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  本文选用吲哚醌和邻氨基苯甲酸衍生物为原料合成色胺酮衍生物.取代邻氨基苯甲酸由相应吲哚醌得到, 这样既能满足合成A环有取代基色胺酮衍生物, 同时能够实现色胺酮A环和D环取代基相同, 有利于研究同一取代基在不同位点对于活性的影响, 以及A和D环修饰对于活性的影响.为了继续深入研究B、C环对活性的影响, 改变B环结构, 在C环引入席夫碱结构.这样合成了色胺酮A、C、D环有取代基和B环修饰的衍生物, 通过A549细胞增值抑制水平进行活性评价, 进而探讨结构与抗肿瘤活性之间的关系.

  色胺酮(tryptanthrin, 1a)属于吲哚喹唑啉类生物碱, 化学名为吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(indolo[2, 1-b] quinazolin-6, 12-dione), 是中药青黛和大青叶及其药用植物马蓝(Strobilanthes cusia)、蓼蓝(Polygonum tinctorum Lour)和菘蓝(Isatis Einetorial)的主要成分之一^[1～3].文献[4～6]报道1879年Sommaruga通过减压升华靛蓝首次得到色胺酮, 1902年Seidel确定了色胺酮的结构, 1971年Schindiels等从色胺酸培养的解脂假丝酵母(Candida lipolytica)代谢产物中分离出色胺酮, 并由此得名; 1977年Bergman等从炮弹树中分离得到色胺酮, 并开启了色胺酮的药理活性研究.结果表明, 色胺酮及其衍生物具有良好的抗炎^[7]、抗菌及抗利什曼虫^{[8, 9]}等活性, 在抗肿瘤^[10～12]、抗结核^[13]、免疫调节^[14]方面的活性引起了广泛关注.

  早在1915年Friedlander等^[15]就通过处理吲哚醌的高锰酸钾水溶液成功得到色胺酮, 但产率很低, 没有实用价值. 2005年Eguchi^[16]以二氧六环为溶剂三乙胺为催化剂经过aza-witting反应也得到色胺酮, 但产率依然很低. Bergman等^[17]以吡啶为溶剂, N-甲基哌啶为催化剂和N, N-二异丙基碳二亚胺(DIC)为脱水剂, 吲哚醌与靛红酸酐反应1 h即可生成色胺酮, 产率75%.但该方法采用吡啶作溶剂, 具有恶臭气味.脱水剂DIC副产物N-取代脲分离困难, 催化剂和脱水剂都很昂贵, 只适合实验室小量合成.用甲苯作溶剂, 三乙胺作催化剂的改进方法快速、简便, 是当前合成色胺酮及其衍生物最常用的方法^{[5, 18]}.我们课题组^[19]曾研究了色胺酮生物合成过程, 证实其生物合成前体是吲哚醌和邻氨基苯甲酸, 并通过仿生合成得到了色胺酮.以取代的吲哚醌和取代的靛红酸酐为原料可以合成有取代基的色胺酮衍生物.例如, 通过Sandmeyer法可以合成吲哚醌苯环上任意位点有取代基的衍生物, 进而可以得到色胺酮D环7～10位有取代基的衍生物.然而, 对A环进行修饰却并不容易, 因为靛红酸酐衍生物不易得到.

  1    结果与讨论

  1.1    化合物的合成

  1.2    结构表征

  以上化合物经IR, ¹H NMR和元素分析确证其结构.色胺酮结构中6位酮羰基在1720～1740 cm^-1有吸收峰, 12位酰胺上的羰基由于共轭效应的影响在1680 cm^-1左右出现强的伸缩振动吸收峰. ¹H NMR谱图出峰主要集中在δ 6.9～9.0之间.化合物1b含有两个同分异构体1b'和1b" , 差异主要集中在D环上, 在同一张核磁图谱上可以明确区分.其中δ 8.78 (d, J=5.8 Hz, 1H)和7.76～7.62 (m, 1H)分别为1b'D环10, 7位氢; δ 8.60 (dd, J=8.7, 3.5 Hz, 1H), 7.53 (t, J=8.7 Hz, 1H)分别为1b" D环10和9位氢. 1b'和1b" A环上的氢重合, 形成四个峰, 每个峰分别含有1b'和1b" 上的一个氢, 共两个氢. 1c情况与1b相似.

  1.3    化合物的生物活性测试

  表1 目标化合物对A549和MC3T3-E1细胞的体外抑制活性 Table1. Inhibitory activity [IC₅₀^a/(μmol•L^－1)] of target compounds against A549 and MC3T3-E1cell growth in vitro

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  Compd.	MC3T3-E1	A549	Compd.	MC3T3-E1	A549
  1a	＞100	74.71	1l	＞100	＞100
  1bb	70.89	3.58	1m	＞100	＞100
  1cb	67.32	0.99	1n	＞100	＞100
  1d	97.01	10.88	1o	89.67	＞100
  1e	＞100	22.64	1pb	67.24	0.51
  1f	＞100	＞100	1qb	68.31	0.43
  1g	＞100	79.21	1r	＞100	54.67
  1h	＞100	＞100	1s	＞100	45.54
  1i	82.03	1.03	1t	＞100	＞100
  1jb	＞100	2.10	Camptothecin	-	0.39
  1k	＞100	＞100	Gefitinib	-	5.44
  a IC50: 50% inhibitory concentration (in triplicate). b Isomers.

  表1 目标化合物对A549和MC3T3-E1细胞的体外抑制活性
  Table1. Inhibitory activity [IC₅₀^a/(μmol•L^－1)] of target compounds against A549 and MC3T3-E1cell growth in vitro

  采用MTT法对所合成化合物进行抗肿瘤活性评价, 选用的细胞株为人肺癌细胞A549.体外抗肿瘤活性数据见表 1.结果表明:化合物1b, 1c, 1i, 1j, 1p和1q表现出较强的肿瘤细胞抑制活性, 其IC₅₀值分别为3.58, 0.99, 1.03, 2.10, 0.51和0.43 μmol•L^-1, 强于母体色胺酮和阳性对照药吉非替尼(5.44 μmol•L^-1), 但弱于喜树碱(0.39 μmol•L^-1); 化合物1d, 1e, 1r和1s的IC₅₀值分别为10.88, 22.64, 54.67和45.54 μmol•L^-1, 弱于阳性对照药, 但强于母体色胺酮.其余化合物IC₅₀值均大于100 μmol•L^-1没有表现出明显的抑制活性.通过MC3T3-E1细胞株(小鼠成骨细胞)的抑制结果可以看出, 1b, 1c, 1d, 1i, 1o, 1p, 1q具有一定的细胞毒性, 对于正常细胞和癌细胞都有作用.

  1.4    构效关系分析

  通过以上数据并结合本课题组前期的研究, 我们发现卤素取代基位于D环时能提高抗肿瘤活性, 而相同取代基在A环时则减弱抗肿瘤活性.例如D环两个氯原子取代后明显提高抗肿瘤活性(0.99 μmol•L^-1).而A环1, 2位氯原子取代时活性比色胺酮还低(IC₅₀＞100 μmol• L^-1).当A和D环都有两个氯取代时(化合物1j)相对于1c活性下降, 但强于单纯的A环取代产物1k, 这是由于A环取代减弱活性和D环取代增强活性的共同作用结果.几乎所有色胺酮3位氯原子取代产物(除过1i)相对于色胺酮活性都有所降低. 1i由于D环有氯和氟原子取代, 活性相对于色胺酮提高, 但是和1c (D环含氯和氟原子)相比并没有提高.结合1g和1h的结果, 可以发现A环3位氯取代不能提高色胺酮的抗肿瘤活性. D环氯和氟原子同时取代产物1b (3.58 μmol•L^-1), 活性好于母体化合物1a和A环取代产物1m.A和D环都有取代基团的产物1g, 1h, 1i, 1j, 1l, 1n, 1o活性都低于相对应的D环取代产物, 大多数还弱于母体色胺酮.然而1p与1q的情况稍有不同, 它们是A和D环同时取代的产物, 但是其抑制活性强于1b, 1c和1m, 可能是卤素原子数目增多引起的.总之, 卤素取代基位于D环时增强抗肿瘤活性, 而相同的取代基在A环时减弱抗肿瘤活性.一般情况下A和D环都有取代基的化合物活性弱于母体色胺酮. B环(嘧啶环)被哌嗪环取代后抗肿瘤活性消失(IC₅₀＞100 μmol•L^-1), 而C环酮羰基生成席夫碱结构后的产物1r和1s相对于母体抗肿瘤活性的改变并不显著.直观的比较取代基团对于色胺酮活性的影响如图 1所示.

  1.1.1    色胺酮衍生物合成

  

  图图式1 文献的合成方法和本文的合成路线

  Figure 图式1. The synthetic approaches reported in literature and used in this paper

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  图图式3 化合物1b的合成

  Figure 图式3. Synthesis of 1b

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  图图式2 色胺酮衍生物的合成

  Figure 图式2. Synthetic route for the synthesis of tryptanthrin derivatives

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  以Sandmeyer法合成吲哚醌.取代苯胺2a～2f与水合氯醛、盐酸羟胺反应合成取代异亚硝基乙酰苯胺3a～3f, 在浓硫酸中重排、闭环制得吲哚醌衍生物4a～4f^[19～22].与其它方法相比该法成本低、收率高, 反应条件温和, 是合成吲哚醌的常用方法.

  目标化合物的合成通式见Scheme 2.

  目标产物的合成.制得的邻氨基苯甲酸衍生物无需纯化直接在甲苯中和氯化亚砜反应得到中间体A, 转变为异构体B, 与吲哚醌反应生成色胺酮衍生物.

  

  图图式4 化合物1m的合成

  Figure 图式4. Synthesis of 1m

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  色胺酮B环(嘧啶环)和A环(苯环)稠合形成喹唑啉, 该结构是重要的抗肿瘤化合物骨架, 例如吉非替尼、厄洛替尼等都含有此结构^[24～28].为了研究色胺酮结构中喹唑啉结构是否为抗肿瘤的必须官能团, 以及色胺酮B环结构对于抗肿瘤活性的意义, 以喹喔啉骨架取代喹唑啉结构合成茚并[1, 2-b]喹喔啉-11-酮(1t), 相当于色胺酮嘧啶环被哌嗪环取代.合成方法是以茚三酮(6a)和邻苯二胺(7a)为原料, 在甲醇中用醋酸催化, 如Eq. 2所示.

  邻、对位有取代基的芳香胺通过贝克曼重排后得到单一产物(例如4-氯苯胺反应后只得到5-氯吲哚醌)^[20].而芳香胺的间位有取代基时, 发生重排反应后得到两个异构体混合物, 以3-氯4-氟苯胺(2b)为例, 如Scheme 3所示.对重排产物用HPLC和¹H NMR分析发现生成的两个异构体4b'和4b" 接近1:1(以¹H NMR中H峰的面积计算, 或HPLC峰的面积计算).由于两个同分异构体的极性非常接近, 很难分离.如果不分离直接用于下一步反应, 得到的产物是两个色胺酮的同分异构体1b'和1b" , 两者的生成量之比接近1:1. 4b'和4b" 直接水解, 得到白色粉末状固体, ¹H NMR结果显示为化合物2-氨基-5-氟-6-氯苯甲酸(5b''), 通过HPLC检测发现有少量的2-氨基-5-氟-4-氯苯甲酸(5b')存在.由于5b''为主产物, 与吲哚醌反应后只得到了1m (Scheme 4) (¹H NMR和HPLC结果都显示并没有2-氟-3-氯色胺酮的生成).整个过程不需柱色谱纯化, 产物纯度较高.运用此方法合成了1p, 也只得到1, 2位取代产物.

  色胺酮水溶性差成为阻碍其进一步开发成药的重要因素, 若通过引入极性基团, 例如羟基、氨基、羧基等改善其水溶性, 同时有可能提高活性.引入极性基团的一种方法是在吲哚醌或邻氨基苯甲酸上引入取代基, 进一步合成色胺酮衍生物.另外一种方法是直接利用C环上的酮羰基与氨基反应形成席夫碱类化合物.以1a和羟胺或者肼在甲醇中回流反应分别生成1r和1s, 如Eq. 1所示, 相对于1a溶解性有所改善.这也有助于研究C环的酮羰基是否是抗肿瘤必须基团以及席夫碱和羟肟结构能否提高其抗肿瘤活性.

  取代邻氨基苯甲酸衍生物的合成.邻氨基苯甲酸是重要的合成中间体, 广泛应用于染料、医药、农药、香料等合成.合成上多采用2-硝基苯甲酸进行硝基还原, 或者以邻苯二甲酰亚胺为原料先通过碱水解, 然后在次氯酸钠中进行霍夫曼重排反应得到.无论是硝基还原还是重排反应, 对于取代的邻氨基苯甲酸都不容易发生.使得此类化合物售价比较昂贵或者无法得到.本文在NaOH-H₂O₂混合溶液中水解吲哚醌衍生物^[23], 得到相应的邻氨基苯甲酸衍生物5a～5d.并对反应条件进行优化, 产率在90%以上.

  2    结论

  本文设计合成了20个色胺酮衍生物, 其中1b, 1c, 1g～1q共13个化合物未见文献报道.对所合成化合物进行结构表征以及抗肿瘤活性评价.结果表明化合物1b, 1c, 1i, 1j, 1p和1q表现出较强的肿瘤细胞抑制活性, 其IC₅₀值分别为3.58, 0.99, 1.03, 2.10, 0.51和0.43 μmol• L^-1.构效关系研究表明卤素取代位于D环提高抗肿瘤活性, 而取代位于A环则减弱抗肿瘤活性. B环(嘧啶环)被哌嗪环取代抗肿瘤活性消失(IC₅₀＞100 μmol•L^-1). C环酮羰基生成席夫碱对抗肿瘤活性影响不显著.这些研究结果有助于进一步设计新抗肿瘤药物.

  3    实验部分

  3.1    仪器与试剂

  人肺癌细胞株A549、小鼠成骨细胞MC3T3-E1; MTT、DMEM-F12培养液、胎牛血清(Hycolone)、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 mg/mL), 均为Hycolone产品.喜树碱, 吉非替尼(分析纯).

  红外光谱用NEXUS 470型傅里叶红外光谱仪测定(KBr压片); ¹H NMR用BrukerAM-400Hz型核磁共振光谱仪(以TMS为内标, CDCl₃或DMSO-d₆为溶剂); 熔点用X-5显微熔点测定仪测定(温度未经校正).甲苯、二氯亚砜、硝酸钠、二氯甲烷、三氯乙醛、苯胺、乙酸乙酯、対氟苯胺、对氯苯胺、无水乙醇、对溴苯胺、对甲基苯胺、3, 5-二甲基苯胺、3, 4-二氯苯胺、3-氯-4-氟苯胺购自阿拉丁试剂公司.无水硫酸钠、浓硫酸(98%)、石油醚、浓盐酸(35%)等所用试剂除特殊说明均为分析纯或化学纯.

  3.2    实验方法

  3.2.3    色胺酮衍生物的合成

  2, 8-二氟-1, 7-二氯吲哚[2, 1-b]吲哚-6, 12-二酮/1, 8-二氟-2, 9-二氯吲哚[2, 1-b]吲哚-6, 12-二酮(1p):黄色固体, 产率41%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.74 (d, J=5.8 Hz, 1H), 8.62 (dd, J=8.9, 3.6 Hz, 1H), 8.56 (dd, J=8.7, 3.6 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.12 (d, J=6.7 Hz, 1H), 7.91 (d, J=4.2 Hz, 1H), 7.66 (d, J=6.6 Hz, 1H), 7.54 (t, J=8.1 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3089, 3041, 1741, 1678, 1599, 1471, 1430, 1355, 1261, 1234, 842 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₄Cl₂F₂N₂O₂: C 51.02, H 1.14, N 7.93; found C 51.00, H 1.13, N 7.81.

  8-氟-3-氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1g):黄色固体, 产率35%. m.p. 298～300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.56 (dd, J=8.5, 3.7 Hz, 1H), 8.30 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.58 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.52 (d, J=4.1 Hz, 1H), 7.44 (t, J=8.6 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3052, 1734, 1678, 1592, 1485, 1309, 846 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₆ClFN₂O₂: C 59.92, H 2.01, N 9.32; found C 59.98, H 2.06, N 9.22.

  邻氨基苯甲酸衍生物0.01 mol加入装有回流冷凝器、磁子、温度计的三颈瓶中, 加入甲苯15 mL, 干燥的SOCl₂ 3 mL, 回流1 h, 停止反应, 减压旋转蒸发除去溶剂和多余的SOCl₂.再往烧瓶中加入0.01 moL的吲哚醌衍生物, 15 mL的二氯甲烷和1mL三乙胺, 继续回流反应1 h, 冷却至室温, 过滤, 得到黄色固体, 用甲醇洗剂, 二氯甲烷或甲苯重结晶.以此方法合成以下色胺酮衍生物.

  8-氟-3, 7-二氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮/8-氟-3, 9-二氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1i):黄色固体, 产率60%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.58 (d, J=5.8 Hz, 1H), 8.48～8.43 (m, 1H), 8.33 (d, J=8.5 Hz, 2H), 8.16～8.08 (m, 2H), 7.91 (t, J=8.0 Hz 1H), 7.82 (d, J=6.4 Hz, 2H), 7.37 (s, 1H); IR (KBr) ν: 3080, 1730, 1680, 1585, 1461, 1291, 1181 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₅Cl₂FN₂O₂: C 53.76; H 1.50, N 8.36; found C 53.80; H 1.46, N 8.42.

  3, 8-二氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1h):黄色固体, 产率35%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.46 (d, J=8.6 Hz, 1H), 8.32 (d, J=8.6 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.94 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.81 (d, J=8.3 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3084, 1738, 1676, 1585, 1458, 1184 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₆Cl₂N₂O₂: C 56.81, H 1.91, N 8.83; found C 56.90, H 1.89, N 8.85.

  吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1a)^[19]:黄色固体, 产率90%. m.p. 268～269 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.64 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.45 (d, J=7.8 Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.92 (d, J=7.4 Hz, 1H), 7.86 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.80 (t, J=7.8 Hz, 1H), 7.68 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.46 (t, J=7.5 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3087, 1727, 1685, 1594, 1460, 1313, 757 cm^-1; ESI-MS m/z: 249.2 [M+H]⁺.

  8, 9-二氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1c')/7, 8-二氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1c" ):黄色固体, 产率80%. m.p.＞300 ℃; 1c': ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.81 (s, 1H), 8.44 (d, J=7.7 Hz, 1H), 8.09～8.02 (m, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.89 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.71 (td, J=7.6, 3.7 Hz, 1H); 1c" : ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.57 (d, J=8.6 Hz, 1H), 8.44 (d, J=7.7 Hz, 1H), 8.09～8.02 (m, 1H), 7.89 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.84 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.71 (td, J=7.6, 3.7 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3061, 1732, 1685, 1584, 1435, 1337, 1179, 773 cm^-1; ESI-MS m/z: 316.9 [M+ H]⁺. Anal. calcd for C₁₅H₆Cl₂N₂O₂: C 56.81, H 1.91, N 8.83; found C 56.77, H 1.88, N 8.89.

  1, 2-二氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1k):黄色固体, 产率57%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.67 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.95～7.88 (m, 2H), 7.81 (t, J=7.9 Hz, 1H), 7.51～7.42 (m, 2H); IR (KBr) ν: 3064, 1730, 1685, 1599, 1461, 1291, 756 cm^-1; ESI-MS m/z: 316.9 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₁₅H₆Cl₂N₂O₂: C 56.81, H 1.91, N 8.83; found C 56.90, H 1.93, N 8.78.

  2, 8-二氟-1-氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1o):黄色固体, 产率47%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.62 (dd, J=8.8, 4.0 Hz, 1H), 8.15 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.10 (d, J=6.6 Hz, 1H), 7.60 (dd, J=6.5, 2.6 Hz, 1H), 7.51 (d, J=2.7 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3087, 3052, 1736, 1675, 1599, 1475, 1314, 1209, 855 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₅ClF₂N₂O₂: C 56.54, H 1.58, N 8.79; found C 56.48, H 1.51, N 8.84.

  1, 2, 8-三氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1l):黄色固体, 产率32%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.62 (dd, J=8.8, 4.0 Hz, 1H), 8.15 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.10 (d, J=6.6 Hz, 1H), 7.60 (dd, J=6.5, 2.7 Hz, 1H), 7.54～7.48 (m, 1H); IR (KBr) ν: 3070, 1736, 1681, 1571, 1459, 1310, 1184, 842 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₅Cl₃N₂O₂: C 51.24, H 1.43, N 7.97; found C 51.25, H 1.40, N 7.85

  3-氯吲哚[2, 1-b]吲哚-6, 12-二酮(1f)^[29]:黄色固体, 产率51%. m.p. 295～297 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.61 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.37 (d, J=8.5 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.93 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.80 (t, J=7.8 Hz, 1H), 7.63 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.45 (t, J=7.5 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3078, 1730, 1677, 1588, 1349, 758 cm^-1; ESI-MS m/z: 281.1 [M-H]⁺. Anal. calcd for C₁₅H₇Cl-N₂O₂: C 63.73, H 2.50, N 9.91; found C 63.68, H 2.55, N 9.94.

  

  图1 目标化合物对A549细胞的抑制活性

  Figure 1. Inhibitory activity of target compounds against A549

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  8-氟-吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1d)^[19]:黄色固体, 产率85%. m.p. 273～276 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.70 (dd, J=8.8, 4.1 Hz, 1H), 8.50 (dd, J=7.9, 1.3 Hz, 1H), 8.09 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.92 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.75 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.64 (dd, J=6.5, 2.7 Hz, 1H), 7.55 (td, J=8.6, 2.7 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3088, 1723, 1689, 1481, 1302, 772 cm^-1; ESI-MS m/z: 267.0 [M+ H]⁺. Anal. calcd for C₁₅H₇FN₂O₂: C 67.67, H 2.65, N 10.52; found C 67.58, H 2.62, N, 10.58.

  2-氟-1, 7, 8-三氯吲哚[2, 1-b]吲哚-6, 12-二酮/1-二氟-2, 8, 9-二氯吲哚[2, 1-b]吲哚-6, 12-二酮(1q):黄色固体, 产率41%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.80 (d, J=5.8 Hz, 1H), 8.62 (dd, J=8.8, 3.7 Hz, 1H), 8.23～8.17 (m, 2H), 8.15 (d, J=6.5 Hz, 1H), 7.72 (d, J=6.7 Hz, 1H), 7.60 (t, J=8.0 Hz, 2H); IR (KBr) ν: 3064, 2918, 2849, 1739, 1682, 1587, 1470, 1345, 1267, 1242, 833 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₄Cl₃FN₂O₂: C 48.75, H 1.09, N 7.58; found C 49.00, H 1.10, N 7.50.

  8-氯-吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1e)^[19]:黄色固体, 产率85%. m.p. 294～296 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.60 (d, J=8.5 Hz, 1H), 8.44 (d, J=7.9 Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.87 (t, J=7.6 Hz, 2H), 7.77～7.67 (m, 2H); IR (KBr) ν: 1732, 1675, 1594, 1460, 1339, 771 cm^-1; ESI-MS m/z: 281.1 [M-H]⁺. Anal. calcd for C₁₅H₇ClN₂O₂: C 63.73, H 2.50, N 9.91; found C 63.68, H 2.55, N 9.94.

  8-氟-9-氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1b')/8-氟-7-氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1b" ):黄色固体, 产率85%. m.p.＞300 ℃; 1b': ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.78 (d, J=5.8 Hz, 1H), 8.43 (d, J=7.7 Hz, 1H), 8.08～7.98 (m, 1H), 7.87 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.76～7.62 (m, 2H); 1b" : ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.60 (dd, J=8.7, 3.5 Hz, 1H), 8.43 (d, J=7.7 Hz, 1H), 8.08～7.98 (m, 1H), 7.87 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.76～7.62 (m, 1H), 7.53 (t, J=8.7 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3044, 1731, 1685, 1593, 1471, 776 cm^-1; ESI-MS m/z: 301.0 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₁₅H₆ClFN₂O₂: C 59.92, H 2.01, N 9.32; found C 59.88, H 2.04, N 9.35.

  2-氟-1, 8-二氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1n):黄色固体, 产率50%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.57 (d, J=8.6 Hz, 1H), 8.15 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.10 (d, J=6.6 Hz, 1H), 7.89 (d, J=2.1 Hz, 1H), 7.78 (dd, J=8.1, 2.1 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3076, 1736, 1682, 1597, 1461, 1421, 1336, 1307, 1183, 797 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₅Cl₂FN₂O₂: C 53.76, H 1.50, N 8.36; found C 53.65, H 1.43, N 8.43.

  1, 2, 7, 8-四氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1j):黄色固体, 产率23%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.16 (d, J=8.5 Hz, 1H), 8.03 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.91 (d, J=8.7 Hz, 1H), 7.82 (d, J=8.3 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3061, 1733, 1684, 1574, 1467, 1432, 1345, 1238, 1165, 1047, 833 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₄Cl₄N₂O₂: C 46.67, H 1.04, N 7.26; found C 46.71, H 1.00, N 7.30.

  2-氟-1-氯吲哚[2, 1-b]喹唑啉-6, 12-二酮(1m):黄色固体, 产率68%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.61 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.16 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.10 (d, J=6.6 Hz, 1H), 7.93 (d, J=7.2 Hz, 1H), 7.82 (t, J=8.1 Hz, 1H), 7.47 (t, J=7.5 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3087, 3038, 1736, 1678, 1597, 1464, 1426, 1357, 1320, 921, 763, 781 cm^-1. Anal. calcd for C₁₅H₆ClFN₂O₂: C 59.92, H 2.01, N 9.32; found C 59.91, H 2.04, N 9.28.

  3.2.2    邻氨基苯甲酸衍生物的合成

  依次加入0.01 mo1的吲哚醌衍生物、50 mL (1 moL/L)氢氧化钠、5 mL (30%)的H₂O₂, 室温搅拌1 h, 用稀盐酸(1 mol/L)中和, 搅拌, 过滤, 滤液酸化至pH 2～3, 抽滤, 水洗, 干燥, 得到白色固体.无需纯化用于下一步实验.

  3.2.1    吲哚醌的合成

  吲哚醌的合成方法参照前期优化的方法^[22].

  3.2.4    色胺酮席夫碱的合成

  色胺酮1.24 g (5 mmoL)放入100 mL的圆底烧瓶中, 加入甲醇15 mL, 逐渐加入5 mmoL的盐酸羟胺或者80%的水合肼, 加热回流2 h, 反应结束冷却至室温, 抽滤, 甲醇洗剂滤饼, 得到黄色固体1t或者1u.

  6-肟吲哚并[2, 1-b]喹唑啉-12-酮(1t)^[30]:浅黄色固体, 产率90%. m.p.291～293 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.65 (s, 1H), 8.55 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.38 (d, J=7.2 Hz, 1H), 8.31 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.90 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.65 (dt, J=15.8, 7.7 Hz, 2H), 7.46 (t, J=7.4 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3116, 3020, 2856, 1693, 1651, 1590, 1455, 1327, 1038, 774 cm^-1.

  6-腙吲哚并[2, 1-b]喹唑啉-12-酮(1u)^[30]:淡黄色固体, 产率95%. m.p.255～257 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 11.16 (d, J=14.7 Hz, 1H), 10.28 (d, J=14.7 Hz, 1H), 8.48 (d, J=7.7 Hz, 1H), 8.33 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.93～7.85 (m, 2H), 7.74 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.60 (t, J=6.9 Hz, 1H), 7.48～7.38 (m, 2H); IR (KBr) ν: 3340, 3145, 1666, 1599, 1541, 1464, 1250, 770 cm^-1.

  3.2.5    茚并[1, 2-b]喹喔啉-11-酮(1v)的合成

  水合茚三酮10 mmol和邻苯二胺10 mmol放入100 mL圆底烧瓶中, 加入20 mL甲醇和1 mL醋酸催化中, 回流1 h, 反应结束后冷却至室温, 抽滤, 甲醇洗剂滤饼, 得到黄色固体茚并[1, 2-b]喹喔啉-11-酮(1v)^[31], 产率90%. m.p. 218～219 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.25 (dd, J=8.3, 1.0 Hz, 1H), 8.16～8.10 (m, 2H), 7.94 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.86～7.73 (m, 3H), 7.62 (t, J=7.8 Hz, 1H); IR (KBr) ν: 3037, 1726, 1604, 1568, 1508, 1198, 1185, 768, 734 cm^-1.

  3.2.8    抗肿瘤活性实验

  抑制率(%)=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值×100%

  辅助材料(Supporting Information)核磁共振氢谱、质谱和红外图谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  处于对数生长期的A549细胞按合适密度接种至96孔培养板中, 每孔15 µL, 放置于5% CO₂、37 ℃恒温培养箱中.培养过夜后, 按照100、50、25、12.5、6.25、3.125及1.56 μmol•L^-1 7个浓度, 每个浓度3个重复孔加药, 并设空白对照, DMSO对照及阳性对照(喜树碱). 24 h后加入5 mg/mL的MTT (20 µL/孔), 继续培养4 h.弃去培养上清, 然后加入DMSO (200 µL/孔), 用酶标仪测定每孔在490 nm吸光度值.采用以下列公式计算化合物对肿瘤细胞生长的抑制率.

  IC₅₀值采用SPSS 19.0计算.

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  图式1  文献的合成方法和本文的合成路线

  Scheme 1  The synthetic approaches reported in literature and used in this paper

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  图式2  色胺酮衍生物的合成

  Scheme 2  Synthetic route for the synthesis of tryptanthrin derivatives

  Reagents and conditions: (a) HONH₃Cl, Cl₃CCHO, Na₂SO₄, H₂O, reflux, 1 h; (b) 95% of H₂SO₄, 65 ℃, 1 h; (c) NaOH, H₂O₂, 1 h; (d) toluene, SOCl₂, 2 h; (e) CH₂Cl₂, Et₃N, reflux, 1 h

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  图式3  化合物1b的合成

  Scheme 3  Synthesis of 1b

  Reagents and conditions: (a) HONH₃Cl, Cl₃CCHO, Na₂SO₄, H₂O, reflux, 1 h; (b) 95% of H₂SO₄, 65 ℃ 1 h; (c) toluene, SOCl₂, 2 h; (d) CH₂Cl₂, Et₃N, reflux, 1 h

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  图式4  化合物1m的合成

  Scheme 4  Synthesis of 1m

  Reagents and conditions: (a) HONH₃Cl, Cl₃CCHO, Na₂SO₄, H₂O, reflux, 1 h; (b) 95% of H₂SO₄, 65 ℃ 1 h; (c) NaOH, H₂O₂, 1 h; (d) toluene, SOCl₂, 2 h; (e) CH₂Cl₂, Et₃N, reflux, 1 h

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  图 1  目标化合物对A549细胞的抑制活性

  Figure 1  Inhibitory activity of target compounds against A549

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  表 1  目标化合物对A549和MC3T3-E1细胞的体外抑制活性

  Table 1.  Inhibitory activity [IC₅₀^a/(μmol•L^－1)] of target compounds against A549 and MC3T3-E1cell growth in vitro

  Compd.	MC3T3-E1	A549	Compd.	MC3T3-E1	A549
  1a	＞100	74.71	1l	＞100	＞100
  1bb	70.89	3.58	1m	＞100	＞100
  1cb	67.32	0.99	1n	＞100	＞100
  1d	97.01	10.88	1o	89.67	＞100
  1e	＞100	22.64	1pb	67.24	0.51
  1f	＞100	＞100	1qb	68.31	0.43
  1g	＞100	79.21	1r	＞100	54.67
  1h	＞100	＞100	1s	＞100	45.54
  1i	82.03	1.03	1t	＞100	＞100
  1jb	＞100	2.10	Camptothecin	-	0.39
  1k	＞100	＞100	Gefitinib	-	5.44
  a IC50: 50% inhibitory concentration (in triplicate). b Isomers.

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