English

• 1.   引言

  前列腺癌是男性中最常见的恶性肿瘤之一^{[1, 2]}.近年来, 我国前列腺癌的总体发病率呈上升趋势.血清前列腺特异性抗原的测定在前列腺癌的普查、早期诊断和病情预测中意义重大, 已被广泛应用于临床, 成为我国前列腺癌诊疗指南中首选的检测项目.前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)是一种前列腺细胞膜上的Ⅱ型跨膜糖蛋白, 由750个氨基酸残基组成, 相对分子质量为100000, 是一种较前列腺特异性抗原更加敏感、特异的前列腺癌肿瘤标记物, 已成为前列腺癌研究中的热点之一^[3~6]. PSMA在前列腺癌的早期诊断、基因治疗、预后评估中所起的作用变得越来越重要.

  据文献报导, PSMA可以水解N-乙酰天冬氨酰谷氨酸, 生成谷氨酸盐和N-乙酰天冬氨酸^[7].根据此原理建立的检测PSMA的方法主要有高效液相色谱法^[8].该方法灵敏度高, 但也具有前处理繁琐、费时等缺点.因此, 发展简单、灵敏的检测PSMA的方法非常重要.

  纳米材料具有小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应及表面与界面效应等特点, 目前已广泛用于各个领域, 如细胞荧光成像、分析检测、药物释放及治疗等^[9~17].其中金纳米颗粒由于制备简单、稳定性高以及光电性质独特等方面的优点使得它在生物传感和医学诊断方面得到了广泛的应用.特别是金纳米颗粒溶液的颜色会根据聚集状态不同而发生变化^{[18, 19]}, 它的这种性质已用于蛋白质^[20]以及离子^[21~23]等物质的分析检测.此外, 金纳米颗粒具有高的摩尔吸光系数、较好的水溶性和稳定性, 是设计比色分析方法的良好平台.基于金纳米颗粒的优良性质, 在本论文中, 我们设计了金纳米颗粒的比色传感体系, 并用于前列腺特异性膜抗原的检测.

  2.   结果与讨论

  2.1   检测原理

  根据文献[24], PSMA可以水解γ-谷氨酸肽段, 因此, 设计了六个γ-谷氨酸的多肽(Glu₆)作为PSMA的底物.段肽Glu₆的pI约为3.46(通过ProtParam软件计算得到^[25]), 在pH 7.4的溶液中, Glu₆带负电荷.测定了三甲基十六烷基溴化铵稳定的金纳米颗粒[简记为(+)AuNPs]在pH 7.4的溶液中Zeta电位为+32.8 mV^[26]. Glu₆和(+)AuNPs之间存在强烈的静电作用.这种作用致使金纳米颗粒产生聚集.当该体系中加入PSMA后, PSMA可以水解肽段Glu₆, 使之断裂为谷氨酸分子; 谷氨酸分子与(+)AuNPs之间的静电作用比较弱, 导致聚集的金纳米颗粒分散, 体系的颜色发生变化.据此设计基于金纳米颗粒的比色传感体系, 并用于PSMA的检测.

  2.2   实验条件的优化

  图 1考察了加入肽段Glu₆对(+)AuNPs的紫外-可见吸收光谱的影响.从图中可以看出, 在(+)AuNPs中加入肽段Glu₆后, (+)AuNPs的紫外-可见吸收有很明显的变化, A₅₂₀处吸光度值下降, A₆₇₀处吸光度值增加, 体系的颜色有很显著的变化.这表明Glu₆与(+)AuNPs之间有强烈的相互作用, 可导致(+)AuNPs发生聚集.还详细考察了肽段Glu₆浓度的变化对吸光度比值A₆₇₀/A₅₂₀的影响(图S1, 支持信息).随着肽段Glu₆的浓度增加, A₆₇₀/A₅₂₀的比值逐渐增大.当Glu₆的浓度为0~8 μmol/L时, 二者有很好的线性关系.作为对照实验, 考察了带有正电荷的肽段NH₂-KKHHHHHHKK-CONH₂(在pH＝7.4, 通过ProtParam软件计算得到pI为10.48)对(+)AuNPs紫外-可见光谱的影响, 结果表明, 该肽段不能使(+)AuNPs发生聚集(图S2, 支持信息), 进一步支持了(+)AuNPs与肽段Glu₆之间的静电作用使(+)AuNPs发生聚集.在本实验中, 选择肽段Glu₆的浓度为6 μmol/L作为最佳反应浓度, 因为该浓度的肽段Glu₆已产生明显的颜色变化(图 1); (+)AuNPs的浓度为4.2 nmol/L, 体系的反应介质为pH 7.4的PBS.

  图 1

  

  图 1.  (+)金纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱图. (a)金纳米颗粒(4.2 nmol/L); (b)金纳米颗粒(4.2 nmol/L)+Glu₆ (6.0 μmol/L)

  Figure 1.  Absorption spectra and color changes of (+)AuNPs solution (4.2 nmol/L) in the absence (a) and presence (b) of Glu₆ peptide (6.0 μmol/L)

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  2.3   比色响应和选择性研究

  在上述确定的实验条件下, 研究了反应体系对PSMA的比色响应.如图 2所示, 随着加入PSMA浓度的增加, 体系的紫外-可见吸收光谱发生明显的变化: 670 nm处的吸收逐渐降低, 而520 nm处的吸收逐渐增加.这说明金纳米颗粒从聚集状态逐渐处于分散状态.这是由于PSMA能够与肽段Glu₆发生特异性的反应, 使肽段Glu₆水解, 水解后的谷氨酸分子不能够使(+)AuNPs聚集, 因此聚集的(+)AuNPs分散开来, 引起紫外-可见光谱的变化.根据图 2, 得到检测PSMA的线性方程为ΔA₆₇₀/A₅₂₀＝0.11+0.06 [PSMA] (nmol/L) (γ＝0.97), 线性范围为2~10 nmol/L.检测限(3 S/m, S是试剂空白的标准偏差, n＝11, m是线性方程中的斜率)为0.5 nmol/L^{[25, 27]}.

  图 2

  

  图 2.  (+)金纳米-Glu₆体系对PSMA响应的紫外-可见吸收光谱图(PSMA的浓度从a~e依次为0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 nmol/L)

  Figure 2.  Absorption spectra of the (+)AuNPs-Glu₆ complex in the presence of various concentrations of PSMA (0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 nmol/L for curves a~e)

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  为评价该体系对PSMA的选择性, 测试了其它蛋白质对体系的影响.所测试的物质包括羧酸酯酶、硝基还原酶和BSA.如图 3所示, 只有PSMA能对吸光度A₆₇₀/A₅₂₀比值产生明显的变化, 而其它蛋白质对体系的吸光度A₆₇₀/A₅₂₀比值不产生明显影响.该实验结果表明, 体系对PSMA具有高选择性, 这是由于PSMA对底物肽段的特异水解作用所致.即PSMA与肽段Glu₆反应, 使之水解, 使聚集的金纳米颗粒分散开来, 从而呈现酒红色, 而其他蛋白质不与肽段Glu₆发生反应(颜色变化见图S3, 支持信息).

  图 3

  

  图 3.  (+)金纳米-Glu₆体系的选择性. (1)羧酸脂酶(0.25 U/mL), (2)硝基还原酶(0.5 mg/mL), (3) BSA (100 μmol/L), (4) PSMA (6.0 nmol/L), 反应温度在37 ℃, 反应时间为15 min

  Figure 3.  Absorbance ratios (at A₆₇₀/A₅₂₀ nm) of the (+)AuNPs-Glu₆ system in the absence (control) and presence of different proteins: (1) carboxylesterase (0.25 U/mL), (2) nitroreductase (0.5 mg/mL), (3) BSA (100 μmol/L) and (4) PSMA (6.0 nmol/L). The reaction was carried out for 15 min at 37 ℃, and the results are the mean±standard deviation of three separate measurements

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  2.4   酶动力学实验

  考察了传感体系与不同浓度PSMA反应的动力学曲线.如图 4所示, PSMA浓度越高, 体系的A₆₇₀/A₅₂₀的值越小, 体系反应速率越快, 15 min左右反应达到平台.因此, 选择15 min作为最佳反应时间.

  图 4

  

  图 4.  (+)金纳米-Glu₆体系对不同浓度的PSMA的A₆₇₀/A₅₂₀响应随时间的变化(PSMA的浓度依次为0.0, 2.0, 4.0, 6.0和8.0 nmol/L)

  Figure 4.  Variation of A₆₇₀/A₅₂₀ versus the reaction time for the (+)AuNPs solution containing Glu₆ with different concentrations of PSMA (0.0, 2.0, 4.0, 6.0, and 8.0 nmol/L)

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  2.5   抑制剂实验

  为了进一步确认传感体系吸收光谱的变化来自PSMA的作用, 研究了重金属离子Hg²⁺做为抑制剂对该酶活性的影响.首先, PSMA与Hg²⁺在37 ℃下孵育半个小时, 然后加入到传感体系中.由图 5可知, 含Hg²⁺的反应体系其吸收光谱发生了明显的变化(曲线c和d), 这表明PSMA的活性可受到Hg²⁺的抑制, 从而支持了是PSMA的作用导致体系颜色的改变(图S4, 支持信息).

  图 5

  

  图 5.  (+)金纳米-Glu₆体系对不同物质响应的紫外-可见吸收光谱图. (a) (+)AuNPs (4.2 nmol/L); (b) (+)AuNPs (4.2 nmol/L)+Glu₆ (6 mmol/L); (c)体系(b)+PSMA (6 nmol/L); (d)体系(c)+1 μmol/L Hg²⁺

  Figure 5.  Absorption spectra of different reaction systems. (a) (+)AuNPs only; (b) (+)AuNPs-Glu₆ complex; (c) system (b)+PSMA (6 nmol/L); (d) system (c)+1 μmol/L Hg²⁺

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  2.6   实际样品的测定

  根据文献[28]报道, 前列腺癌病人尿液中PSMA水平明显升高, 浓度高达3.5 nmol/L, 而正常人尿液PSMA浓度低于0.25 nmol/L, 测定尿液中的PSMA值具有非常重要的临床意义.另外, 尿液容易得到.因此, 我们的体系有望用于尿液中PSMA的测定.

  为了展示我们建立的传感体系检测PSMA的实际价值, 我们选择尿液作为样品.首先考察了尿液中潜在干扰物的影响, 从图 6可以看出尿素、尿酸、CaCl₂、MgCl₂、L-组氨酸、甘氨酸和草酸对尿液PSMA的测定影响很小.接着我们通过标准加入法, 测定了实际样品中PSMA的含量. 表 1可以看出, 当PSMA浓度很低时, 测量的回收率仍然取得了满意效果.这说明我们建立的传感体系能够用于尿液中PSMA的分析.

  图 6

  

  图 6.  (+)金纳米-Glu₆体系的选择性. (1)尿素(20 mmol/L), (2)尿酸(0.3 mmol/L), (3) CaCl₂ (0.5 mmol/L), (4) MgCl₂ (0.5 mmol/L), (5) L-组氨酸(0.1 mmol/L), (6)甘氨酸(0.2 mmol/L), (7)草酸(0.05 mmol/L), (8) PSMA (6.0 nmol/L), 反应温度在37 ℃, 反应时间为15 min

  Figure 6.  Absorbance ratios (at A₆₇₀/A₅₂₀ nm) of the (+)AuNPs-Glu₆ system in the absence (control) and presence of various substance: (1) urea (20 mmol/L), (2) uric acid (0.3 mmol/L), (3) CaCl₂ (0.5 mmol/L), (4) MgCl₂ (0.5 mmol/L), (5) L-histidine (0.1 mmol/L), (6) glycine (0.2 mmol/L), (7) oxalic acid (0.05 mmol/L), (8) PSMA (6 nmol/L). The reaction was carried out for 15 min at 37 ℃, and the results are the mean ± standard deviation of three separate measurements

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  表 1

  

  表 1  尿液中PSMA加标回收检测结果

  Table 1.  Determination of PSMA spiked into urine samples

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  样品	PSMA added/ (nmol•L－1)	PSMA founda/ (nmol•L－1)	Recoverya/%
  A (control)	0	< 0.5 (detection limit)	—
  B	1.0	1.06±0.08	106±8.0
  C	2.0	2.04±0.13	102±6.5
  D	3.0	3.09±0.21	103±7.0
  a三次测定的平均值±标准偏差.

  3.   结论

  本实验发展了一种简单、快速的检测前列腺特异性膜抗原的比色传感体系.该方法基于带正电荷的金纳米颗粒能与带有负电荷的底物肽段之间发生静电相互作用, 利用PSMA与肽段的特异性反应, 导致了金纳米颗粒聚集状态的改变, 从而发生颜色的变化.此外, 我们也证实了该体系可用于实际样品中PSMA的测定.这为前列腺癌病人的早期诊断和监测癌症病人的PSMA水平提供了一条可能的选择.

  4.   实验部分

  4.1   仪器与试剂

  紫外-见吸收光谱仪: TU-1900型紫外可见吸收光谱仪(普析通用, 北京, 中国), 1-cm石英比色皿; pH计: Delta 320型pH计(Mettler Toledo, Switzerland); Milli- Reference超纯水净化系统(Millipore, USA); 摇床: SKY-100C (Shanghai Sukun industry & commerce Co., Ltd); Zeta电位测定仪: ZEN 3600 (Malvern, England).

  HAuCl₄, 分析纯, Acros; 三甲基十六烷基溴化铵(CTAB), 分析纯, J & K Chemical; NaBH₄, 分析纯, Sigma; PSMA, Sino Biological Inc.; 牛血清白蛋白(BSA), 分析纯, Sigma; 多肽NH₂-KKHHHHHHKK-CONH₂, 北京赛百盛基因技术有限公司; 多肽γ-Glu-γ-Glu-γ-Glu- γ-Glu-γ-Glu-γ-Glu (Glu₆), 北京赛百盛基因技术有限公司; 羧酸酯酶, 分析纯, Sigma-Aldrich; 硝基还原酶, 分析纯, Sigma-Aldrich; Na₂HPO₄•12H₂O, 分析纯, 北京化工厂; KH₂PO₄, 分析纯, 北京化工厂; HCl, 分析纯, 北京化学试剂公司; HNO₃, 分析纯, 北京化学试剂公司; EDTA钠盐, 分析纯, 北京化学试剂公司; CaCl₂, 分析纯, 北京化工厂; MgCl₂, 分析纯, 北京化学试剂公司; 草酸, 分析纯, 北京化学试剂公司; 尿素, 分析纯, 百灵威试剂公司; 尿酸, 分析纯, 百灵威试剂公司; L-组氨酸, 百灵威试剂公司; 甘氨酸, 百灵威试剂公司.

  实验中使用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液(PBS: 2 mmol/L, pH 7.4).将10 μg PSMA(冻干粉末)溶于1 mL PBS中, 此时浓度为100 nmol/L.把酶溶液分装, 保存在－70 ℃, 以确保酶的活性不受影响.实验中所用的烧瓶用王水清洗干净.收集健康男性的晨尿, 以备实验所用.实验中使用的水为Milli-Q超纯水(电导率超过18 MΩ•cm); 所用的其它试剂均为分析纯.

  4.2   金纳米颗粒的制备

  金纳米颗粒的制备按照文献[26]合成.具体步骤为:取2 mL 10 mmol/L的CTAB溶液加入到15 mL 1.0 mmol/L HAuCl₄溶液中, 在室温搅拌15 min; 然后, 边搅拌边滴加2 mL 100 mmol/L NaBH₄溶液, 继续搅拌直至溶液颜色变为酒红色.放入冰箱备用.其浓度根据金纳米颗粒在520 nm处的摩尔吸光系数(2.7×10⁸ L• mol^－1•cm^－1)^[29]计算为10.5 nmol/L.

  4.3   比色传感体系的制备

  肽段Glu₆储备液的制备:称取1 mg的肽段Glu₆粉末于离心管中, 溶于1 mL PBS缓冲液(2 mmol/L, pH 7.4), 超声1 min, 得到储备液浓度为1 mmol/L.将溶液保存于4~8 ℃.

  除非特别说明, 金纳米颗粒-Glu₆比色传感体系的制备按照以下步骤进行:取400 μL的金纳米颗粒(浓度为10.5 nmol/L)和6 μL的肽段Glu₆(储备液浓度为1 mmol/L)于2 mL的离心管, 然后加入PBS缓冲液(2 mmol/L, pH 7.4), 定容为1 mL, 混合均匀.

  4.4   检测前列腺特异性膜抗原的实验步骤

  除非特别说明, 所有的操作均按照以下步骤进行.在2 mL的离心管里加入0.5 mL PBS缓冲液(2.0 mmol/L, pH 7.4)以及200 μL的金纳米颗粒储备溶液, 混合均匀后加入所需的酶溶液.整个溶液体系最终用PBS定容为1 mL, 混合均匀.在37 ℃反应15 min后, 全部反应溶液被转移到1 cm光程的石英样品池, 在TU-1900型紫外可见吸收光谱仪上测量吸收光谱.

  4.5   尿液样品的处理和分析

  室温下, 收集的尿液14000 r/min离心5 min, 然后取上层清液备用.为了避免尿液中可能存在的干扰离子, 加入EDTA(最终浓度为0.1 mmol/L)络合金属离子, 以除去离子的干扰.最后于尿液样品中添加不同体积的PSMA, 用于样品的检测.其中不加PSMA的尿液作为空白对照实验.

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  图 1  (+)金纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱图. (a)金纳米颗粒(4.2 nmol/L); (b)金纳米颗粒(4.2 nmol/L)+Glu₆ (6.0 μmol/L)

  Figure 1  Absorption spectra and color changes of (+)AuNPs solution (4.2 nmol/L) in the absence (a) and presence (b) of Glu₆ peptide (6.0 μmol/L)

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  图 2  (+)金纳米-Glu₆体系对PSMA响应的紫外-可见吸收光谱图(PSMA的浓度从a~e依次为0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 nmol/L)

  Figure 2  Absorption spectra of the (+)AuNPs-Glu₆ complex in the presence of various concentrations of PSMA (0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 nmol/L for curves a~e)

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  图 3  (+)金纳米-Glu₆体系的选择性. (1)羧酸脂酶(0.25 U/mL), (2)硝基还原酶(0.5 mg/mL), (3) BSA (100 μmol/L), (4) PSMA (6.0 nmol/L), 反应温度在37 ℃, 反应时间为15 min

  Figure 3  Absorbance ratios (at A₆₇₀/A₅₂₀ nm) of the (+)AuNPs-Glu₆ system in the absence (control) and presence of different proteins: (1) carboxylesterase (0.25 U/mL), (2) nitroreductase (0.5 mg/mL), (3) BSA (100 μmol/L) and (4) PSMA (6.0 nmol/L). The reaction was carried out for 15 min at 37 ℃, and the results are the mean±standard deviation of three separate measurements

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  图 4  (+)金纳米-Glu₆体系对不同浓度的PSMA的A₆₇₀/A₅₂₀响应随时间的变化(PSMA的浓度依次为0.0, 2.0, 4.0, 6.0和8.0 nmol/L)

  Figure 4  Variation of A₆₇₀/A₅₂₀ versus the reaction time for the (+)AuNPs solution containing Glu₆ with different concentrations of PSMA (0.0, 2.0, 4.0, 6.0, and 8.0 nmol/L)

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  图 5  (+)金纳米-Glu₆体系对不同物质响应的紫外-可见吸收光谱图. (a) (+)AuNPs (4.2 nmol/L); (b) (+)AuNPs (4.2 nmol/L)+Glu₆ (6 mmol/L); (c)体系(b)+PSMA (6 nmol/L); (d)体系(c)+1 μmol/L Hg²⁺

  Figure 5  Absorption spectra of different reaction systems. (a) (+)AuNPs only; (b) (+)AuNPs-Glu₆ complex; (c) system (b)+PSMA (6 nmol/L); (d) system (c)+1 μmol/L Hg²⁺

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  图 6  (+)金纳米-Glu₆体系的选择性. (1)尿素(20 mmol/L), (2)尿酸(0.3 mmol/L), (3) CaCl₂ (0.5 mmol/L), (4) MgCl₂ (0.5 mmol/L), (5) L-组氨酸(0.1 mmol/L), (6)甘氨酸(0.2 mmol/L), (7)草酸(0.05 mmol/L), (8) PSMA (6.0 nmol/L), 反应温度在37 ℃, 反应时间为15 min

  Figure 6  Absorbance ratios (at A₆₇₀/A₅₂₀ nm) of the (+)AuNPs-Glu₆ system in the absence (control) and presence of various substance: (1) urea (20 mmol/L), (2) uric acid (0.3 mmol/L), (3) CaCl₂ (0.5 mmol/L), (4) MgCl₂ (0.5 mmol/L), (5) L-histidine (0.1 mmol/L), (6) glycine (0.2 mmol/L), (7) oxalic acid (0.05 mmol/L), (8) PSMA (6 nmol/L). The reaction was carried out for 15 min at 37 ℃, and the results are the mean ± standard deviation of three separate measurements

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  表 1  尿液中PSMA加标回收检测结果

  Table 1.  Determination of PSMA spiked into urine samples

  样品	PSMA added/ (nmol•L－1)	PSMA founda/ (nmol•L－1)	Recoverya/%
  A (control)	0	< 0.5 (detection limit)	—
  B	1.0	1.06±0.08	106±8.0
  C	2.0	2.04±0.13	102±6.5
  D	3.0	3.09±0.21	103±7.0
  a三次测定的平均值±标准偏差.

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