English

• 1.   引言

  环二核苷酸是原核细胞中普遍存在的第二信使, 也是真核细胞先天免疫系统的重要组成^[1], 能有效调节细菌活动^[2].环二腺苷酸(c-di-AMP)是环二核苷酸的一种, 不仅可以参与细胞生长、离子转运、细胞壁代谢平衡等多种生理过程, 同时可以诱导真核宿主细胞产生免疫反应, 与跨膜受体分子STING (STimulator of INterferon Genes)结合, 引起I型干扰素应答, 激发机体天然免疫反应^[3].目前, c-di-AMP的检测主要依赖于高效液相色谱技术^[4]、液相色谱-质谱联用技术^{[5, 6]}, 或依靠荧光标记手段进行定性定量^{[7, 8]}.这些方法具有耗时长、检测成本高、修饰标记操作复杂等缺点, 较难实现c-di-AMP的快速检测分析.

  纳米孔单分子检测技术是一种高灵敏的单分子检测手段.其原理是单个分子在电场驱动下穿过纳米孔道, 由于体积排阻效应和分子与孔道之间相互作用, 产生特征电流阻断信号^[9~13].通过对特征信号进一步分析, 从而获得单分子动态行为信息^[14~17].与其他检测方法相比, 纳米孔单分子检测技术具有无需标记、操作简便、灵敏度高、成本低等优势, 可以在单分子水平实现生物分子的动态行为分析^[18].气单胞菌溶素(Aerolysin)是一种七聚体跨膜蛋白, 其内径约为1.0 nm^[19].由于内径窄且孔道内具有丰富的带正电荷的氨基酸, Aerolysin孔道对寡聚核苷酸单分子分辨能力强^[20], 目前已经广泛应用于寡聚核苷酸分子单个碱基识别^[21], 多糖测量^[22], microRNA^{[23, 24]}检测以及酶解动力学研究^[25]等.然而由于带负电荷的小分子化合物进入孔道的能垒较高, Aerolysin孔道较难获得单个小分子化合物高分辨的纳米孔道离子电流阻断信号.前期研究表明^[26], Li⁺能够有效与Aerolysin纳米孔cis端入口的负电荷残基相结合(图 1a), 降低单链DNA(ssDNA)进入纳米孔道的能垒.因此, 本研究选择LiCl为支持电解质.实验结果表明, c-di-AMP与Aerolysin孔道相互作用, 产生了两种类型的信号: PI穿孔信号和PII碰撞信号.统计发现每分钟内LiCl中PI事件的数量均大于KCl中PI事件的数量.其中, 90 mV电压下, 每分钟LiCl中PI事件的数量可达KCl中PI事件数量的30余倍.且在相同80 mV电压下, KCl缓冲液中有效穿孔时间数量为0, 而同条件LiCl中则大于800/min.实验结果进一步证明Aerolysin孔道可以在LiCl中实现对单个c-di-AMP分子的免标记灵敏识别.本研究结果有望推动Aerolysin孔道对带电小分子化合物的高灵敏检测.

  图 1

  

  图 1.  (a) Aerolysin纳米孔检测单个c-di-AMP分子实验原理图; (b) c-di-AMP的结构式; (c) 100 mV电压下c-di-AMP在1.0 mol/L LiCl缓冲液中产生的阻断电流信号; (d) 100 mV电压下c-di-AMP在1.0 mol/L KCl缓冲液中产生的阻断电流信号.实验中c-di-AMP的终浓度为40 mg/L.信号识别还原过程详见S1

  Figure 1.  (a) Single-molecule analysis of a c-di-AMP with an aerolysin nanopore. (b) The chemical structure of c-di-AMP. The current blockade traces and the typical current blocked event of c-di-AMP translocating through an aerolysin pore in 1.0 mol/L (c) LiCl and (d) KCl at 100 mV, respectively. Data were obtained with the presence of 40 mg/L c-di-AMP at the cis side of the Aerolysin nanopore

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  2.   结果与讨论

  2.1   Aerolysin在KCl和LiCl缓冲液中对单个c-di-AMP分子的检测

  本实验中构建了单个Aerolysin生物纳米孔道^[27], 以磷脂双分子层为界将检测池的两侧划分为cis端和trans端, 两端各加入1.0 mL缓冲液.随后在cis端加入一定量的Aerolysin蛋白, 使之自组装形成单个七聚体跨膜通道, 如图 1a所示.通过施加电压驱动单个c-di-AMP分子通过Aerolysin纳米生物孔, 获得单个c-di-AMP分子与Aerolysin相互作用的特征电流阻断信号.在100 mV电压下, 与在1.0 mol/L KCl缓冲液中结果相比, c-di-AMP在1.0 mol/L LiCl缓冲液中产生的阻断电流信号的事件频率显著增加(图 1c~1d).研究表明^[28], Aerolysin是一类带负电荷的蛋白孔, 尤其是在孔道入口cis端存在有大量带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸残基.带负电的小分子会与Aerolysin孔口表面负电氨基酸残基产生静电排斥作用, 从而使负电荷密度比较大的分子难以被Aerolysin纳米孔捕获. Li⁺电荷密度高, 体积较K⁺小^{[29, 30]}, 这使得Li⁺更容易与Aerolysin表面的负电荷氨基酸残基相结合^[31].因此, 在本研究使用LiCl缓冲液, 以期降低Aerolysin孔口表面负电荷与带两个负电荷的c-di-AMP分子之间的静电排斥, 从而提高Aerolysin对单个c-di-AMP分子检测的灵敏度.

  2.2   LiCl缓冲液中单个c-di-AMP分子与Aerolysin单分子界面的相互作用

  本研究定义τ_off为单个c-di-AMP产生阻断电流信号的阻断时间.对τ_off做直方图进行高斯拟合, 得到单个c-di-AMP在Aerolysin孔内的平均阻断时间. I/I₀为单个c-di-AMP在孔内产生残余电流阻断程度, 其中I₀为单个Aerolysin的开孔电流, I为单个c-di-AMP分子在孔内时的残余电流值, 对其进行高斯拟合可以得到待测物穿孔时的特征电流值, 如图 1c~d所示.在LiCl和KCl缓冲液中, 其二维散点图均具有两个特征信号分布(PI和PII), 这表明c-di-AMP与Aerolysin间的相互作用具有两个明显不同类型(图 2a~b). PI事件大多数都具有较长的阻断时间(τ_off＞0.2 ms)且阻断电流分布相对集中(0.2＜I/I₀＜0.4). PII事件大多数都具有较短的阻断时间(τ_off＜0.2 ms)且阻断电流分布较宽(0.2＜I/I₀＜0.9).对单个c-di-AMP分子与Aerolysin在LiCl缓冲液中相互作用的阻断时间进行统计, PI和PII两种事件的阻断时间随电压变化的关系分别如图 3b~c所示.实验结果表明, PII事件的阻断时间几乎不随电压改变而改变, 数值均集中在0.07±0.01 ms; 而PI型事件则具有显著的电压相关性, 随着电压升高, PI的阻断时间不断减小.根据研究报道^{[32, 33]}, 碰撞信号是由于待测物仅碰撞Aerolysin孔口或进入孔道而未成功穿孔产生的信号, 因而其产生的残余电流值分布相对较宽且阻断时间短.纳米孔道单分子穿孔行为指的是单个待测物分子完全进入并穿过孔道产生的事件.由于单个待测物完全进入限域孔道, 在孔道内产生单一的穿孔行为, 因而造成的离子流残余电流值分布集中且阻断时间长.因此, PII型事件是c-di-AMP分子仅与孔道发生碰撞, 并未穿孔; 而PI型事件则是由c-di-AMP成功穿过Aerolysin孔道而产生的信号, 阻断时间较长, 阻断电流分布较为集中.同时, 由I/I₀的直方图可以发现KCl中PII事件具有两个较明显不同的高斯峰, 分布宽且大部分重合. LiCl中, PII事件也具有两个高斯峰.这是由于小分子化合物对孔道的碰撞存在多种形式^[34], 例如部分单个c-di-AMP进入孔道碰撞而未穿孔; 同时部分仅与Aerolysin孔口碰撞.当c-di-AMP一旦进入孔道内, 并成功穿孔, 其在孔道内的动态运动行为就会相对受限, 从而具有较窄的阻断电流高斯峰, 这有利于实现单分子阻断信号的高灵敏分辨.

  图 2

  

  图 2.  100 mV电压下c-di-AMP在不同缓冲液中的二维散点图: (a) 1.0 mol/L LiCl; (b) 1.0 mol/L KCl.其上方为I/I₀的直方图; 右方为τ_off的直方图. c-di-AMP与aerolysin间相互作用产生的阻断事件可划分为PI和PII两种类型. I/I₀高斯拟合直方图在图S1中显示

  Figure 2.  Two-dimensional (2D) contour plots, related I/I₀ and τ_off histograms for the aerolysin analysis of c-di-AMP at 100 mV in 1.0 mol/L LiCl (a) and 1.0 mol/L LiCl (b). I/I₀ histograms of c-di-AMP by aerolysin were fitted to multiple Gaussian peak. τ_off histograms were also fitted to Gaussian peak. The blockades of c-di-AMP are classified into two populations as PI and PII. The fitted Gaussian peaks in I/I₀ histrogram is shown in Figure S1

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  图 3

  

  图 3.  (a) c-di-AMP与Aerolysin在1.0 mol/L LiCl缓冲液中电压依赖性原始电流信号, 从上到下电压分别是100 mV, 120 mV, 140 mV; (b) c-di-AMP与Aerolysin在1.0 mol/L LiCl缓冲液中PI型事件阻断时间随电压变化关系; (c) c-di-AMP与Aerolysin在1.0 mol/L LiCl缓冲液中PII型事件阻断时间随电压变化关系图; (d) LiCl和KCl缓冲液中, 每分钟PI型事件的数量随电压变化的柱状图; (e) LiCl和KCl缓冲液中, 每分钟PI穿孔事件的数量与每分钟总体事件数量(PI+PII)的比值随电压变化的柱状图

  Figure 3.  (a) The current blockade traces of c-di-AMP translocating through an aerolysin pore in 1.0 mol/L LiCl at 100 mV, 120 mV and 140 mV respectively; (b) The duration of PI in 1.0 mol/L LiCl; (c) The duration of PII in 1.0 mol/L LiCl; (d) The number of PI events per minute in LiCl and KCl; (e) The number of PI/(PI+PII) per minute in LiCl and KCl

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  2.3   单个c-di-AMP分子与Aerolysin生物纳米孔道在LiCl和KCl缓冲液中动态行为研究

  在实验条件一致的情况下, 进一步分析每分钟内不同缓冲液条件下, 每分钟PI事件在不同电压下的数量, 统计结果柱状图如图 3d所示.结果表明在相同电压下, LiCl缓冲液中, 每分钟PI事件数量要大于KCl缓冲液中PI事件的数量.其中, 在90 mV电压下, 在LiCl中每分钟PI事件的数量可达KCl中每分钟PI事件数量的30余倍.随电压的升高, 逐步从30倍变化到9倍.再进一步对每分钟PI事件占每分钟总体事件(PI+PII)的比值进行统计, 结果表明(图 3e), PI与(PI+PII)的比值在不同缓冲液中总体上均随电压升高而增大, 并且在LiCl缓冲液中该数值是在KCl缓冲液中结果的7~11倍.这进一步证明LiCl提高了c-di-AMP穿孔的概率.在80 mV电压下, c-di-AMP在KCl缓冲液中没有出现有效穿孔信号, 而在LiCl中有效穿孔事件数量大于1000/min.研究表明^[26]Li⁺与Aerolysin的平均结合数为194, K⁺与aerolysin的平均结合数为87.因此, 在KCl缓冲液中cis端孔入口处Aerolysin具有较强的负静电势; 而LiCl缓冲液中Aerolysin孔口帽子处大部分区域都具有较高的正电势.由于c-di-AMP分子带负电, 因此LiCl缓冲液中在具有较高正静电势有利于Aerolysin对c-di-AMP分子的捕获.以上结果表明使用Li⁺在相对较低电压下, 即可使c-di-AMP分子克服进入Aerolysin纳米孔道的能量壁垒, 从而获得高时间和电流分辨的信号.进一步, 实验结果显示, Aerolysin纳米孔道可有效检出浓度低至2 μmol/L的c-di-AMP有效穿孔事件(图S2).由于细胞内c-di-AMP浓度为2~8 μmol/L^[35~37], 本研究结果显示Aerolysin纳米孔道具有检测细胞中c-di-AMP分子的潜在能力.

  3.   结论

  综上所述, 本研究基于Aerolysin纳米孔实现了单个c-di-AMP分子的高灵敏检测.实验结果统计分析发现, c-di-AMP分子与Aerolysin间的相互作用具有两种类型: PI是穿孔信号, PII是碰撞信号.对相同实验条件下, KCl和LiCl缓冲液中每分钟PI和PII事件的数量进行统计分析, 结果表明与KCl相比, 使用1.0 mol/L LiCl缓冲液, 能有效屏蔽Aerolysin孔口负电荷, 减弱Aerolysin与带负电荷小分子待测物之间的静电排斥, 从而大大提高Aerolysin对单个带负电荷小分子检测的灵敏度.本研究方法成本低、速度快、灵敏度高且无需对待测物进行化学修饰或标记, 即可通过Aerolysin直接快速检测识别单个c-di-AMP分子.基于Aerolysin纳米孔的单分子检测技术为进一步探究环二核苷酸与受体间作用机制, 阐明新型免疫干扰机制提供新的研究思路.

  4.   实验部分

  基于研究论文报道构建Aerolysin纳米孔道单分子检测^[38].检测池cis端c-di-AMP的终浓度为40 mg/L.实验过程中温度均控制在(19±2) ℃.详细实验步骤及所用药品参见支持信息S2.

  
  
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  图 1  (a) Aerolysin纳米孔检测单个c-di-AMP分子实验原理图; (b) c-di-AMP的结构式; (c) 100 mV电压下c-di-AMP在1.0 mol/L LiCl缓冲液中产生的阻断电流信号; (d) 100 mV电压下c-di-AMP在1.0 mol/L KCl缓冲液中产生的阻断电流信号.实验中c-di-AMP的终浓度为40 mg/L.信号识别还原过程详见S1

  Figure 1  (a) Single-molecule analysis of a c-di-AMP with an aerolysin nanopore. (b) The chemical structure of c-di-AMP. The current blockade traces and the typical current blocked event of c-di-AMP translocating through an aerolysin pore in 1.0 mol/L (c) LiCl and (d) KCl at 100 mV, respectively. Data were obtained with the presence of 40 mg/L c-di-AMP at the cis side of the Aerolysin nanopore

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  图 2  100 mV电压下c-di-AMP在不同缓冲液中的二维散点图: (a) 1.0 mol/L LiCl; (b) 1.0 mol/L KCl.其上方为I/I₀的直方图; 右方为τ_off的直方图. c-di-AMP与aerolysin间相互作用产生的阻断事件可划分为PI和PII两种类型. I/I₀高斯拟合直方图在图S1中显示

  Figure 2  Two-dimensional (2D) contour plots, related I/I₀ and τ_off histograms for the aerolysin analysis of c-di-AMP at 100 mV in 1.0 mol/L LiCl (a) and 1.0 mol/L LiCl (b). I/I₀ histograms of c-di-AMP by aerolysin were fitted to multiple Gaussian peak. τ_off histograms were also fitted to Gaussian peak. The blockades of c-di-AMP are classified into two populations as PI and PII. The fitted Gaussian peaks in I/I₀ histrogram is shown in Figure S1

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  图 3  (a) c-di-AMP与Aerolysin在1.0 mol/L LiCl缓冲液中电压依赖性原始电流信号, 从上到下电压分别是100 mV, 120 mV, 140 mV; (b) c-di-AMP与Aerolysin在1.0 mol/L LiCl缓冲液中PI型事件阻断时间随电压变化关系; (c) c-di-AMP与Aerolysin在1.0 mol/L LiCl缓冲液中PII型事件阻断时间随电压变化关系图; (d) LiCl和KCl缓冲液中, 每分钟PI型事件的数量随电压变化的柱状图; (e) LiCl和KCl缓冲液中, 每分钟PI穿孔事件的数量与每分钟总体事件数量(PI+PII)的比值随电压变化的柱状图

  Figure 3  (a) The current blockade traces of c-di-AMP translocating through an aerolysin pore in 1.0 mol/L LiCl at 100 mV, 120 mV and 140 mV respectively; (b) The duration of PI in 1.0 mol/L LiCl; (c) The duration of PII in 1.0 mol/L LiCl; (d) The number of PI events per minute in LiCl and KCl; (e) The number of PI/(PI+PII) per minute in LiCl and KCl

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