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• 1.   引言

  近年来, 荧光生物成像技术由于具有快速有效、灵敏度高、易于实现多通道成像及经济快捷等优势, 在生命科学研究和医疗诊断等领域前景巨大^[1~6].有机荧光染料具有良好光电特性、易于功能化修饰、光学性能可调、生物相容性好等优点, 已被广泛用作生物成像试剂.然而, 传统的有机荧光分子由于在聚集态下易发生π-π堆积而导致荧光淬灭(aggregation-caused quenching, ACQ), 限制其在聚集态或高浓度下的生物成像应用^{[7, 8]}. 2001年唐本忠院士在五苯基噻咯衍生物中发现了聚集诱导荧光增强(aggregation-induced emission, AIE)这一独特的发光现象^{[9, 10]}, 该类分子越聚集, 发光越强, 这从根本上解决了传统荧光材料的ACQ现象, 在生物荧光成像领域展现出诱人的应用前景^[11~14].迄今为止, 大量基于AIE特性的有机荧光分子已在生物探针、细胞成像、化学传感、电致发光等领域得到了广泛应用^{[5, 15~19]}.例如, 唐本忠院士团队制备了一种基于四苯乙烯(TPE)和壳聚糖的聚合物纳米粒子, 其表现出典型的AIE性质, 能够有效进入Hela细胞, 并持续追踪细胞的时间可长达15代^[20].近期, 唐本忠院士团队^[21]报道了第一例含有季铵盐结构的具有水溶性、特异性成像和治疗功能的NIR-Ⅱ发光AIE分子(文献中被命名为TTVP), 此分子可在几秒钟特异性地靶向细胞膜. 2016年, 吴水珠等^[22]设计并合成了一种近红外发射的AIE衍生物DTPE, 再通过偶联反应得到AIE分子DPTE-Tau, 该分子具有优异的生物相容性, 可用于细胞活性氧的清除和细胞荧光成像.

  具有纳米结构的智能材料一直是当今科学领域的研究热点.刺激响应性聚合物纳米粒子由于兼具纳米粒子和聚合物的优势, 以及随环境变化做出智能响应的特性, 已经被广泛应用于生命科学领域.其中, 环境响应型AIE荧光聚合物纳米材料是一类重要的可用于生物光学传感和成像的新型功能材料^[23~27].例如, Zhang等^[28]设计并制备了具有温敏响应特性的AIE聚合物TPE-PNIPAM, 其在水溶液中能够自组装形成纳米颗粒, 具有温敏性及低细胞毒性, 在HeLa细胞中示踪7代后荧光成像效果仍然明显, 是一种良好的细胞示踪材料. Liu等^[29]在两亲性共聚物PLL-g-PEG侧链同时引入AIE基元TPS、光敏剂PheA及pH响应基团DPA, 制备了多功能响应性AIE聚合物.该聚合物在生理条件下会自组装成AIE纳米粒子, 可有效示踪多功能聚合物材料对被靶向细胞的杀伤效果, 实时反映“药物”在细胞内的分布并监控了治疗过程.经过十几年的发展, AIE聚合物纳米材料已在生物检测和成像等领域得到了应用, 但相较于AIE小分子, 其研究报道尚显不足.此外, 目前所报道的响应性AIE聚合物多表现为对单一刺激信号的响应, 而具有多响应能力的AIE聚合物纳米粒子却不多见.众所周知, 生物医学应用环境较为复杂, 单响应材料已不能满足生物应用需求.因此, 开发多响应性AIE聚合物纳米材料在生物领域具有重要的研究意义和应用价值.

  2016年, 张望清课题组^[30]报道了一种新型三重响应性聚合物:聚[N-[2-(二乙基氨基)乙基]丙烯酰胺] (PDEAEAM), 该聚合物表现出优异的温度/pH/CO₂三重响应特性, 可满足生物复杂环境下的多种刺激响应的需求, 为复杂环境提供新的聚合物载体材料.本研究结合AIE和三重响应性聚合物PDEAEAM的各自优点, 设计合成一种新型的具有优异AIE发光特性及温度/ pH/CO₂三重响应特性的双亲性聚合物TPE-g- PDEAEAM, 再通过自组装制备一种多响应性AIE聚合物纳米粒子.研究了它的AIE发光性能、温度/pH/CO₂三重响应性能、细胞荧光成像及长效示踪能力.该聚合物纳米粒子具有优异的AIE特性、荧光三重响应特性及低细胞毒性, 在细胞中示踪11代后, 仍然具有良好的荧光成像性能, 具有作为细胞显影或作为生物示踪剂的潜能.

  2.   结果与讨论

  2.1   多响应性AIE聚合物的设计及合成

  本研究采用长烷基链桥连四苯乙烯(TPE)与聚合物响应性PDEAEAM的方式, 构建多响应性AIE聚合物纳米材料.首先根据文献^[30]合成多刺激响应性单体: N-[2-(二乙基氨基)乙基]丙烯酰胺, 通过¹H NMR (Figure S1)确定其结构.然后, 采用ATRP活性聚合方法, 以所合成的含有TPE生色团及丙酰溴基的4-(12-羟基十二烷基-2-甲基丙酰溴基)四苯乙烯(TPE-BIB)为引发剂, 引发单体聚合, 成功制备具有温度/pH/CO₂三重响应性的两亲性聚合物TPE-g-PDEAEAM, 并通过自组装形成纳米微球, 合成路线及组装示意图如图 1所示. TPE-g- PDEAEAM的¹H NMR、IR谱图及GPC数据分别见Figure S5, Figure S6和Table S1.

  图 1

  

  图 1.  聚合物TPE-g-PDEAEAM的合成路线

  Figure 1.  Synthetic route of the polymer TPE-g-PDEAEAM

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  2.2   TPE-g-PDEAEAM纳米粒径自组装与微观形貌

  本研究制备的聚合物TPE-g-PDEAEAM具有两亲性质, 疏水链端由TPE和十二烷基链组成, 亲水链端由PDEAEAM聚合物链组成.通过将水缓慢地加入到TPE-g-PDEAEAM的四氢呋喃溶液中, 能够自组装形成荧光聚合物纳米粒子.其中, TPE发光团和疏水链段十二烷基链作为粒子的核分布在纳米粒子的内部, 而PDEAEAM链段分布在纳米粒子的表面.

  在图 2a中内插图中, 我们可以观测到TPE-g- PDEAEAM水溶液在激光照射下具有明显的丁铎尔效应, 表明TPE-g-PDEAEAM能够自组装成纳米粒子.通过聚合物纳米粒子的SEM图(图 2b), 我们可以观察到, TPE-g-PDEAEAM纳米微粒具有规整的球形结构, 并且具有较好的单分散状态. 图 2a为TPE-g- PDEAEAM稀溶液流体动力学尺寸统计图, 通过DLS方法测得的纳米粒径大小为200 nm左右, 其与SEM图中的纳米微球尺寸一致.

  图 2

  

  图 2.  (a) 浓度为2 mg/mL的流体动力学尺寸(插图:激光照射下TPE-g-PDEAEAM水溶液的丁铎尔效应照片, (b) TPE-g-PDEAEAM的SEM图像

  Figure 2.  (a) Hydrodynamic size with concentration of 2 mg/mL. Inset: Photograph of TPE-g-PDEAEAM solutions in water under irradiation of laser point. (b) SEM image of TPE-g-PDEAEAM polymer dots

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  2.3   TPE-g-PDEAEAM的AIE特性

  为了考察TPE-g-PDEAEAM的AIE性能, 我们分别通过逐步增大TPE-g-PDEAEAM水溶液浓度及加入TPE不良溶剂后测试其溶液荧光强度变化的两种方法来验证TPE-g-PDEAEAM的AIE特性.

  首先考察聚合物的浓度变化对荧光的影响, 如图 3所示, 随着TPE-g-PDEAEAM水溶液浓度的增大, 其荧光强度也随之明显增强.这主要是由于聚合物浓度的不断增大, TPE-g-PDEAEAM分子会发生聚集, 进而使得荧光强度显著增强, 证明其物质具有AIE特性.

  图 3

  

  图 3.  (a) 不同浓度的TPE-g-PDEAEAM溶液的荧光光谱(激发波长为337 nm). (b)不同浓度的TPE-g-PDEAEAM溶液的荧光强度的相对变化及在紫外灯照射下(365 nm)的数码相片

  Figure 3.  (a) Fluorescence spectra of aqueous solutions of TPE-g-PDEAEAM at different concentrations (ex=337 nm). (b) Relative changes in fluorescence intensity of different concentrations of TPE-g-PDEAEAM aqueous solution and digital photographs under UV light (365 nm)

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  为了进一步验证TPE-g-PDEAEAM分子的AIE性质, 我们测试了不同H₂O/THF比例下, TPE-g- PDEAEAM聚集体的发射变化. 图 4为不同水含量混合溶液(H₂O/THF)中TPE-g-PDEAEAM的荧光谱图及荧光强度比率曲线图.从图中可知, 随着H₂O体积分数的不断增加, TPE-g-PDEAEAM溶液的荧光强度不断增强.当水含量增加到80%以上时, 分子聚集体开始大量形成, 荧光强度开始快速增大, 最终其荧光强度变为THF溶液中的14倍.这主要是因为随着混合溶剂中水体积分数的增大, 水能够使TPE-g-PDEAEAM中亲水的聚合链呈舒展状态, 这更有利于处于分子链末端的疏水性TPE分子片段发生紧密聚集, 进而限制了四苯乙烯单元中苯环的振动和扭曲, 荧光发射峰强度明显增强.这与四苯乙烯的聚集诱导荧光效应的现象一致^[31].

  图 4

  

  图 4.  (a) 在水/THF混合溶剂中TPE-g-PDEAEAM溶液的荧光光谱(激发波长为337 nm). (b) TPE-g-PDEAEAM在水/THF混合溶剂荧光强度的相对变化及其在紫外灯下(365 nm)的数码相片

  Figure 4.  (a) Fluorescence spectra of TPE-g-PDEAEAM in a mixed solvent of water and THF (λ_ex=337 nm). (b) The relative change in fluorescence intensity of TPE-g-PDEAEAMTPE in a water/THF mixed solvent and its digital photograph under UV light (365 nm)

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  2.4   TPE-g-PDEAEAM的温度/pH/CO₂三重敏感响应特性

  2.4.1   TPE-g-PDEAEAM的温度敏感响应特性

  PDEAEAM是一种温敏性聚合物, 其最低临界溶液温度(LCST)为36 ℃, 在升温过程中, PDEAEAM大分子链构象发生变化, 由原来的无规线团开始形成蜷缩结构, 接着由于链段与水分子间的氢键被破坏, 大分子链进一步折叠, 导致伸展构象塌陷, 即“线团-塌缩球的转变”, 从而使高分子链段间发生聚集^{[30, 32]}.为了考察TPE-g-PDEAEAM的温度敏感响应特性, 我们先将TPE-g-PDEAEAM水溶液由室温慢慢加热至80 ℃, 然后再缓慢降温, 观察加热-降温循环过程中溶液的透明度, 并测定不同温度下的透光度.在室温下, TPE-g- PDEAEAM的水溶液为澄清透明溶液, 随着温度的升高, 溶液逐渐变浑浊, 当温度高至60 ℃以上, 溶液呈现白色乳浊状.持续升温至80 ℃后冷却至室温, 该白色乳浊液再次变得澄清透明.这种现象证实了TPE-g-PDEAEAM相变的可逆性. 图 5是浓度为2 g/L的TPE-g-PDEAEAM水溶液随温度变化的透光率曲线图.由图可得, TPE-g-PDEAEAM水溶液的LCST约为60 ℃, 比文献报道的PDEAEAM的LCST高很多.我们认为, 这可能是由于聚合物链末端TPE的存在, 影响PDEAEAM链构象变化导致的. TPE-g-PDEAEAM链上疏水性TPE在水溶液中的聚集必然会抑制另一端PDEAEAM链的运动, 从而干扰分子内氢键的形成, 当温度升高到60 ℃以上, 聚合物链剧烈的热运动抵消了这种干扰, 从而发生构象变化.

  图 5

  

  图 5.  TPE-g-PDEAEAM在浓度为2 g/L的变温紫外.插图: TPE-PDEAEAM溶液在25 ℃(左)和66 ℃(右)下在可见光的照片

  Figure 5.  TPE-g-PDEAEAM polymer quantum dots in a variable temperature ultraviolet (UV) concentration of 2 g/L. Inset: Photograph of visible light in TPE-PDEAEAM solution at 25 ℃ (left) and 65 ℃ (right)

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  此外, 我们通过测试TPE-g-PDEAEAM在20~66 ℃温度区间内荧光强度的变化, 进一步研究了温度对其荧光性质的影响, 如图 6a所示, 起初TPE-g- PDEAEAM水溶液的荧光强度随着温度的升高不断减弱, 而升温至58 ℃以后, 其荧光强度随着温度的升高增强, 这主要是因为随着温度的升高, 分子运动和分子内旋转必然会加快, 进而导致TPE-g-PDEAEAM荧光减弱.但是当温度接近LCST时, 由于大分子链折叠导致塌陷结构, 引起聚合物链上TPE分子的聚集, 从而使荧光增强.由此可见, PDEAEAM链的温敏性能够赋予TPE-g-PDEAEAM水溶液荧光的温度响应性, 充分证明了TPE-g-PDEAEAM结合了TPE的AIE特性和PDEAEAM的优良性质, 这为设计新型的功能AIE材料提供了新的思路.

  图 6

  

  图 6.  (a) TPE-g-PDEAEAM在温度从20 ℃升高到66 ℃的水溶液中的荧光光谱. [TPE-g-PDEAEAM]=2.0 g/L. λ_ex=337 nm.插图: TPE-g-PDEAEAM溶液在25 ℃(左)和65 ℃(右)下在可见光和紫外灯下的照片. (b)不同温度下TPE-g-PDEAEAM溶液中的相对荧光强度(I/I₀)的变化

  Figure 6.  (a) Fluorescent spectra of the TPE-g-PDEAEAM in aqueous solution with temperature increasing from 20 to 66 ℃. [TPE-g-PDEAEAM]=2.0 g/L. λ_ex=337 nm. Inset: Photo of TPE-g-PDEAEAM solution under 25 ℃ (left) and 65 ℃ (right) under visible and UV light. (b) Change of relative fluorescent intensity (I/I₀) of TPE-g-PDEAEAM in aqueous solution under different temperature

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  2.4.2   TPE-g-PDEAEAM的pH敏感响应特性

  我们通过测试TPE-g-PDEAEAM在不同pH水溶液中荧光强度的变化, 研究了其荧光对pH的响应性.如图 7所示, 在酸性条件(pH从3.0~6.5)下, TPE-g- PDEAEAM水溶液荧光强度随pH增大不断增强, 但与中性条件下的相对荧光强度比均＜1.在碱性条件(pH从7.5~13.5)下, 其荧光强度持续增强, 而相对荧光强度比＞1.导致TPE-g-PDEAEAM水溶液荧光强度随pH增大而增强的主要原因是:在酸性环境中, PDEAEAM上叔胺基发生质子化后带有大量正电荷, 由于正电荷之间的相互排斥作用使PDEAEAM链段成为伸展构象致使其链端的TPE分子聚集受限, 导致荧光发射较弱^[33].而在中性和碱性环境中, 叔胺基上的正离子随pH值的增大逐渐减少, PDEAEAM链段溶解性逐渐降低而引起自身链段收缩缠绕, 有利于链端分子TPE的聚集, 从而发射较强荧光, 最终导致水溶液荧光强度随pH增大呈现增强的趋势.因此, 我们可以通过荧光监测来判断生物体内环境中的pH变化, 该聚合物具有作为光学传感器、生物传感器的潜能.

  图 7

  

  图 7.  (a) TPE-g-PDEAEAM在不同pH溶液中的荧光光谱. (b)不同pH下TPE-g-PDEAEAM溶液中的相对荧光强度(I/I₀)的变化. [TPE-g-PDEAEAM]=2.0 g/L

  Figure 7.  (a) Fluorescent spectra of the TPE-g-PDEAEAM in different pH solution. (b) Change of relative fluorescent intensity (I/I₀) of TPE-g-PDEAEAM in aqueous solution under different pH. [TPE-g-PDEAEAM]=2.0 g/L

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  2.4.3   TPE-g-PDEAEAM的CO₂敏感特性

  CO₂不仅是与生命活动息息相关的气体, 也是现代化工业生产的重要原料和工业废气的主要成分之一, 对其进行高灵敏度检测, 在环境、化学、生物等研究领域都有着重要的意义.因此, 具有二氧化碳响应性的纳米材料具有广阔的应用前景.

  张望清课题组在研究聚合物PDEAEAM的CO₂响应性时发现, 向温度超过LCST的PDEAEAM白色乳浊液中通入CO₂气体, 由于CO₂可与PDEAEAM发生作用, 形成氨基甲酸酯盐, 大大增强聚合物PDEAEAM的溶解能力, 从而导致浑浊液快速变成澄清透明溶液, 随后向溶液中反向通入N₂气后, 由于CO₂被排除体系外, 透明的溶液又恢复为白色乳浊液^{[30, 34]}.因此，由于TPE-g-PDEAEAM中聚合物片段PDEAEAM在CO₂水溶液中溶解性的增强, 将会降低TPE-g-PDEAEAM聚合物链的聚集程度, 致使其链端的TPE分子聚集受限, 从而导致纳米粒子的荧光强度下降, 表现出对CO₂的荧光响应性能.

  为了考察TPE-g-PDEAEAM水溶液荧光对CO₂响应特性, 向浓度为2.0 mg/mL的50 mL溶液中分别通入不同体积的CO₂气体, 然后测定不同CO₂含量下TPE-g-PDEAEAM水溶液的荧光发射.如图 8所示, 当CO₂的通入体积量由0 mL增加到0.4 mL时, 荧光强度急剧减弱; 当CO₂的体积由0.4 mL增加到5.0 mL时, 荧光强度发生微小的减弱并降至最低点.研究结果表明, TPE-g-PDEAEAM具有较好的CO₂敏感响应特性, 有望作为CO₂的荧光传感器材料.

  图 8

  

  图 8.  (a) TPE-g-PDEAEAM在不同的CO₂体积溶液的荧光光谱.插图:通入二氧化碳前后在紫外灯下(365 nm) 2 mg/mL的TPE-g- PDEAEAM水溶液的数码相片. (b)相对荧光强度的线性(I/I₀)与CO₂体积的关系

  Figure 8.  (a) Fluorescence spectra of TPE-g-PDEAEAM in different CO₂ volume solutions. Inset: Digital photo of a 2 mg/mL TPE-g- PDEAEAM aqueous solution under UV light (365 nm) before and after carbon dioxide. (b) The relationship between the linearity of relative fluorescence intensity (I/I₀) and the volume of CO₂

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  2.5   TPE-g-PDEAEAM的细胞毒性及细胞成像研究

  细胞毒性的评估在细胞成像中至关重要.为了研究TPE-g-PDEAEAM纳米微球的细胞毒性, 选取宫颈癌细胞Hela细胞作为细胞模型, 将其在不同浓度的TPE-g-PDEAEAM水溶液中孵育48 h后, 通过MTT实验对探针的细胞毒性进行评价.由图 9a可见, 分别将Hela细胞在50、100、200、300、400 μg/mL五种浓度的TPE-g-PDEAEAM水溶液中孵化后, 均有95%以上的Hela细胞存活, 实验结果表明该聚合物纳米微球具有低的细胞毒性, 可用于肿瘤细胞荧光成像.

  图 9

  

  图 9.  (a) 用不同浓度的TPE-g-PDEAEAM处理48 h后HeLa细胞毒性测试; (b) TPE-g-PDEAEAM染色HeLa细胞不同代数的共聚焦显微镜图像, 比例尺是25 μm

  Figure 9.  (a) Cell viabilities of HeLa cells treated with different concentrations of TPE-g-PDEAEAM for 48 h by MTT assay. (b) Confocal microscopy images of HeLa cells TPE-g-PDEAEAM staining (100 μg/mL) in different algebras. The scale bar is 25 μm

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  基于TPE-g-PDEAEAM优异的AIE发光特性和低细胞毒性, 对其进行细胞荧光示踪研究. 图 9b为在浓度为100 μg/mL的TPE-g-PDEAEAM一次性染色24 h后, Hela细胞不同代数共聚焦显微镜图像.由图可知, Hela细胞在TPE-g-PDEAEAM溶液中孵育24 h (第一代)后, 能检测到很强的荧光信号, 而细胞内荧光强度相对较弱的区域是细胞核的位置, 表明该纳米粒子选择性的染色HeLa细胞的细胞质区域.继续将HeLa细胞在TPE-g-PDEAEAM中孵育24 h后, 仍能检测到较强的荧光信号.为了进一步研究TPE-g-PDEAEAM是否可以作为长期追踪细胞的示踪剂, 我们对上述的Hela细胞进行传代, 由于Hela细胞的细胞周期约24 h, 在染色24 h后, 观察到的细胞为第2代, 在48 h后为第3代, 在72 h后为第4代, 以此类推至第11代.每24 h重复一次, 可通过共聚焦显微镜检测每一代细胞内荧光强度情况.染色后的Hela细胞在长达12天的时间内, 示踪至少11代后, 依然具有良好的荧光成像效果.这一实验结果表明TPE-g-PDEAEAM能够有效示踪HeLa细胞增殖至少11代以上, 有望作为一种活细胞荧光示踪探针材料.

  3.   结论

  综上所述, 通过ATRP活性聚合反应合成了一种新型的多刺激响应型AIE聚合物纳米微球TPE-g- PDEAEAM.由于该聚合物链构象或分子结构可随环境温度, pH和CO₂含量的改变而变化, 因而引起链端TPE分子聚集程度的改变, 从而使荧光强度产生规律性变化.实验结果表明, TPE-g-PDEAEAM水溶液的LCST约为60 ℃, 在LCST之前, 其荧光强度随着温度的升高减弱, 当升温至接近LCST后, 其荧光强度随着温度的升高增强, 这是由大分子链折叠导致塌陷结构, 引起聚合物链上TPE分子的聚集导致的.此外, TPE-g-PDEAEAM水溶液荧光强度随pH增大不断增强.同时, 当CO₂的通入体积量由0 mL增加到5.0 mL时, TPE-g-PDEAEAM水溶液荧光强度急剧减弱并降至最低点.因此, TPE-g-PDEAEAM具有温度/pH/CO₂三重敏感响应特性, 有望作为多响应智能荧光传感器材料.

  与此同时, 基于TPE-g-PDEAEAM优异的AIE发光特性和低细胞毒性, Hela细胞在TPE-g-PDEAEAM溶液中孵育24 h(第一代)后, 可检测到强荧光信号, 而染色后的Hela细胞在长达12天的时间内, 示踪至少11代以上, 依然展现出良好的荧光成像效果.因此, 该聚合物纳米材料是一种理想的活细胞荧光示踪探针, 有望应用于生物传感器、细胞长期示踪及医用生物材料等相关领域.

  4.   实验部分

  4.1   单体N-[2-(二乙基氨基)乙基]丙烯酰胺的合成

  根据文献^[30]合成单体N-[2-(二乙基氨基)乙基]丙烯酰胺, 具体操作如下:在磁力搅拌下将N, N-二乙基乙二胺(8.72 g, 75 mmol)和75 mL CHCl₃加入250 mL的单口圆底烧瓶中, 在冰水浴中缓慢滴加50 mL溶有丙烯酰氯(7.2 mL, 90 mmol)的CHCl₃.滴加完后在室温搅拌下继续反应1 h.反应结束后反应液分别用100 mL 1 mol/L的NaOH溶液和100 mL水洗涤, 并加入CHCl₃萃取, 有机相用MgSO₄干燥后, 通过旋转蒸发除去有机溶剂, 最后用柱层析法对其进行分离提纯, 以乙酸乙酯为淋洗剂, 得到约23.3 g棕色液体产物, 产率: 91%. ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 6.31~6.22 (m, 2H), 1H), 3.37 (dd, J=11.5, 5.5 Hz, 2H), 2.59~2.50 (m, 6H), 1.01 (t, J=7.1 Hz, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 165.44, 131.11, 125.82, 51.28, 46.63, 36.84, 11.63.单体的¹H NMR见Figure S1.

  4.2   4-羟基四苯乙烯(TPE-OH)的合成

  将Zn粉(20 g, 0.31 mol), 4-羟基二苯甲酮(9.9 g, 0.05 mol)和二苯甲酮(9.1 g, 0.05 mol)溶于200 mL THF中, 在氩气保护下加入TiCl₄ (30.0 mL, 0.27 mol)回流24 h, 反应结束后冷却至室温, 然后向其中加入150 mL 10%的K₂CO₃水溶液, 搅拌0.5 h.然后过滤, 滤液用乙酸乙酯进行萃取, 并通过旋转蒸发除去有机溶剂, 最后用柱层析分离法对其进行分离提纯(洗脱剂: V_乙酸乙酯:V_石油醚=1:10), 最终得到6.1 g白色固体产物TPE-OH, 产率约为35 %. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.13~6.97 (m, 15H), 6.89 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6.55 (d, J=8.6 Hz, 2H), 4.60 (s, 1H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 153.96, 144.28, 140.29, 136.37, 132.7, 131.52, 127.63, 126.24, 114.57. ESI-MS: M=348.48. TPE-OH的¹H NMR见Figure S2.

  4.3   4-(12-羟基十二烷基)四苯乙烯(TPE-C₁₂-OH)的合成

  将TPE-OH (3.48 g, 0.01 mol)、12-溴-1-十二烷醇(2.8 mL, 0.012 mol)和K₂CO₃ (1.66 g, 0.012 mol)溶解于100 mL无水乙腈中, 在氩气保护回流反应24 h.反应结束后, 将反应液冷却至室温, 然后过滤, 滤饼用乙腈洗涤2~3次, 所得滤液通过旋转蒸发除去有机溶剂, 最后用柱层析分离法对其进行分离提纯(淋洗剂: V_乙酸乙酯: V_石油醚=1:5), 最终得到2.6 g淡黄色固体产物TPE-C₁₂-OH, 产率约为48.8%. ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 7.16~7.05 (m, 15H), 6.98 (d, J=8.8 Hz, 2H), 6.67 (d, J=8.8 Hz, 2H), 3.92~3.85 (m, 2H), 3.65 (t, J=6.7 Hz, 2H), 3.45~3.37 (m, 1H), 2.03~1.82 (m, 2H), 1.81~1.75 (m, 2H), 1.67~1.54 (m, 4H), 1.47 (dd, J=14.2, 9.0 Hz, 4H), 1.35 (s, 8H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ: 153.96, 144.28, 140.29, 136.37, 132.71, 131.52, 127.63, 126.24, 114.57. TPE-C₁₂-OH的¹H NMR见Figure S3.

  4.4   ATRP引发剂4-(12-羟基十二烷基-2-甲基丙酰基)四苯乙烯(TPE-BIB)的合成

  将TPE-OH (5.33 g, 0.01 mol)、三乙胺(1.75 mL, 0.0125 mol)和2-溴-2-甲基丙酰溴(1.5 mL, 0.0125 mol)溶于150 mL无水乙腈中, 在室温下搅拌反应24 h, 反应结束后, 抽滤, 所得滤液通过旋转蒸发除去有机溶剂, 最后用柱层析分离法对其进行分离提纯(淋洗剂: V_乙酸乙酯:V_石油醚=1:10).最终得到4.4 g淡黄色的固体产物, 产率约为65%. ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 8.89~7.06 (m, 15H), 7.06~6.92 (m, 2H), 6.85~6.49 (m, 2H), 4.39~4.16 (m, 2H), 3.93~3.70 (m, 2H), 2.14~1.91 (m, 7H), 1.93~0.80 (m, 24H). TPE-BIB的¹H NMR见Figure S4.

  4.5   TPE-g-PDEAEAM的合成

  将单体N [2-(二乙基氨基)乙基]丙烯酰胺(3.0 g)溶解在15 mL甲醇和水混合溶剂(V_甲醇:V_水=1:2)中, 搅拌20 min后在氩气保护下用注射器缓慢滴加160 μL三(2-二甲氨基乙基)胺Me₆TREN, 搅拌10 min后加入CuBr₂ (0.0282 g, 0.1960 mmol), 再搅拌10 min后加入引发剂TPE-BIB (0.05 g, 0.05 mmol), 室温聚合24 h.聚合反应结束后, 产物用透析袋(MWCO=5000)透析两天, 冷冻干燥后得淡黄色固体粉末2.3 g, 产率为75%. TPE- g-PDEAEAM的¹H NMR, IR谱图见Figure S5, Figure S6, GPC数据见表Table S1.

  4.6   MTT法研究TPE-g-PDEAEAM的细胞毒性

  将HeLa细胞以10000个细胞/孔的密度接种在96孔培养板中.培养箱培养24 h后, 用不同浓度的TPE-g-PDEAEAM孵育细胞.随后用配好的PBS洗涤Hela细胞, 并将5 mg/mL的MTT溶液(10 μL)和Hela细胞的培养基(90 μL)加入到每个孔中的细胞中去.将96孔培养板在37 ℃的CO₂培养箱(含5% CO₂)中温育4 h.清除含有MTT的培养基, 然后加入二甲亚砜(DMSO, 100 μL)溶解甲瓒晶体.最后, 使用RT-6100酶标仪在492 nm处测量96孔培养板的吸光度.

  4.7   TPE-g-PDEAEAM的细胞成像

  先将Hela细胞预先接种在12孔培养板细胞片上.加入培养基(含有1%链霉素和10%胎牛血清)后将12孔板置于温度为37 ℃、CO₂浓度为5%的潮湿培养箱中24 h.随后用100 μg/mL的TPE-g-PDEAEAM孵化Hela细胞, 24 h后取出细胞片, 用磷酸盐缓冲溶液冲洗三次.本实验所有细胞成像图片均使用Olympus FV1000共聚焦显微镜(Olympus Tokyo Japan)拍摄, 选用332 nm光源激发, 发射光区间位于460~490 nm.

  
  
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  图 1  聚合物TPE-g-PDEAEAM的合成路线

  Figure 1  Synthetic route of the polymer TPE-g-PDEAEAM

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  图 2  (a) 浓度为2 mg/mL的流体动力学尺寸(插图:激光照射下TPE-g-PDEAEAM水溶液的丁铎尔效应照片, (b) TPE-g-PDEAEAM的SEM图像

  Figure 2  (a) Hydrodynamic size with concentration of 2 mg/mL. Inset: Photograph of TPE-g-PDEAEAM solutions in water under irradiation of laser point. (b) SEM image of TPE-g-PDEAEAM polymer dots

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  图 3  (a) 不同浓度的TPE-g-PDEAEAM溶液的荧光光谱(激发波长为337 nm). (b)不同浓度的TPE-g-PDEAEAM溶液的荧光强度的相对变化及在紫外灯照射下(365 nm)的数码相片

  Figure 3  (a) Fluorescence spectra of aqueous solutions of TPE-g-PDEAEAM at different concentrations (ex=337 nm). (b) Relative changes in fluorescence intensity of different concentrations of TPE-g-PDEAEAM aqueous solution and digital photographs under UV light (365 nm)

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  图 4  (a) 在水/THF混合溶剂中TPE-g-PDEAEAM溶液的荧光光谱(激发波长为337 nm). (b) TPE-g-PDEAEAM在水/THF混合溶剂荧光强度的相对变化及其在紫外灯下(365 nm)的数码相片

  Figure 4  (a) Fluorescence spectra of TPE-g-PDEAEAM in a mixed solvent of water and THF (λ_ex=337 nm). (b) The relative change in fluorescence intensity of TPE-g-PDEAEAMTPE in a water/THF mixed solvent and its digital photograph under UV light (365 nm)

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  图 5  TPE-g-PDEAEAM在浓度为2 g/L的变温紫外.插图: TPE-PDEAEAM溶液在25 ℃(左)和66 ℃(右)下在可见光的照片

  Figure 5  TPE-g-PDEAEAM polymer quantum dots in a variable temperature ultraviolet (UV) concentration of 2 g/L. Inset: Photograph of visible light in TPE-PDEAEAM solution at 25 ℃ (left) and 65 ℃ (right)

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  图 6  (a) TPE-g-PDEAEAM在温度从20 ℃升高到66 ℃的水溶液中的荧光光谱. [TPE-g-PDEAEAM]=2.0 g/L. λ_ex=337 nm.插图: TPE-g-PDEAEAM溶液在25 ℃(左)和65 ℃(右)下在可见光和紫外灯下的照片. (b)不同温度下TPE-g-PDEAEAM溶液中的相对荧光强度(I/I₀)的变化

  Figure 6  (a) Fluorescent spectra of the TPE-g-PDEAEAM in aqueous solution with temperature increasing from 20 to 66 ℃. [TPE-g-PDEAEAM]=2.0 g/L. λ_ex=337 nm. Inset: Photo of TPE-g-PDEAEAM solution under 25 ℃ (left) and 65 ℃ (right) under visible and UV light. (b) Change of relative fluorescent intensity (I/I₀) of TPE-g-PDEAEAM in aqueous solution under different temperature

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  图 7  (a) TPE-g-PDEAEAM在不同pH溶液中的荧光光谱. (b)不同pH下TPE-g-PDEAEAM溶液中的相对荧光强度(I/I₀)的变化. [TPE-g-PDEAEAM]=2.0 g/L

  Figure 7  (a) Fluorescent spectra of the TPE-g-PDEAEAM in different pH solution. (b) Change of relative fluorescent intensity (I/I₀) of TPE-g-PDEAEAM in aqueous solution under different pH. [TPE-g-PDEAEAM]=2.0 g/L

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  图 8  (a) TPE-g-PDEAEAM在不同的CO₂体积溶液的荧光光谱.插图:通入二氧化碳前后在紫外灯下(365 nm) 2 mg/mL的TPE-g- PDEAEAM水溶液的数码相片. (b)相对荧光强度的线性(I/I₀)与CO₂体积的关系

  Figure 8  (a) Fluorescence spectra of TPE-g-PDEAEAM in different CO₂ volume solutions. Inset: Digital photo of a 2 mg/mL TPE-g- PDEAEAM aqueous solution under UV light (365 nm) before and after carbon dioxide. (b) The relationship between the linearity of relative fluorescence intensity (I/I₀) and the volume of CO₂

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  图 9  (a) 用不同浓度的TPE-g-PDEAEAM处理48 h后HeLa细胞毒性测试; (b) TPE-g-PDEAEAM染色HeLa细胞不同代数的共聚焦显微镜图像, 比例尺是25 μm

  Figure 9  (a) Cell viabilities of HeLa cells treated with different concentrations of TPE-g-PDEAEAM for 48 h by MTT assay. (b) Confocal microscopy images of HeLa cells TPE-g-PDEAEAM staining (100 μg/mL) in different algebras. The scale bar is 25 μm

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