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口腔癌相关唾液肿瘤生物标志物的分析检测研究进展

金鑫 ,  王晓英

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引用本文: 金鑫, 王晓英. 口腔癌相关唾液肿瘤生物标志物的分析检测研究进展[J]. 化学学报, 2019, 77(4): 340-350. doi: 10.6023/A18100414 shu
Citation:  Jin Xin, Wang XiaoYing. Progress in Analysis and Detection of Salivary Tumor Biomarkers Associated with Oral Cancer[J]. Acta Chimica Sinica, 2019, 77(4): 340-350. doi: 10.6023/A18100414 shu

口腔癌相关唾液肿瘤生物标志物的分析检测研究进展

  • 东南大学公共卫生学院 环境医学工程教育部重点实验室 南京 210009

    • 作者简介: 金鑫, 东南大学公共卫生学院2017级在读硕士, 研究方向为肿瘤相关标志物纳米电化学分析检测研究;
    王晓英, 理学博士, 东南大学公共卫生学院副教授, 硕士生导师.主要从事肿瘤相关标志物的生物传感与风险评估, 食品安全、环境污染相关的纳米电化学分析检测研究;
    通讯作者: 王晓英, E-mail: wxy@seu.edu.cn
  • 基金项目:

    项目受国家自然科学基金(Nos.81600179, 81302472)和江苏高校“青蓝工程”资助

摘要: 口腔癌系头颈部癌，癌组织均位于口腔内，其非侵入性早期诊断是减少该病死亡的有效手段.唾液系口腔癌变相关物质首先释放进入的体液，取材方便，安全无创，是口腔癌普查筛选、早期诊断的首选指标.本文对唾液肿瘤生物标志物的种类、目前国内外常用的检测方法进行概述，重点阐述新型电化学生物传感方法在口腔癌相关唾液肿瘤生物标志物检测方面的相关应用及其最新研究进展.并对口腔癌相关唾液肿瘤生物标志物电化学传感技术的未来发展方向提出展望，拟为其深入研究与应用提供参考.

English

  • 1.   引言

    口腔癌(oral cancer)系发生在口腔颌面部的恶性肿瘤总称.临床实践中按其部位可分为牙龈、舌、腭、口底、口咽、涎腺、唇癌及发生于颜面部皮肤黏膜的癌症这八类, 约90%的口腔癌属于上皮源性的鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)[1].对于OSCC的临床诊断, 常规的方法有临床观察、染色检查、组织学和细胞学检查[2].虽然临床观察简便实用, 医生可通过简单的视、扪诊来检查口腔黏膜有无病变, 但仅靠肉眼观察较难作出准确判断.染色检查是一种无创、能方便检测口腔癌前病变高危性的辅助方法, 但染色结果的准确性依赖于良好的染色技术和高分辨率显微镜, 这对医生的要求较高, 也增加了检测成本.组织学检查虽可作为OSCC癌前病变和确诊的依据, 但须取得组织标本进行活检.活检系有创检查, 依从性较差, 术后的瘢痕亦会影响观察.此外, 细胞学检查是不愿意接受活检病人的一种较好的选择.但上皮深层细胞不易取到, 检测的准确性较低.常规的诊断方法均针对肿瘤生长到一定程度, 具有临床症状时才有实际意义.但OSCC的潜伏期较长, 其早期症状与口腔炎、口腔溃疡相似, 不易被发现; 临床确诊后约三分之二的患者已进入中晚期, 生存率较差[3].随着免疫学、分子生物学的快速发展, 人们对OSCC的发病机制有了更深入的认识, 已经发现多种与OSCC细胞产生、增殖、凋亡等一系列过程相关的重要的生物标志物(tumor biomarker, TM)[4].其可存在于肿瘤细胞和组织中, 也可进入体液中, 反映OSCC发生发展过程中的分子及遗传学改变, 是衡量疾病存在状况和严重程度的可测指标, 其为OSCC的早诊早治提供了新手段.

    随着TM检测手段的不断进步, TM检测的中介物范围亦不断扩大, 除了常规的血清, 其它的体液也逐渐被用于临床辅助诊断, 如唾液、尿液、支气管灌洗液、胸腔积液、腹水、乳头溢液、精液等.由于唾液中含有口腔组织细胞及其代谢或分泌产物, 当口腔黏膜组织发生癌变时, 肿瘤细胞合成和分泌的物质首先释放到病变的局部体液中, 后才经血液或淋巴液回流进入血循环.因此, 检测唾液中口腔癌相关TM含量比检测血清更加敏感.唾液又因取材方便、安全无创伤且可方便地用于大规模的普查筛选, 已然成为早发现、早诊断口腔癌的首选指标.

    2.   唾液肿瘤生物标志物的分类

    唾液是口腔内存在的一种无色且稀薄的液体, 由腮腺、颌下腺、舌下腺及许多小黏液腺分泌.健康的成年受试者每天可产生500~1500 mL的唾液, 一些生理和病理条件可改变唾液的产生和组成[5].例如味觉刺激、病毒感染、炎症和患有口腔癌.酸性食物刺激会增加唾液的流速和流量[6].病毒感染常引发口腔内部炎症, 这些炎症将会进一步恶化成口腔癌, 其伴随着唾液中生物标志物的种类、状态的改变.如在受人类巨细胞病毒感染后引发的慢性牙周炎过程中[7], 炎症细胞因子白细胞介素-1(IL-1), IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度升高, 且这些细胞因子在口腔局部产生高度组织化的炎症反应[8].炎症反应进一步恶化过程中, 口腔中的微生物及其产物会激活成纤维细胞和免疫细胞, 产生活性氧, 从而在上皮细胞中引发DNA损伤[9].研究表明从口腔内的病毒感染到口腔癌的发生是一个动态变化过程, 期间唾液中生物标志物会发生系列改变.

    口腔内环境的变化引起标志物改变的机制尚未明确, 但口腔唾液内含多种生物分子, 其与口腔癌的发生发展及治疗预后有着密切的诱因关系[10].常见的口腔癌相关唾液生物标志物主要有基因组、转录组、蛋白质组和微生物组[11](见表 1).

    表 1

    表 1  口腔癌相关唾液肿瘤生物标志物分类
    Table 1.  Classification of salivary tumor biomarkers associated with oral cancer
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    Group Category Representative Biomarkers
    Genome Promoter methylation DAPK, DCC, MINT-31, TIMP-31, TIMP-3, CdkN2A/p16, MGMT, CCNA1, ZNF14, ZNF160, ZNF420, EDNRB
    Loss of heterozygosity TSP53, D3S1234, D9S156, D17S799, chromosomes 3p, 17p, 9q, 13q
    Gene mutation FBXW7, HOXA9, HRAS, NRAS, PIK3CA, TSP53
    Gene amplification Cyclin D1
    Others phosphorylated-Src, Maspin, ORAOV1
    Transcriptome mRNA DUSP1, IL-8, IL-1β, H3F3A, S100P, SAT
    ncRNA miR:125a, 200a, 31, 10b, 144, 21, 451, 486-5p, 634
    Protein Interleukins IL-8, IL-6, IL-1β
    Antigen & Antibody TPA, CEA, SCC-Ag2, CA125, CA128, CA15-3, TSP53
    Enzymes OAZ-1, DUSP1, LDH, CAT, AAT, MMP-2, MMP-11, OGG1, α-amylase, telomerase
    Enzyme inhibitors SA-1, SLPI, cystatin A
    Conjugated proteins CD44, CD59, Cyfra21-1, Cyfra 19, Cyfra36, S-lgA, M2BP, Actin, MRP14, ZNF510, profilin, Thioredoxin, HAP, Transferrin, Myosin, S100A2, AFP
    Others Defensins-1, TNF-α, EGFR
    Microbiota Candida Candida albicans
    Bacillus P.gingivalis, P.melaninogenica, Tannerella forsythia
    Streptococcus Streptococcus mitis, Streptococcus mutans

    基因组:基因组的不稳定性如启动子甲基化、杂合性丢失、肿瘤相关基因的突变、基因扩增等是癌症发生发展的主要原因.其中, 基因的异常甲基化(如启动子超甲基化)在OSCC中较常见.如Rosas等[12]证实CdkN2A/p16、MGMT或DAP-K基因中至少一种可在OSCC中发生异常甲基化.杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)系某一特殊基因正常的两个成对等位基因出现不同的基因组变化, 可作为癌前病变恶性转化的早期预测指标[13].研究表明, 染色体3p、9q、13q和17p中的LOH是口腔癌发生的早期征兆[14].同样, 基因突变存在于肿瘤发生的各个阶段, 可涉及不同染色体上多种基因的变化. Wang等[15]研究发现在OSCC患者中, 多种唾液基因组生物标志物(TSP53、PIK3CA、CdkN2A/p16、FBXW7、HRAS和NRAS)会发生突变.此外, Cyclin D1是细胞周期调控的重要调节因子, Cyclin D1基因扩增与OSCC不良预后相关[16].

    转录组:唾液中含有口腔局部组织的RNA, 因此唾液转录组诊断亦是一种新颖的临床方法.转录组由在特定发育阶段或生理条件下存在于细胞中的所有编码和非编码RNA组成.而非编码RNA可进一步细分为微RNA(microRNA)和长非编码RNA.在编码的RNA中, 李等[17]发现OSCC患者唾液中IL-8、H3F3A、IL-1β、S100钙结合蛋白P(S100P)、双特异性磷酸酶1(DUSP1)和亚精胺N1-乙酰转移酶(SAT)的mRNA显著升高.对于非编码的RNA, Park等[18]发现在唾液microRNA中miR-125a和miR-200a与口腔癌密切相关.

    蛋白质组:蛋白质在唾液组成中所占的比例较高.唾液在口腔中经唾液腺不断分泌、更新, 口腔黏膜细胞、唾液腺和口腔微生物的变化都可通过唾液蛋白质分析检测到.唾液含有2000多种蛋白质, 可将其主要分为白介素、抗原和抗体、酶、酶抑制剂和结合蛋白等这几大类. John等[19]通过检测32名无疾病受试者和19名口腔癌患者发现白介素中的IL-6和IL-8在口腔癌患者中的含量较正常人显著增高.抗原、抗体类的标志物有鳞状细胞癌相关抗原(SCC)、癌胚抗原(CEA)和组织多肽性抗原(TPS)等. Nagler等[20]在14名癌症患者和16名健康对照中分析检测获得患者唾液中SCC、CEA、TPS的含量显著增加, 可用作OSCC诊断工具.近些年, 唾液中的部分酶和酶抑制剂也逐渐受到重视, 如8-羟基鸟嘌呤糖基化酶(OGG1)[21]和截短型半胱氨酸蛋白酶抑制剂(SA-1)[22]可作为口腔癌的相关标志物来进行检测.此外, 结合蛋白类的标志物如CD44[23]、细胞角蛋白21-1(Cyfra21-1)[24]、肌动蛋白及肌球蛋白[25]等对口腔癌的诊断亦具有一定的参考价值.

    微生物组:饮食、药物、习惯和宿主免疫状态的某些改变可能导致口腔微生物群的过度生长, 从而使该部位易于发病.常见的口腔致病菌按其形状可分为念珠菌、杆菌和链球菌. Lim等[26]研究口腔微生物在肿瘤患者和健康受试者唾液中的流行情况, 发现变异链球菌、有核梭杆菌和白色念珠菌最为常见, 且可作为标志物来检测口腔癌.

    此外, 唾液中相对分子质量较小的代谢物也能间接反映口腔癌相关基因和蛋白质的表达.如Sugimoto等[27]在牙周病患者唾液中发现27种标志性的代谢物, 在口腔癌患者唾液中发现了28种标志性的代谢物, 其中聚胺、鸟氨酸和腐胺的水平明显升高; 而胆碱、甜菜碱、哌啶酸和左旋肉碱在浓度上与健康人有显著的差异.

    上述肿瘤生物标志物的获得与唾液的前处理密切相关, 需较为规范的采集、处理和储存方法.唾液采集应考虑受试者、收集部位及方式[28].一般在早晨无任何进食、饮水和口腔卫生清洁行为前采集唾液[29], 采集的部位包括唾液腺、龈沟液和粘膜渗出物[30], 有自然流取法、吐取法、棉柱法、吸引法等采集方法[31].唾液处理多采用离心分离, 但处理时的离心力、温度和时间对目标物的纯度有一定程度的影响; 且上述简单的处理只能获得多种肿瘤生物标志物的混合物, 无法获得单一标志物, 使后续的鉴定、检测难度较大.一些唾液生物标志物的半衰期非常短, 处理好的唾液样本可采用液氮冷藏或添加酶抑制剂, 延长保存时间.

    近年来, 大量唾液肿瘤生物标志物被人们所发现, 关于其分析检测方法研究也取得了诸多进展.以下就目前国内外唾液肿瘤标志物现存常用检测方法进行概述和比较.

    3.   唾液肿瘤生物标志物常用检测方法

    尽管唾液具有自身优势, 但其实际使用中也存在着很大的挑战.唾液样品中肿瘤生物标志物的表达浓度比血液低几个数量级, 较难区分背景和目标特异性信号.分析唾液肿瘤生物标志物时, 常规方法多采用灵敏度和特异性这两个指标来衡量检测效果, 因此提供较高灵敏度和特异性的方法是至关重要的.根据唾液肿瘤生物标志物种类的不同, 有如下的几种常规检测方法, 其中对于蛋白质组的检测方法种类较多, 其他三组标志物的常规检测方法相对较少.

    3.1   基因组的检测

    基因组检测的常规方法有基因测序和PCR分析.基因测序能分析测定基因全序列; PCR则是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术. Gaykalova等[32]采用基因测序的方法对原发性口腔癌表观遗传学改变进行了全基因组分析, 结合癌症特异性异常值统计数据确定了在口腔癌中基因甲基化的新型生物标志物ZNF14和ZNF160, 并采用定量甲基化特异性PCR的方法, 分别显示出8.47%和16.95%的灵敏度. Schussel等[33]发现唾液中内皮素受体B型(EDNRB)启动子甲基化是口腔癌前病变的生物标志物.通过定量甲基化特异性PCR在191位患者的唾液中分析EDNRB的甲基化状态, 分析结果的灵敏度达38%.基因测序和PCR技术可以使检测的准确性提高, 对疾病的预防和治疗起着重要的作用, 但是两者所需的仪器较为复杂, 检测成本较高.

    3.2   转录组的检测

    鉴定转录组肿瘤标志物的主要方法是定量PCR和微阵列.定量PCR是在DNA扩增反应中, 以荧光染剂侦测每次聚合酶链锁反应循环后产物总量的技术; 而微阵列是在固体表面上集成已知序列的基因探针, 被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交, 通过检测相应位置杂交探针, 实现基因信息的快速检测. Hung等[34]采用定量PCR分析20个唾液样品中的miR-21和miR-31.与对照组相比, 在口腔癌患者中观察到唾液中miR-21和miR-31的表达显著增加(分别为P＝0.003和P＜0.001).谢等[35]通过微阵列方法将6种miRNA(10b、144、21、451、486-5p和634)鉴定为靶标.经定量PCR验证后, 其灵敏度分别为89.7%、92.3%、84.6%、79.5%、43.6%和89.7%, 特异性分别为57.9%、47.4%、57.9%、57.9%、89.5%和47.4%.实验结果可看出两种检测方法的特异性和灵敏度较高, 但是同样存在耗材贵、检测成本高和操作复杂的缺点.

    3.3   蛋白质组的检测

    检测蛋白质组标志物常用的检测方法可分为三大类(见表 2).

    表 2

    表 2  蛋白质组常用检测方法比较
    Table 2.  Comparison of common detection methods for proteome
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    Common methods Biomarkers Sensitivity/% Specificity/% Advantages Disadvantages Ref
    Immune methods ELISA IL-8, IL-6, IL-1β 80 43 Strong reliability, high detection efficiency Time consuming, program complex, high cost [36]
    MMP-9 90 79 [44]
    TPS 69 87 [20]
    M2BP 74 40 [45]
    CEA, SCC 81 77.8 [46]
    WB CD44 62~70 75~88 Large analysis capacity, high sensitivity, strong specificity Complicated operation, high cost [37]
    profilin 90 83 [47]
    MRP14, CD59, CAT — — [38]
    Cyfra 21-1 84 93 [48]
    LDH 79 42 [44]
    Mass spectrometry MS Cyfra36, Secretory leukocyte peptidase inhibitor — — High sensitivity, fast analysis speed, Wide range of applications, can be used with other separation analysis technology Expensive instrument, high testing cost [49]
    LC-MS S100A2, lgG, Transferrin 95 86 [39]
    MALDI-MS Thioredoxin, ZNF510 70.8 95 70.8 95 [40]
    2-DE-MS HAP, AAT — — [41]
    iTRAQ-MS Myosin, Actin 67/100 75/83 [50]
    Optical methods SERS SA 94 98 Simple operation, fast detection speed, high sensitivity Complicated operation, large background interference [42]
    IF LP — — Strong specificity, high sensitivity, fast speed Program complex [33]

    (1) 免疫方法:主要是ELISA和免疫印迹法(western blotting, WB).这些免疫技术通常受到交叉反应和高度非特异性结合的影响, 且所使用的抗体相对昂贵, 因此存在较大提升空间. Katakura等[36]通过ELISA检测了20名健康者和19名口腔癌患者唾液中细胞因子(IL-6、IL-8和IL-1β)的水平, 检测方法的灵敏度为80%, 特异性为43%.在口腔癌患者中3种细胞因子的表达均高于健康对照组, IL-6差异最显著. Franzmann等[37]采用WB验证了CD44与区分恶性和良性病变的强关联性.此外, Hu等[38]在OSCC患者的唾液中, 采用WB发现了细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)、CD59和过氧化氢酶(CAT)三种标志物.

    (2) 与质谱(mass spectrometry, MS)相关的方法:质谱技术、质谱-其它检测技术, 已成功在唾液中鉴定出多种蛋白质标志物.如Dowling等[39]采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法检测出口腔癌患者唾液中转铁蛋白、免疫球蛋白重链恒定区(IgG)及S100钙结合蛋白.此外, Jou等[40]将基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)与MS联用来检测唾液中锌指蛋白510肽(ZNF510), 通过分析来自OSCC患者(n＝47)和健康人(n＝30)的77个唾液样品, 可鉴定ZNF510作为早期检测OSCC的唾液生物标志物, 检测的灵敏度和特异性均为95%. Jessie等[41]从12名OSCC患者和健康受试者的二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)唾液蛋白质谱中发现二者的差异明显, 患者唾液α-抗胰蛋白酶(AAT)和触珠蛋白(HAP)β链被分解为具有微观异质性的多肽斑点, 以此可鉴定其为潜在生物标志物以改善癌症的检测.

    (3) 光学分析法:主要采用表面增强拉曼散射(surface enhancement of Raman scattering, SERS)和免疫荧光(immunofluorescence, IF)的方法来对唾液中的标志物进行检测. Hernández-Arteaga等[42]采用SERS检测100名癌症患者和106名健康人唾液, 结果显示检测方法的灵敏度为94%, 特异度为98%.由此表明SERS技术可作为一种简单方便、高灵敏的唾液酸(SA)定量分析方法. Schapher等[43]通过使用免疫荧光技术发现在所有唾液腺肿瘤中, 瘦素(LP)的表达量远高于健康的腮腺组织.这些方法虽然灵敏度高、特异性强; 但操作复杂、背景干扰较大.

    3.4   微生物组的检测

    微生物组中的肿瘤标志物常见的检测方法为PCR. Mager等[51]使用PCR方法来评估口腔鳞状细胞癌患者和健康受试者唾液中的口腔微生物群, 发现牙龈卟啉单胞菌、产黑色素普雷沃菌和平滑肌链球菌三种微生物群组合的水平显著升高, 具有80%的灵敏度和82%的特异性, 从而表明唾液中微生物群作为口腔癌辅助诊断指标的作用.

    就目前国内外现存唾液肿瘤生物标志物常规检测方法的相关报道, 笔者认为在灵敏度、速度及检测成本方面仍有广阔的发展空间.因此, 开发高效准确、快速简便的唾液肿瘤标志物检测新方法, 对口腔癌人群同步筛查与检测, 口腔癌病情、病程变化跟踪监护, 进而实施针对性干预与治疗具有重要意义.以下根据检测目标物质的不同, 重点阐述几类新型电化学生物传感方法(包括DNA、RNA、蛋白质和微生物等)在唾液肿瘤标志物检测方面的相关应用与最新研究进展.

    4.   电化学生物传感方法

    化学生物传感方法是利用生物活性材料(如酶、蛋白、抗体及核酸等)作为识别元件, 将生化反应转变成可定量的物理、化学信号, 从而能够进行生命、化学物质检测和监控的高新技术.由于仪器设备简单、选择性好、灵敏度高、响应快速、成本低及不受样品颜色和浊度的影响等突出特征, 电化学生物传感器(换能器为电化学电极)是目前研究唾液肿瘤标志物最具潜力的一种快速简便的新型方法.由于电化学生物传感器能进行痕量检测, 常采用检测范围、检测限来评价其分析性能.根据检测靶标的数量、类别的不同, 本文对近几年检测唾液肿瘤生物标志物的电化学方法进行简要评述.

    4.1   单靶标检测

    选取某一种标志物进行传感检测, 即为单靶标分析法.其识别元件针对性地与靶标结合, 特异性较强, 干扰较小, 且针对单靶标的传感策略也相对简单.鉴于唾液中肿瘤生物标志物分类的不同, 以下小节重点介绍了一些用于单独检测唾液中四类标志物的电化学生物传感方法.

    4.1.1   基因组

    对于基因组的检测, 电化学生物传感器多需在电极表面进行DNA固定. CdkN2A/p16基因作为细胞周期调控的参与者, 与口腔癌的发展和恶化密切相关.我们课题组对其做了大量的检测研究工作.如图 1A所示[52], 将电纺纳米纤维尼龙6-多壁碳纳米管修饰在GC电极表面, 通过电沉积SiO2获得功能电纺纳米纤维(PA6-MWCNTs-SiO2), 将其进一步氨基化并经戊二醛(GA)共价偶联NH2修饰的ssDNA1. ssDNA1修饰电极与CdkN2A/p16基因、Ru(bpy)32+/银纳米粒子掺杂金的合金核壳光学复合纳米颗粒标记ssDNA2(RuAg@AuNPs-ssDNA2)进行杂交反应, 通过电致化学发光(ECL)进行定量检测.该传感器的检测范围为1.0×10-3~1.0 pmol•L-1, LOD为0.5 fmol•L-1.课题组的Wang等[53]基于功能化的糊状纳米纤维复合物(PG/GR/CS/PPy)修饰SPCE、RuAg@AuNPs标记DNA放大检测信号, 构建一种通用的三明治型ECL生物传感器, 实现对CdkN2A/p16基因的特异性检测, 检测范围在1.0×10-4~1.0 nmol•L-1, LOD为5.0×10-2 pmol• L-1.

    图 1

    图 1.  (A) 基于功能电纺纳米纤维和核壳发光复合纳米粒子的CdkN2A/p16基因ECL生物传感器[52]; (B)基于Nicking内切酶信号放大的ORAOV1电化学传感器[54]
    Figure 1.  (A) CdkN2A/P16 gene ECL biosensor based on functional electrospun nanofibers and core-shell luminescent composite nanoparticles[52]; (B) ORAOV1 electrochemical sensor based on Nicking endonuclease signal amplification[54]
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    Tan等[54]基于Nicking核酸内切酶信号放大电化学方法, 测定唾液中口腔癌过度表达序列1(ORAOV1), 如图 1B.在3'末端由亚甲蓝标记的含有20个碱基的DNA链(eMB), 具有简单的不对称序列, 可被Nicking核酸内切酶识别.在没有靶DNA的情况下, eMB不能被Nicking核酸内切酶识别, 酶切反应不能进行. eMB虽可在电极上被检测到, 但由于带负电ITO电极的强静电排斥, 其产生的电化学响应可被忽略.在靶DNA存在下, eMB与靶DNA杂交形成双链结构, 可以通过Nicking核酸内切酶识别并分解为两部分, 一部分包含18个碱基的长链DNA; 另一个包含2个碱基的短链DNA.短链DNA与MB连接, 其易扩散到ITO电极表面, 从而检测到强的DPV响应.检测同时, 靶DNA可以与双链DNA解离并触发下一轮杂交、切割和释放.通过这种方式, 单个靶DNA可多次重复触发链断裂循环并实现信号放大.该传感器LOD为0.35 pmol•L-1, 并成功应用于检测添加在人造唾液样品中的靶DNA, 回收率为99.4%~101.7%.

    4.1.2   转录组

    转录组的研究主要集中在从细胞分泌及各种来源进入口腔的mRNA和miRNA(如表 3).

    表 3

    表 3  转录组电化学传感器比较
    Table 3.  Comparison of transcriptome electrochemical sensors
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    Method Electrode Biomarker Detection range LOD Ref.
    CA Strep-Au array IL-8 mRNA 5~50 nmol•L-1 0.4 fmol•L-1 [55]
    Amperometry DNA-dendrimer/DDPpy modified Au array IL-8 mRNA — 10 amol•L-1 [56]
    CA Strep-MBs coupled to Au electrode miR-200a 1 amol•L-1~10 fmol•L-1 0.22 amol•L-1 [57]

    Wang等[57]构建使用电磁控制的金电极(AuE)测定口腔癌相关miRNA(hsa-miR-200a)的计时电流传感器, 如图 2.捕获探针(Cp, 黑色)其一端用生物素官能化, 并固定在链霉亲和素修饰的磁珠(Strep-MB)上; 信号探针(Sp, 绿色)两端用生物素修饰.在没有靶miRNA(T, 红色)的情况下, 由于温度较低, Cp和Sp不会杂交.然而, 在靶miRNA(T)存在下, Cp可与T、Sp同时杂交, 并在MB的表面上形成“Y”结构的杂交体.附着杂交体的MB可通过生物素化的Sp捕获链霉亲和素标记的HRP(Strep-HRP).通过在电线圈上添加电压, 将MB吸附在电磁可控工作电极表面, 在四甲基联苯胺-过氧化氢(TMB-H2O2)溶液中, HRP修饰的MB具有强过氧化物酶活性, 可有效催化H2O2介导的TMB氧化, 导致其电流信号增加.此传感平台可检测低至0.22 μmol•L-1的目标miRNA, 其成功地应用于分析不同浓度的靶miRNA的唾液样品, 回收率为93%~108%.

    图 2

    图 2.  磁控电化学RNA传感器[57]
    Figure 2.  Magnetron electrochemical RNA sensor [57]
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    4.1.3   蛋白质组

    近几年, 电化学传感器已广泛用于唾液中蛋白质类肿瘤标志物的检测(如表 4). Aydin等[64]建立基于6-膦酰基己酸(PHA)修饰ITO电极的无标记阻抗IL-8免疫传感器. ITO电极先后与NH4OH、PHA溶液作用, 形成含有羧基的单层膜; 经EDC/NHS将羧基活化并共价连接捕获抗体IL-8, 捕获抗体IL-8进一步结合IL-8抗原; 在铁氰化钾溶液中, 采用EIS对IL-8抗原定量检测.该传感器的检测范围在0.02~3 pg•mL-1, LOD为6 fg•mL-1; 其与ELISA方法对唾液样品中IL-8的测定具有较好的一致性.

    表 4

    表 4  蛋白质组电化学传感器比较
    Table 4.  Comparison of proteome electrochemical sensors
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    Method Electrode Biomarker Detection range LOD References
    DPV MB-DNA-antibody chimeras-AuE AFP 2.0 pg•mL-1~20.0 ng•mL-1 2.0 pg•mL-1 [58]
    DPV GO/ITO hTERT 10 ag•mL-1~50 ng•mL-1 10 ag•mL-1 [59]
    Amperometry HOOC-MBs coupled to SPCE IL-6 1.75~500 pg•mL-1 0.39 pg•mL-1 [60]
    DPV ProtG-MBs coupled to SPCE GHRL 10-3~103 ng•mL-1 7 pg•mL-1 [61]
    DPV ZrO2-RGO/ITO CYFRA-21-1 2~22 ng•mL-1 0.122 ng•mL-1 [62]
    EIS Fe3O4@Au NPs/BDD IL-8 0.1~1000 pg•mL-1 0.03 pg•mL-1 [63]
    EIS, CV PHA/ITO IL-8 0.02~3 pg•mL-1 6 fg•mL-1 [64]
    DPV AuNps-rGO/ITO IL-8 500 fg•mL-1~4 ng•mL-1 72.73 pg•mL-1 [65]
    EIS, CV P3-TMA/ITO IL-1β 0.01~3 pg•mL-1 3 fg•mL-1 [66]
    EIS L-cysteine-AuE CD59 1~1000 fg•mL-1 0.38 fg•mL-1 [67]
    DPV Serine-nZrO2/ITO CYFRA-21-1 0.01~29 ng•mL-1 0.01 ng•mL-1 [68]
    CV APTES/ZrO2/ITO CYFRA-21-1 2~16 ng•mL-1 0.08 ng•mL-1 [69]
    Amperometry SPEC α-amylase 100~1200 U•mL-1 1.1 U•mL-1 [70]
    EIS P3/ITO TNFα 0.01~2 pg•mL-1 3.7 fg•mL-1 [71]
    SWV MCH/Hp1/AuE EpCAM 0.1~20 ng•mL-1 20 pg•mL-1 [72]
    CV DTSP-IDEs Cortisol 10 pg•mL-1~100 ng•mL-1 10 pg•mL-1 [73]
    EIS (1D)-ZnO-NRs or(2D)-ZnO-NFs on AuE Cortisol — 1 pmol•L-1 [74]
    EIS, CV GP-PS67-b-PAA27/Au-IDμEs Cortisol 3 pg•mL-1~10 μg•mL-1 3 pg•mL-1 [75]

    Verma等[65]制备一种基于金纳米颗粒-还原氧化石墨烯(AuNPs-rGO)复合材料的电化学免疫传感器, 用于非侵入性检测唾液生物标志物IL-8.如图 3B所示, 将AuNPs-rGO修饰ITO经EDC/NHS活化并固载IL-8抗体, IL-8抗体进一步结合IL-8抗原, 获得复合物修饰电极; 在Zobell溶液中, 采用DPV检测复合物修饰电极的电信号.该传感器的检测范围在500 fg•mL-1至4 ng• mL-1, LOD为72.73±0.18 pg•mL-1, 同时其对人唾液样品中IL-8的检测表现出极好的特异性.此外, 该传感器长达3个月的可重复使用性和稳定性证明了该纳米平台用于检测临床相关的其他生物标记物的商业潜力.

    图 3

    图 3.  用于检测IL-8的电化学传感器. (A)以PHA为固定基质[64]; (B)基于AuNPs-rGO修饰电极[65]
    Figure 3.  Electrochemical sensor for detecting IL-8. (A) Based on PHA as a fixed substrate[64]; (B) Modified electrode based on AuNPs-rGO[65]
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    Li等[58]报道基于碱基堆积依赖性DNA杂交的电化学蛋白质传感平台, 如图 4A.首先将硫醇化的捕获探针固定在金电极上, 接着用一对短的互补寡DNA标记识别甲胎蛋白(AFP)不同表位的一对抗体, 其中DNA2与捕获探针互补, 且3'末端标记亚甲蓝(MB).在AFP存在下, 抗体对(AFP-Y1和AFP-Y2)将同时与AFP的不同表位结合, 抗体偶联的寡DNA(DNA1和DNA2)将杂交形成发夹.随后DNA2的3'末端序列的其余部分可与捕获探针杂交, 因为碱基堆积带来额外的稳定性, 导致标记在DNA2上的MB被拉近电极表面, 从而产生氧化还原电流.在没有AFP的情况下, 互补的抗体-DNA对、MB标记的DNA-捕获探针对不能稳定杂交, MB远离电极表面, 阻碍电子转移, 仅观察到背景电流.该传感器可检测到低至2.0 pg•mL-1的甲胎蛋白.此外, 采用该传感器和ELISA方法对实际唾液样本进行检测, 二者所得结果基本吻合. Chen等[72]设计一种基于适体链置换反应的检测上皮细胞粘附分子(EpCAM)的电化学生物传感器(图 4B). 5'端SH修饰的发夹探针1(Hp1)经Au―S键固载在Au电极上.探针A与EpCAM适体杂交形成适体-探针A双链体.在无EpCAM的情况下, 链置换反应的发生受到限制, 仅产生可忽略的电流信号.加入EpCAM后, 探针A从适体-探针A双链体中释放出来, 与Hp1杂交后打开其发夹结构, Hp1进一步与MB标记发夹探针2(Hp2)杂交, 形成Hp1-Hp2双链体, MB富集于金电极表面, 经方波伏安法检测其电流响应.另外, 解离的探针A可与另一Hp1杂交以开始下一轮DNA再循环扩增反应.该传感器LOD为20 pg•mL-1, 成功应用于加标人血清、尿液和唾液中EpCAM的测定, 回收率在93.2%~95.6%.

    图 4

    图 4.  (A) 基于碱基堆积依赖性DNA杂交的电化学传感器用于检测APF[58]; (B)基于适体识别的电化学传感器用于检测EpCAM [72]; (C)基于电纺纳米纤维的ECL免疫传感器用于检测TSP53蛋白[76]
    Figure 4.  (A) Electrochemical sensor based on base stack-dependent DNA hybridization for detecting APF[58]; (B) Electrochemical sensor based on aptamer recognition for detecting EpCAM[72]; (C) Electrospun nanofiber-based ECL immunosensor for detecting TSP53 protein[76]
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    我们课题组[76]报道有关肿瘤抑制蛋白TSP53的电化学检测.将MWCNTs掺杂壳聚糖(CTS)纳米纤维, 通过原位电沉积在其表面修饰AuNPs获得功能电纺纳米纤维(MWCNTs-CTS-AuNP)修饰电极并固载TSP53捕获抗体. TSP53、Ru(bpy)32+/AgNPs掺杂二氧化硅核壳复合纳米粒子(RuAg/SiO2NPs)标记检测抗体经夹心免疫反应进一步固载在修饰电极上.由RuAg/SiO2NPs的ECL信号间接定量TSP53, 其LOD为0.5 pg•mL-1.

    4.1.4   微生物组

    口腔是细菌和其他微生物的栖息地, 一系列实验结果表明口腔内环境失调可导致口腔疾病, 因此Ahmed等[77]构建一种用于检测唾液中化脓性链球菌(S.pyogenes)的新型免疫传感器.如图 5所示, 首先将聚酪胺(Ptyr)电沉积到丝网印刷金电极上, 将生物素-亲和素这一复合物与Ptyr上的胺基结合, 接着将生物素标记的化脓性链球菌抗体与亲和素缀合, 采用CV和EIS方法在铁氰化钾溶液中检测.该传感器能在50%(V/V)唾液中成功检测到S.pyogenes, 检测范围为每10 μL含有100至105个细菌, 具有良好的选择性和低交叉反应性.

    图 5

    图 5.  基于生物素-亲和素的电化学传感器用于检测S.pyogenes[77]
    Figure 5.  Electrochemical sensor based on biotin-avidin for detection of S.pyogenes[77]
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    4.2   双靶标检测

    目前, 口腔癌中单一性肿瘤生物标志物检测的敏感性和特异性均十分有限.不同的肿瘤既能具有不同的肿瘤标志物, 也能具有共同的肿瘤标志物.而同一种肿瘤由于组织类型不同, 也可有一种或几种肿瘤标志物.就某一项肿瘤生物标志物而言, 它对不同种类、不同类型肿瘤的诊断价值也各不相同.鉴于现有单一唾液肿瘤生物标志物的敏感性和特异性不够理想, 难以准确反映口腔癌的复杂性.根据口腔癌的特性, 合理选择多种唾液肿瘤生物标志物进行联合检测是显著提高其总检出率及临床诊断价值的有效方法.目前, 用于唾液样品中两种肿瘤生物标志物(双靶标)的电化学传感平台已被报道.

    4.2.1   组内双靶标

    通过在同一组别内进行双靶标的检测, 可缩短分析时间, 减小样品体积, 提高检测效率和降低成本; 还可更好地发现两者之间的联系及其对检测结果的影响.组内双靶标的检测主要在基因组和蛋白质组中较为常见(见表 5).

    表 5

    表 5  双靶标电化学传感器
    Table 5.  Electrochemical sensor for dual targets
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    Method Electrode Biomarkers Detection range LOD Reference
    Chronoamperometry Conducting polymer-array of AuE chip EGFR gene mutations — — [78]
    DPV AuNP/PEDOT/CNT/SPCEs hGH, PRL 0.05~1000 ng•mL－1(hGH),
    0.001~1000 ng•mL－1(PRL)    		 4.4 pg•mL－1(hGH),
    0.22 pg•mL－1(PRL)    		 [79]
    DPV 4-ABA-rGO-SPdCEs GHRL, PYY 10－3~100 ng•mL－1(GHRL),
    10－4~10 ng•mL－1(PYY)    		 1.0 pg•mL－1(GHRL),
    0.02 pg•mL－1(PYY)    		 [80]
    Amperometry HOOC-Phe-DWCNTs/SPCEs IL-1β, TNF-α 0.5~100 μg•mL－1(IL-1β)，
    1~200 μg•mL－1(TNF-α)    		 0.38 pg•mL－1(IL-1β),
    0.85 pg•mL－1(TNF-α)    		 [81]
    CV CNT-SPCE Hcy, GSH 5~20 μmol•L－1(Hcy),
    5~20 μmol•L－1(GSH)    		 0.9 μmol•L－1(Hcy),
    2 μmol•L－1(GSH)    		 [82]

    (1) 基因组:魏研究小组[78]构建一种基于电场诱导释放和测量(EFIRM)技术的电化学传感器, 直接检测唾液样品中表皮生长因子受体(EGFR)基因的突变, 如图 6.该传感器针对EGFR两种突变设计两套成对探针, 即用于EGFR中外显子19缺失、L858R突变的检测探针和捕获探针.首先通过施加循环方波电场, 将捕获探针与吡咯共聚到16个裸金电极芯片上; 捕获探针与目标物、异硫氰酸荧光素标记的检测探针杂交; 在酪蛋白-磷酸盐缓冲液中加入HRP标记的异硫氰酸荧光素抗体, 使其与检测探针上的异硫氰酸荧光素结合, 在含有TMB的检测液中, 测量HRP催化产生的电信号.该法对来自40名患者的唾液样品进行盲法试验, 结果表明EFIRM检测到EGFR中外显子19缺失, 曲线下面积为0.94; L858R突变, 曲线下面积为0.96.曲线下面积越大, 表明EFIRM检测唾液中EGFR突变的准确性越高.

    图 6

    图 6.  EFIRM技术用于检测唾液中EGFR突变[78]
    Figure 6.  EFIRM technology for detecting EGFR mutations in saliva[78]
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    (2) 蛋白质组: Sánchez-Tirado等[81]将4-羧基苯基官能化双壁碳纳米管(HOOC-Phe-DWCNTs)改性的双丝网印刷碳电极(SPCE)作为固定抗体的支架, 用于同时测定IL-β1和TNF-α.如图 7所示, 将捕获抗体IL-β1和TNF-α分别固定在电极后, 经靶蛋白、生物素化检测抗体的夹心温育结合.并进一步与聚HRP-链霉亲和素缀合, 经过氧化氢-对苯二酚(H2O2-HQ)进行安培法测定.该传感器对IL-β1、TNF-α的线性范围分别为0.5~100 μg•mL-1、1~200 μg•mL-1, LOD分别为0.38 pg•mL-1、0.85 pg•mL-1.成功应用于以不同浓度水平掺入IL-β1和TNF-α的唾液样品, 回收率较好.

    图 7

    图 7.  基于官能化双壁碳纳米管修饰电极的电化学传感器用于检测IL-1β和TNF-α[81]
    Figure 7.  Electrochemical sensor based on functionalized double-walled carbon nanotube modified electrode for detection of IL-1β and TNF-α[81]
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    Martínez-García等[80]基于4-氨基苯甲酸(4-ABA)/还原氧化石墨烯(rGO)修饰丝网印刷双碳电极(SpdCEs)构建同时测定生长激素释放肽(GHRL)、酪酪肽(PYY)的电化学传感器.如图 8所示, SpdCEs首先固载GHRL、PYY捕获抗体; 目标物、生物素标记目标物与捕获抗体竞争性结合, 生物素标记的目标物与碱性磷酸酶链霉亲和素(AP-Strept)进一步缀合, 以1-NPP(1-萘基磷酸酯)作为碱性磷酸酶催化反应底物, 经DPV分别测定SpdCEs双电极端的峰电流.唾液中GHRL和PYY的线性范围分别为10-3~10 ng•mL-1、10-4~10 ng•mL-1.该传感器稳定性和选择性较好, 并成功应用于加标人血清和唾液样品的分析, 回收率在96%~103%之间.

    图 8

    图 8.  基于rGO-SPdCEs上修饰4-ABA的电化学传感器用于检测GHRL和PYY[80]
    Figure 8.  Electrochemical sensor based on modified 4-ABA on rGO-SPdCEs for detection of GHRL and PYY[80]
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    4.2.2   组间双靶标

    口腔癌系唾液中多种复杂分子共同作用的结果, 将基因水平的DNA、调节水平的RNA、功能水平的蛋白质及一些微生物进行联合检测, 可从多角度来验证唾液肿瘤生物标志物与口腔癌之间的相关性, 从而提高检测结果的准确性.

    组间双靶标的检测大多发生在蛋白质组和转录组之间.最近Torrente-Rodríguez等[83]使用双磁性印刷电极(SPdCE, WE1和WE2)同时测定人唾液样品中IL-8及其信使RNA(IL-8 mRNA)双靶标, 方法如图 9所示.对于IL-8(WE1), 将捕获抗体(C-Abs)共价固定经EDC/NHS活化的羧基修饰磁珠(HOOC-MB)上, 经IL-8、生物素化的检测抗体(BD-Ab)构建三明治复合物, 并进一步以HRP标记生物素化的BD-Ab.对于IL-8mRNA(WE2), 将生物素标记的发夹DNA序列(B-HCpIL-8)与链霉亲和素修饰磁珠(Strep-MB)结合, 并与生物素化的IL-8mRNA杂交, 进一步用Strep-HRP标记生物素化的杂交体.在各自对应的工作电极上, 使用HQ作为氧化还原介体用于监测双靶标的电流值.该法具有较高的灵敏度和选择性, 对IL-8、IL-8 mRNA的LOD分别为72.4 pg•mL-1和0.21 nmol•L-1.该传感器成功应用于加标原始唾液样品中的IL-8、IL-8 mRNA的检测, 并确定唾液样品中IL-8、IL-8 mRNA的内源性含量, 其与ELISA试剂盒结果基本吻合.

    图 9

    图 9.  同时测定IL-8蛋白和IL-8 mRNA的双磁性传感器[83]
    Figure 9.  Dual magnetic sensor for simultaneous determination of IL-8 protein and IL-8 mRNA[83]
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    5.   结论和展望

    唾液样本取材方便, 安全无创, 内含多种生物分子, 其与口腔癌的发生发展及治疗预后有着密切的诱因关系.纵观国内外的研究现状, 唾液肿瘤标志物的电化学生物传感方法具有如下的发展趋势.

    (1) 组内靶标检测数量的增加.目前, 各组唾液肿瘤标志物的电化学传感仅见双靶标检测, 多靶标检测未见相关文献报道.未来可建立更多标志物的检测, 拓宽电化学检测唾液肿瘤生物标志物的思路和手段.

    (2) 组间靶标检测种类的拓展.由于转录组与蛋白质组的表达密切相关, 加之抗原-抗体反应的高选择性和敏感性, 目前文献报道仅见蛋白质组、转录组的组间电化学检测.开发研制用于联合检测多种组别的生物传感分析平台是未来唾液肿瘤生物标志物电化学检测的重点.

    (3) 传感检测实用性的提高.目前电化学生物传感器对唾液样本中标志物分子检测效果不理想.将传感设计与唾液样品前处理有效偶联, 集靶标提取、富集、检测为一体, 有效提高传感器的实用性, 将是未来研究的方向.

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  • 图 1  (A) 基于功能电纺纳米纤维和核壳发光复合纳米粒子的CdkN2A/p16基因ECL生物传感器[52]; (B)基于Nicking内切酶信号放大的ORAOV1电化学传感器[54]

    Figure 1  (A) CdkN2A/P16 gene ECL biosensor based on functional electrospun nanofibers and core-shell luminescent composite nanoparticles[52]; (B) ORAOV1 electrochemical sensor based on Nicking endonuclease signal amplification[54]

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    图 2  磁控电化学RNA传感器[57]

    Figure 2  Magnetron electrochemical RNA sensor [57]

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    图 3  用于检测IL-8的电化学传感器. (A)以PHA为固定基质[64]; (B)基于AuNPs-rGO修饰电极[65]

    Figure 3  Electrochemical sensor for detecting IL-8. (A) Based on PHA as a fixed substrate[64]; (B) Modified electrode based on AuNPs-rGO[65]

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    图 4  (A) 基于碱基堆积依赖性DNA杂交的电化学传感器用于检测APF[58]; (B)基于适体识别的电化学传感器用于检测EpCAM [72]; (C)基于电纺纳米纤维的ECL免疫传感器用于检测TSP53蛋白[76]

    Figure 4  (A) Electrochemical sensor based on base stack-dependent DNA hybridization for detecting APF[58]; (B) Electrochemical sensor based on aptamer recognition for detecting EpCAM[72]; (C) Electrospun nanofiber-based ECL immunosensor for detecting TSP53 protein[76]

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    图 5  基于生物素-亲和素的电化学传感器用于检测S.pyogenes[77]

    Figure 5  Electrochemical sensor based on biotin-avidin for detection of S.pyogenes[77]

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    图 6  EFIRM技术用于检测唾液中EGFR突变[78]

    Figure 6  EFIRM technology for detecting EGFR mutations in saliva[78]

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    图 7  基于官能化双壁碳纳米管修饰电极的电化学传感器用于检测IL-1β和TNF-α[81]

    Figure 7  Electrochemical sensor based on functionalized double-walled carbon nanotube modified electrode for detection of IL-1β and TNF-α[81]

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    图 8  基于rGO-SPdCEs上修饰4-ABA的电化学传感器用于检测GHRL和PYY[80]

    Figure 8  Electrochemical sensor based on modified 4-ABA on rGO-SPdCEs for detection of GHRL and PYY[80]

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    图 9  同时测定IL-8蛋白和IL-8 mRNA的双磁性传感器[83]

    Figure 9  Dual magnetic sensor for simultaneous determination of IL-8 protein and IL-8 mRNA[83]

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    表 1  口腔癌相关唾液肿瘤生物标志物分类

    Table 1.  Classification of salivary tumor biomarkers associated with oral cancer

    Group Category Representative Biomarkers
    Genome Promoter methylation DAPK, DCC, MINT-31, TIMP-31, TIMP-3, CdkN2A/p16, MGMT, CCNA1, ZNF14, ZNF160, ZNF420, EDNRB
    Loss of heterozygosity TSP53, D3S1234, D9S156, D17S799, chromosomes 3p, 17p, 9q, 13q
    Gene mutation FBXW7, HOXA9, HRAS, NRAS, PIK3CA, TSP53
    Gene amplification Cyclin D1
    Others phosphorylated-Src, Maspin, ORAOV1
    Transcriptome mRNA DUSP1, IL-8, IL-1β, H3F3A, S100P, SAT
    ncRNA miR:125a, 200a, 31, 10b, 144, 21, 451, 486-5p, 634
    Protein Interleukins IL-8, IL-6, IL-1β
    Antigen & Antibody TPA, CEA, SCC-Ag2, CA125, CA128, CA15-3, TSP53
    Enzymes OAZ-1, DUSP1, LDH, CAT, AAT, MMP-2, MMP-11, OGG1, α-amylase, telomerase
    Enzyme inhibitors SA-1, SLPI, cystatin A
    Conjugated proteins CD44, CD59, Cyfra21-1, Cyfra 19, Cyfra36, S-lgA, M2BP, Actin, MRP14, ZNF510, profilin, Thioredoxin, HAP, Transferrin, Myosin, S100A2, AFP
    Others Defensins-1, TNF-α, EGFR
    Microbiota Candida Candida albicans
    Bacillus P.gingivalis, P.melaninogenica, Tannerella forsythia
    Streptococcus Streptococcus mitis, Streptococcus mutans
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    表 2  蛋白质组常用检测方法比较

    Table 2.  Comparison of common detection methods for proteome

    Common methods Biomarkers Sensitivity/% Specificity/% Advantages Disadvantages Ref
    Immune methods ELISA IL-8, IL-6, IL-1β 80 43 Strong reliability, high detection efficiency Time consuming, program complex, high cost [36]
    MMP-9 90 79 [44]
    TPS 69 87 [20]
    M2BP 74 40 [45]
    CEA, SCC 81 77.8 [46]
    WB CD44 62~70 75~88 Large analysis capacity, high sensitivity, strong specificity Complicated operation, high cost [37]
    profilin 90 83 [47]
    MRP14, CD59, CAT — — [38]
    Cyfra 21-1 84 93 [48]
    LDH 79 42 [44]
    Mass spectrometry MS Cyfra36, Secretory leukocyte peptidase inhibitor — — High sensitivity, fast analysis speed, Wide range of applications, can be used with other separation analysis technology Expensive instrument, high testing cost [49]
    LC-MS S100A2, lgG, Transferrin 95 86 [39]
    MALDI-MS Thioredoxin, ZNF510 70.8 95 70.8 95 [40]
    2-DE-MS HAP, AAT — — [41]
    iTRAQ-MS Myosin, Actin 67/100 75/83 [50]
    Optical methods SERS SA 94 98 Simple operation, fast detection speed, high sensitivity Complicated operation, large background interference [42]
    IF LP — — Strong specificity, high sensitivity, fast speed Program complex [33]
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    表 3  转录组电化学传感器比较

    Table 3.  Comparison of transcriptome electrochemical sensors

    Method Electrode Biomarker Detection range LOD Ref.
    CA Strep-Au array IL-8 mRNA 5~50 nmol•L-1 0.4 fmol•L-1 [55]
    Amperometry DNA-dendrimer/DDPpy modified Au array IL-8 mRNA — 10 amol•L-1 [56]
    CA Strep-MBs coupled to Au electrode miR-200a 1 amol•L-1~10 fmol•L-1 0.22 amol•L-1 [57]
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    表 4  蛋白质组电化学传感器比较

    Table 4.  Comparison of proteome electrochemical sensors

    Method Electrode Biomarker Detection range LOD References
    DPV MB-DNA-antibody chimeras-AuE AFP 2.0 pg•mL-1~20.0 ng•mL-1 2.0 pg•mL-1 [58]
    DPV GO/ITO hTERT 10 ag•mL-1~50 ng•mL-1 10 ag•mL-1 [59]
    Amperometry HOOC-MBs coupled to SPCE IL-6 1.75~500 pg•mL-1 0.39 pg•mL-1 [60]
    DPV ProtG-MBs coupled to SPCE GHRL 10-3~103 ng•mL-1 7 pg•mL-1 [61]
    DPV ZrO2-RGO/ITO CYFRA-21-1 2~22 ng•mL-1 0.122 ng•mL-1 [62]
    EIS Fe3O4@Au NPs/BDD IL-8 0.1~1000 pg•mL-1 0.03 pg•mL-1 [63]
    EIS, CV PHA/ITO IL-8 0.02~3 pg•mL-1 6 fg•mL-1 [64]
    DPV AuNps-rGO/ITO IL-8 500 fg•mL-1~4 ng•mL-1 72.73 pg•mL-1 [65]
    EIS, CV P3-TMA/ITO IL-1β 0.01~3 pg•mL-1 3 fg•mL-1 [66]
    EIS L-cysteine-AuE CD59 1~1000 fg•mL-1 0.38 fg•mL-1 [67]
    DPV Serine-nZrO2/ITO CYFRA-21-1 0.01~29 ng•mL-1 0.01 ng•mL-1 [68]
    CV APTES/ZrO2/ITO CYFRA-21-1 2~16 ng•mL-1 0.08 ng•mL-1 [69]
    Amperometry SPEC α-amylase 100~1200 U•mL-1 1.1 U•mL-1 [70]
    EIS P3/ITO TNFα 0.01~2 pg•mL-1 3.7 fg•mL-1 [71]
    SWV MCH/Hp1/AuE EpCAM 0.1~20 ng•mL-1 20 pg•mL-1 [72]
    CV DTSP-IDEs Cortisol 10 pg•mL-1~100 ng•mL-1 10 pg•mL-1 [73]
    EIS (1D)-ZnO-NRs or(2D)-ZnO-NFs on AuE Cortisol — 1 pmol•L-1 [74]
    EIS, CV GP-PS67-b-PAA27/Au-IDμEs Cortisol 3 pg•mL-1~10 μg•mL-1 3 pg•mL-1 [75]
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    表 5  双靶标电化学传感器

    Table 5.  Electrochemical sensor for dual targets

    Method Electrode Biomarkers Detection range LOD Reference
    Chronoamperometry Conducting polymer-array of AuE chip EGFR gene mutations — — [78]
    DPV AuNP/PEDOT/CNT/SPCEs hGH, PRL 0.05~1000 ng•mL－1(hGH),
    0.001~1000 ng•mL－1(PRL)    		 4.4 pg•mL－1(hGH),
    0.22 pg•mL－1(PRL)    		 [79]
    DPV 4-ABA-rGO-SPdCEs GHRL, PYY 10－3~100 ng•mL－1(GHRL),
    10－4~10 ng•mL－1(PYY)    		 1.0 pg•mL－1(GHRL),
    0.02 pg•mL－1(PYY)    		 [80]
    Amperometry HOOC-Phe-DWCNTs/SPCEs IL-1β, TNF-α 0.5~100 μg•mL－1(IL-1β)，
    1~200 μg•mL－1(TNF-α)    		 0.38 pg•mL－1(IL-1β),
    0.85 pg•mL－1(TNF-α)    		 [81]
    CV CNT-SPCE Hcy, GSH 5~20 μmol•L－1(Hcy),
    5~20 μmol•L－1(GSH)    		 0.9 μmol•L－1(Hcy),
    2 μmol•L－1(GSH)    		 [82]
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  • 发布日期:  2019-04-15
  • 收稿日期:  2018-10-07
  • 网络出版日期:  2018-04-03
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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