有荧光,在与ClO^-作用时,产生黄色荧光. 该探针具备很好的水溶性,选择性和灵敏度都很高,而且很好地应用到了巨噬细胞中.

  

  图图式10 基于三苯胺的HClO荧光探针50

  Figure 图式10. HClO fluorescent probe 50 based on triphenylamine

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  图图式12 靶向线粒体和溶酶体的HClO荧光探针58和59

  Figure 图式12. Chondriosome and lysosome-targeted HClO fluorescent probe 58 and 59

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  图图式11 HClO荧光探针51

  Figure 图式11. HClO fluorescent probe 51

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  Liao等^[93]利用邻氨基苯硫酚与α-羟基萘甲醛的环化、之后与氯代硝基苯成醚和还原氢化等三步反应合成了一种新的荧光探针51 (Scheme 11). 探针能够和HClO反应,在荧光强度和量子产率等方面产生较大变化,从而可以检测HClO的存在. 探针51本身只有非常微弱的荧光,荧光量子产率也仅有0.005,在295和335 nm有吸收,和HClO反应后,在410 nm处有宽的吸收峰出现,在465 nm处有明显的荧光增强,量子产率也提高到0.212. 总之,该探针对HClO有很高的选择性和灵敏度,超过了其他活性氧物质,检测限达到26.2 nmol/L,并且成功应用于HeLa细胞中HClO的检测.

  3    结束语

  本文根据不同的荧光基团进行了分类: BODIPY、罗丹明、荧光素、花菁、对甲氧基苯酚、香豆素和金属配合物等,各有各的优点值得借鉴. 今后,我们还有大量的工作去做,比如进一步研究细胞内次氯酸介导的氧化还原循环机制,开发可以对次氯酸进行可逆响应的荧光探针,设计合成新型近红外荧光探针,尤其是比率荧光探针,以及实现细胞内次氯酸的可逆氧化还原循环荧光成像检测等. 相信在许多科研人员的共同努力之下,研发更高效的荧光探针检测次氯酸的前景是让人乐观的.

  最近几年,荧光探针在次氯酸检测和应用方面进展迅速,对细胞生物学和水环境科学等领域作出了重要贡献. 设计合成具有专一性强、高灵敏性的HClO荧光探针,建立应用于细胞内HClO的荧光显微成像方法,实现目标分子实时、原位的示踪,为研究生物体内与HClO相关的分子和细胞事件,以及与之相关的疾病诊断、药物筛选与评价提供可靠信息,具有重要的科学意义和应用前景.

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  图式1  BODIPY的HClO荧光探针3

  Scheme 1  HClO fluorescent probe 3 of BODIPY

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  图式2  罗丹明B的双功能荧光探针21

  Scheme 2  Fluorescence probe 21 of rhodamine B

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  图 1  用探针孵化RAW264.7细胞的荧光成像[(a)蓝色通道、(b)红色通道]、加LPS的RAW264.7细胞的荧光成像[(c)蓝色通道、(d)红色通道]、(e)荧光强度的比值和(f)经过探针孵育后细胞的生存能力

  Figure 1  Fluorescence images of RAW264.7 cells incubated with a 10 μmol/L probe for 4 h from (a) blue channel and (b) red channel; Fluorescence images of RAW264.7 cells pretreated with lipopolysaccharide (LPS) for 12 h,then incubated with 10 μmol/L probe for 4 h from (c) blue channel and (d) red channel; (e) The ratio (red to blue) of fluorescence intensity; (f) Viability of RAW264.7 cells after treatment with the probe for 4 h at a concentration of 10 μmol/L

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  图 2  用探针孵化细胞的荧光成像[(a)蓝色通道、(b)红色通道]、加LPS细胞的荧光成像[(c)蓝色通道、(d)红色通道]和(e)荧光强度的比值

  Figure 2  Fluorescence images of cells incubated with a 10 μmol/L probe from (a) blue channel and (b) red channel; Fluorescence images of cells pretreated with lipopolysaccharide (LPS),then incubated with 10 μmol/L probe for 4 h from (c) blue channel and (d) red channel; (e) The ratio of fluorescence intensity

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  图式3  基于荧光素的HClO荧光探针24和25

  Scheme 3  HClO fluorescent probes 24 and 25 based on fluorescein

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  图式4  荧光探针25与NaClO的作用

  Scheme 4  Reaction of fluorescent probe 25 and NaClO

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  图式5  基于花菁的HClO荧光探针27

  Scheme 5  HClO fluorescent probe 27 based on cyanine

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  图式6  基于香豆素的HClO荧光探针39

  Scheme 6  HClO fluorescent probe 39 based on coumarin

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  图 3  用探针孵化细胞的荧光成像[(a)蓝色通道、(b)红色通道]、加LPS细胞的荧光成像[(c)蓝色通道、(d)红色通道]、(e)荧光强度的比值

  Figure 3  Fluorescence images of cells incubated with a 10 μmol/L probe from (a) blue channel and (b) red channel; Fluorescence images of cells pretreated with lipopolysaccharide (LPS),then incubated with 10 μmol/L probe for 4 h from (c) blue channel and (d) red channel; (e) The ratio of fluorescence intensity

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  图式7  基于钌配合物的HClO荧光探针46

  Scheme 7  HClO fluorescent probe 46 based on Ru-complex

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  图式8  基于钌的HClO荧光探针48

  Scheme 8  HClO fluorescent probe 48 based on Ru-complex

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  图式9  镧系元素的时间分辨HClO荧光探针49

  Scheme 9  HClO time resolved fluorescent probe 49 based on lanthanide complex

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  图 4  探针在不同浓度的次氯酸中的量子产率

  Figure 4  Quantum yields of the probe in the presence of different concentrations of hypochlorite anion

  Inset: photographs of solutions of the probe in the presence of different concentrations of hypochlorite from low (left) to high (right),taken under UV illumination (365 nm)

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  图式10  基于三苯胺的HClO荧光探针50

  Scheme 10  HClO fluorescent probe 50 based on triphenylamine

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  图式11  HClO荧光探针51

  Scheme 11  HClO fluorescent probe 51

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  图式12  靶向线粒体和溶酶体的HClO荧光探针58和59

  Scheme 12  Chondriosome and lysosome-targeted HClO fluorescent probe 58 and 59

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