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• 1.   引言

  一直以来, 器官供应的短缺阻碍着器官移植的发展, 因此近年来研究者们把目光投向了人造组织或器官, 即组织工程的研究^[1].组织工程的核心是建立细胞与生物材料的复合体, 因此, 用于细胞培养的细胞外基质(ECM)支架的构建是组织工程用材料研究中的关键^[2].

  蚕丝及蚕丝蛋白作为一类非生理活性的蛋白质, 具有良好的生物相容性和生物可降解性, 适合制备ECM支架并在组织创伤修复等领域具有应用前景^[3]. Unger等^[4]曾构建了类血管再生桑蚕丝蛋白支架并研究了人血管内皮细胞和原代人成骨细胞在其中的生长情况. Kaplan及其合作者^[5]则通过混合桑蚕丝纤维与再生桑蚕丝蛋白溶液, 制备出高强度的三维支架, 用以模拟骨组织并研究间充质干细胞的基因表达情况.

  除桑蚕丝外, 柞蚕丝是蚕丝的另一重要类别, 其丝蛋白一级结构中具有特殊的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列. RGD存在于多种细胞外基质中, 可与11种整合素特异性结合, 能有效地促进细胞在生物材料上的粘附和生长^[6].根据文献报道, 将RGD序列固定于钛或钛合金种植体表面后, 成骨细胞在其上的粘附有很大的提高^[7].就此而言, 柞蚕丝蛋白在组织工程用材料领域或许具有更大的潜在应用价值.但与桑蚕丝相比, 柞蚕丝在高盐溶液中的溶解更为困难, 其丝蛋白在溶解(再生)时易产生较大程度的分子链降解; 换言之, 再生柞蚕丝蛋白水溶液不仅制备过程复杂, 并且其中的丝蛋白加工成型性能不佳, 由此极大地阻碍了基于再生柞蚕丝蛋白材料的研究和应用. Li等^[8]曾研究了再生柞蚕丝蛋白溶液浓度和冷冻干燥温度等对所制备多孔支架的孔径影响, 但并未实施有关其结构性能和生物相容性等探索.

  在本研究中, 我们希望通过结合两种丝蛋白各自的优点, 将简单共混后的再生柞蚕丝蛋白(RASF)和再生桑蚕丝蛋白(RBSF)水溶液以特定的正丁醇诱导和相应的冰冻-融化过程, 经由丝蛋白分子链组装(即由水溶性的无规/螺旋构象向非水溶性的β-折叠构象转变)的方式^[9], 制备蚕丝蛋白共混支架; 在对其形貌、结构和性能进行表征的基础上, 探讨不同组成的共混支架的细胞相容性, 以期为用于骨修复等组织工程用材料提供更好的选择.

  2.   结果与讨论

  2.1   RASF/RBSF多孔支架材料的形貌

  将6%(质量百分数)的两种再生蚕丝蛋白(RASF和RBSF)水溶液按一定的体积比混合后, 加入少量正丁醇诱导混合液(未出现分相现象)中的丝蛋白进行相应的构象转变, 并将混合丝蛋白溶液浇铸在相应的模具中放入冷冻箱, 24 h后取出并在室温条件下使形成的冰晶融化, 即可得到如图 1所示的非水溶性的RASF/RBSF共混多孔支架.可以发现, 使用不同模具制备的此类材料通过后处理可获得相应的外形, 表明其具有良好的形状可塑性.同时, 湿态下纯RBSF支架呈乳白色, 随着RASF的混入, RASF/RBSF共混支架的颜色逐渐变黄, 且其柔软度增加, 宏观力学性能变弱, 而纯RASF支架材料在湿态下的自支撑性几乎丧失, 取样时就有可能会发生崩塌.因此, 本实验中RASF/RBSF共混支架中RASF最高含量为70%.

  图 1

  

  图 1.  湿态下由模具决定宏观形貌的RBSF和RASF/RBSF共混支架

  Figure 1.  Photographs of RBSF and RASF/RBSF blend porous scaffolds with different shapes

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  Zhang等^[10]曾使用六氟异丙醇为溶剂分别溶解桑蚕丝和柞蚕丝, 两者混合后经电纺得到的纳米混合丝蛋白纤维表面均匀且无分层现象, 说明两种蚕丝蛋白溶液能较好的混合而用于制备均匀材料.本研究制备的丝蛋白支架内部为多孔结构(图 2), 在各种比例RASF和RBSF支架的局部放大图上(图 2右列), 其孔壁表面均匀, 提示着在我们的制备条件下, RASF和RBSF并无分相情况, 即两者具有较好的相容性.

  图 2

  

  图 2.  支架的断面图. (A1)(A2) RBSF; (B1)(B2) 1:9; (C1)(C2) 3:7; (D1)(D2) 5:5; (E1)(E2) 7:3

  Figure 2.  SEM images of fracture sections of the porous scaffolds. (A1)(A2) RBSF; (B1)(B2) 1:9; (C1)(C2) 3:7; (D1)(D2) 5:5; (E1)(E2) 7:3

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  为了获得具有一定力学强度的支架材料, 我们使用由NaHCO₃脱胶桑蚕丝而得到的RBSF, 相较Na₂CO₃脱胶丝, 其相对分子量更高, 水溶液粘度更大^[11], 因此纯RBSF支架断面中(图 2 A1、A2)除了冰晶形成的大孔外, 还有一些明显的片层结构出现, 由此提高了支架材料的力学性能.

  已有研究表明, 不同的细胞和组织部位对于支架材料的孔径大小有着不同的要求^[12].随着RASF含量的逐步提高, 支架内部的孔径明显减小, 并开始出现几十至几百微米的多级孔径.对支架孔径进行统计, 其大小从240±67 μm (RBSF)逐渐减小到150±41 μm (7:3).因此可以根据需要, 对所需要的支架材料的孔径大小进行适当的调节.另外, 相比纯RBSF支架, 共混支架内部孔洞的连通性也更好, 当RASF含量增至50%或70%时, 几乎所有孔洞都相互连接(图 2 D2、E2), 这无疑更有利于细胞生长.这是因为当加入低粘度(分子量较小)的RASF溶液后, RASF与RBSF将通过氢键发生分子间的相互作用, 彼此之间缠结在一起, 形成网络, 进而促进了共混材料内部多孔状的形成.值得注意的是, 在RASF与RBSF配比为5:5时, 支架材料的孔径似乎达到了一个极小值, 这也从侧面证明了两者的分子链之间具有较强的相互作用.这是因为在支架制备过程中, 丝蛋白分子链内特别是分子间强烈的氢键作用使其聚集, 部分甚至形成规整的β-折叠结构(区域).由于在冰冻时, 溶剂水是以冰晶的形式起到致孔剂的作用, 因此, 冰晶的大小将直接控制所形成多孔支架的孔径大小.显然, 分子链间相互作用越强, 冰晶的生长受限越大, 致使最后形成的支架孔径越小^[9].

  2.2   RASF/RBSF多孔支架材料的微观结构

  先前的研究已对蚕丝蛋白酰胺I区的红外吸收峰进行了相应的归属, 即1650~1660和620~625 cm^-1处为α-螺旋/无规卷曲的特征吸收峰; 1620~1630和1235~1245 cm^-1处为β-折叠结构的特征吸收峰, 1690~1700 cm^-1处则为β-转角结构的特征吸收峰^{[13, 14]}.

  图 3为经冻干压片后得到的支架样品的傅立叶变换红外光谱图.可以发现, 所有样品在1622 cm^-1处均出现了特征峰(图 3A), 表明支架中丝蛋白的结构由Silk-Ⅱ(β-折叠构象)主导.这应该源于支架的整个制备过程:正丁醇对丝蛋白分子链构象从亲水的无规卷曲向疏水的β-折叠转变具有诱导作用, 而冰冻(冰晶的形成)挤压对丝蛋白分子周围水化层的破坏, 从而促进了其分子间的疏水相互作用进而形成β-折叠结构.另外, 谱图在1700 cm^-1附近出现了小峰, 说明支架中丝蛋白分子链形成了一定量的β-转角构象, 显然, 这与以各向同性分布的疏水β-折叠结构所形成的物理交联区域有关.这是因为β-转角通常伴随着β-折叠结构的形成而出现, 且前者比后者更容易: β-折叠结构的生成需要较大范围内的分子链调整, 而β-转角只需要松散发卡环上面的4个氨基酸残基作小范围的调整^[14].

  图 3

  

  图 3.  支架在1400~1750 cm^-1(A)和600~1000 cm^-1(B)的红外谱图. (a) RBSF; (b) 1:9; (c) 3:7; (d) 5:5; (e) 7:3

  Figure 3.  Infrared spectra of RBSF scaffold (a) and the RASF/RBSF blend porous scaffolds: (b) 1:9; (c) 3:7; (d) 5:5; (e) 7:3. (A: 1400~1750 cm^-1 and B: 600~1000 cm^-1)

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  随着RASF的加入, 共混支架在966 cm^-1处出现了与柞蚕丝蛋白中寡聚丙氨酸片段相关的代表性尖峰^[13] (图 3B).同时, 在620 cm^-1处显现的特征峰则提示共混支架中α-螺旋结构的含量随RASF组分的增多而提高, 这同样是由于柞蚕丝蛋白中特有的寡聚丙氨酸片段倾向于形成α-螺旋结构所致.

  2.3   RASF/RBSF多孔支架材料的吸水率

  由于细胞生长在水环境中, 因此组织工程材料要求具有一定的吸水和保水能力, 有助于细胞迅速进入支架内部, 从而为其粘附和生长奠定基础.从图 4A中可以看出, RASF添加量由0增加到70%时, 所制备的多孔支架的吸水量由17 g•g^-1增至23 g•g^-1, 湿态下支架的含水率均在95%左右(图 4B).这说明实验制备的多孔支架在经过一段时间后能达到吸水平衡, 并且由于丝蛋白本身的亲水性和多孔结构, 支架具有较强的吸水能力.其中, 纯RBSF支架和1:9支架吸水量和含水率较低, 分别为17.3±1.3 g•g^-1、16.5±1.5 g•g^-1和94.5%±0.3%、94.3%±0.4%;而5:5共混支架的吸水量和含水率较高, 分别为22.6±1.8 g•g^-1和96.0%±0.4%, 这充分说明了具有多连通孔洞的丝蛋白共混支架保水量更高.

  图 4

  

  图 4.  支架的吸水量(A)和含水率(B) (n≥5)

  Figure 4.  Water uptake (A) and water content (B) of the porous scaffolds (n≥5)

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  2.4   RASF/RBSF多孔支架材料的热性能

  通过热重分析可以考察不同配比组成的丝蛋白共混支架材料热稳定性, 结果图 5所示.纯RBSF支架主要经历一次热降解过程, 对应的最大热分解速率为320 ℃, 1:9支架与其类似.当RASF含量增至30%时, 共混支架开始出现两个阶段的分解:第一阶段出现在250 ℃至360 ℃, 样品重量急剧下降; 第二阶段发生在360 ℃至420 ℃, 两阶段的最大热分解速率分别发生在330 ℃和380 ℃.随着RASF含量的增加, 这一现象更加明显, 并且第一阶段所占的热分解比重逐渐下降, 而第二阶段所占比重逐渐上升, 说明前一阶段的分解主要来自于RBSF, 后一阶段则主要是RASF的分解.由于RASF最大热分解速率的对应温度高于RBSF, 因此RASF的引入使得共混支架的热稳定性较纯RBSF支架有所提高.

  图 5

  

  图 5.  支架在0~500 ℃间的DTG图

  Figure 5.  DTG thermogram of the porous scaffolds between 0 and 500 ℃

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  2.5   RASF/RBSF多孔支架材料湿态下的力学性能

  对于理想的组织工程支架材料而言, 其必须具有足够的强度来适应所修复组织的力学性能, 同时支撑细胞的生长、增殖和分化, 因此力学性能是评价组织工程支架材料的重要指标之一.另外, 实际应用中支架材料通常会和体液接触, 因而湿态下的力学性能更反映实际应用的需求.

  表 1列出了纯RBSF支架和共混支架在湿态下的压缩强度和压缩模量, 从中可以看出, 纯RBSF支架的压缩强度最大, 约为280 kPa, 而10 wt%的RASF的加入就使得支架强度下降约30%.随着RASF含量的进一步增加, 共混支架的强度下降更为明显, 7:3支架的压缩强度和模量仅分别为100 kPa和180 kPa左右, 但此性能仍能满足一定场合如用于血管修复(猪主动脉的弹性模量约为1~60 kPa^[15])等的使用要求.无论如何, 为了获得具有一定力学强度的支架材料, 选择合适的RASF含量来制备共混支架非常重要.

  表 1

  

  表 1  不同RASF含量的支架在湿态下的力学强度(n≥4)

  Table 1.  Comparison of mechanical properties of RBSF scaffold and the RASF/RBSF blend porous scaffolds at wet state (n≥4)

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  样品(RASF:RBSF)	压缩强度/kPa	压缩模量/kPa
  0:10	281±34	459±85
  1:9	196±38	314±111
  3:7	122±17	282±89
  5:5	115±19	198±85
  7:3	105±29	184±56

  2.6   RASF/RBSF多孔支架材料的生物相容性

  我们所制备的丝蛋白共混支架材料不仅具有相连的微孔和大孔结构, 并且在湿态下具有一定的力学强度, 这为进行细胞相容性实验提供了基础.实验中使用小鼠MC3t3-E1成骨细胞和L929成纤维细胞来考察丝蛋白支架的生物相容性, 并采用Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)比色法绘制了两种细胞分别在不同丝蛋白配比的支架材料上的增长曲线.

  从所得到的细胞增殖曲线中(图 6 A)可以看出, 在总计10 d的培养过程中, MC3t3-E1细胞在五种支架上都能粘附、生长和增殖, 说明支架无明显的细胞毒性.在培养初期, 细胞在五种支架上生长情况相似, 而在培养6天时, 5:5和7:3这两种共混支架上的细胞数多于另外三种, 当培养时间延长至第10天时, 差异更加明显, 这表明5:5和7:3共混支架上的细胞增殖速率高于纯RBSF支架上的, 并且1:9和3:7共混支架的细胞数目也略高于纯RBSF支架.在图 6B的L929成纤维细胞增长曲线上观察到了同样的现象.

  图 6

  

  图 6.  CCK-8测试法获得MC3t3-E1 (A)和L929 (B)细胞在支架上的增长曲线

  Figure 6.  CCK-8 assay of the adhesion and proliferation of MC3t3-E1 (A) and L929 (B) cultured on SF based scaffolds

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  我们推测, 这一方面是由于RASF中的RGD序列与细胞表面的整联蛋白识别并发生作用, 更促进细胞的粘附和生长; 另一方面在图 2中的支架形貌图中可以看出, 5:5和7:3这两种支架具有多级孔结构和更高的孔连通率, 因此有利于营养物质的输送和代谢产物的排出.因此, 共混支架较纯RBSF支架有更高的细胞增殖效率.

  3.   结论

  通过将质量浓度一致的再生柞蚕丝蛋白和再生桑蚕丝蛋白水溶液进行不同比例的混合, 以共混溶液为基础, 采用正丁醇诱导和冻融的方法, 能成功制备出具有结构可塑性和足够力学性能的RASF/RBSF共混多孔支架.进一步的研究表明, 随着RASF含量的提高, 尽管共混支架的力学性能有所下降, 但吸水能力增强、热稳定性上升, 更重要的是细胞在其上的增殖速率明显加快, 是一种极具潜力的组织工程用支架材料.

  4.   实验部分

  4.1   再生丝蛋白溶液的制备

  由于NaHCO₃处理的柞蚕丝极难被溶解, 本工作中采用Na₂CO₃对柞蚕茧进行脱胶, 即10 g柞蚕茧在100 ℃下煮沸的Na₂CO₃沸水溶液中脱胶30 min(两次), 然后将脱胶丝用热水浸洗三次再用去离子水冲洗, 最后于50 ℃烘箱内放置24 h恒重. 100 ℃下将脱胶丝溶于7 mol•L^-1硝酸钙水溶液中3 h, 4 ℃下去离子水透析三天, 离心除杂后, 再用10 wt%的聚乙二醇水溶液浓缩得到浓度为6 wt%的再生柞蚕丝蛋白水溶液.再生桑蚕丝蛋白水溶液制备方法参见文献^[16].

  4.2   再生柞蚕丝蛋白/桑蚕丝蛋白多孔支架的制备

  将浓度约为6 wt%的RASF和RBSF的水溶液, 分别以0:10、1:9、3:7、5:5和7:3 (RASF:RBSF)不同比例混合后, 按文献报道方法制备支架^[9], 简言之, 将共混后的再生丝蛋白水溶液在20 ℃低速搅拌下, 按添加量为1:2 (volume ratio of 1-butanol to solution)逐滴加入正丁醇, 形成乳液在低速搅拌下稳定2 min.将混合乳液导入模具中, 在-20 ℃冰箱冷冻24 h.室温下解冻, 去离子水漂洗多次除去正丁醇, 即得到多孔支架.

  4.3   样品的测试和表征

  将多孔支架切成小片后冰冻干燥, 然后在液氮中脆断, 并用导电胶固定在样品台上, 采用TS 5136MM可变真空扫面电子显微镜对断面形貌进行观察, 测试电压为20 kV.试样在观察前进行喷金90 s处理.

  将多孔支架在去离子水中浸泡24 h, 取出后用滤纸小心吸除表面多余的水, 称重得到支架湿态下重量W_w.经80 ℃烘箱烘干至恒重后, 称量的支架干态重量W_d.则支架的吸水量(water uptake)和含水率(water content)通过如下公式计算得到:

  吸水量＝(W_w—W_d)/W_d

  含水率(%)＝[(W_w—W_d)/W_w]×100%

  每组样品不少于5个, 并统计平均, 以mean±SD表示.

  样品冻干压片后, 进行红外光谱测试.采用傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet 6700 FTIR spectrometer), 配备液氮冷却的碲镉汞探测器, 全反射附件.

  冻干后的支架置于真空干燥箱3 d后经40 ℃烘箱低温干燥1 d后, 采用瑞典Mettler Toledo公司的TGA/ SDTA851型热重分析仪进行测试, 氮气气氛, 流速40 mL•min^-1.

  多孔支架的力学性能在Instron 5565电子万能材料试验机上测试, 传感器为500 N, 样品切割成厚度约为5 mm, 直径约为15.6 mm的圆柱体, 样品的实际厚度由试验机直接测出(预压0.05 N), 压缩速率5 mm•min^-1, 压缩应变60%, 在水浴中测试多孔支架的压缩力学性能.每组样品不少于4个, 并统计平均, 以mean±SD表示.

  采用CCK-8法, 以MC3t3-E1小鼠成骨细胞和L929成纤维细胞对多孔支架的生物相容性进行测试.分别在细胞培养的第1、3、6和10 d将24孔板的培养基取出, 细胞/支架复合物经PBS漂洗三遍后, 向其中加入500 μL CCK8/MEMα(或DMEM)混合溶液(50 μL CCK8溶液溶于450 μL MEMα/DMEM), 置于二氧化碳培养箱培养2~4 h, 取出.采用酶标仪(BIO-TEK ELX800)于波长450 nm处读取每孔溶液的吸光度值, 以3~4个平行测量样品的结果求平均值并绘制细胞生长曲线.需要指出的是, 由于实验中发现丝蛋白对试剂盒有一定的吸附作用, 故尽管在细胞实验中采用了尺寸基本一致的支架以使其吸收量相近, 但我们仍认为本实验中采用CCK8法在测试共混支架上细胞生长情况时只是半定量的结果.

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  图 1  湿态下由模具决定宏观形貌的RBSF和RASF/RBSF共混支架

  Figure 1  Photographs of RBSF and RASF/RBSF blend porous scaffolds with different shapes

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  图 2  支架的断面图. (A1)(A2) RBSF; (B1)(B2) 1:9; (C1)(C2) 3:7; (D1)(D2) 5:5; (E1)(E2) 7:3

  Figure 2  SEM images of fracture sections of the porous scaffolds. (A1)(A2) RBSF; (B1)(B2) 1:9; (C1)(C2) 3:7; (D1)(D2) 5:5; (E1)(E2) 7:3

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  图 3  支架在1400~1750 cm^-1(A)和600~1000 cm^-1(B)的红外谱图. (a) RBSF; (b) 1:9; (c) 3:7; (d) 5:5; (e) 7:3

  Figure 3  Infrared spectra of RBSF scaffold (a) and the RASF/RBSF blend porous scaffolds: (b) 1:9; (c) 3:7; (d) 5:5; (e) 7:3. (A: 1400~1750 cm^-1 and B: 600~1000 cm^-1)

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  图 4  支架的吸水量(A)和含水率(B) (n≥5)

  Figure 4  Water uptake (A) and water content (B) of the porous scaffolds (n≥5)

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  图 5  支架在0~500 ℃间的DTG图

  Figure 5  DTG thermogram of the porous scaffolds between 0 and 500 ℃

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  图 6  CCK-8测试法获得MC3t3-E1 (A)和L929 (B)细胞在支架上的增长曲线

  Figure 6  CCK-8 assay of the adhesion and proliferation of MC3t3-E1 (A) and L929 (B) cultured on SF based scaffolds

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  表 1  不同RASF含量的支架在湿态下的力学强度(n≥4)

  Table 1.  Comparison of mechanical properties of RBSF scaffold and the RASF/RBSF blend porous scaffolds at wet state (n≥4)

  样品(RASF:RBSF)	压缩强度/kPa	压缩模量/kPa
  0:10	281±34	459±85
  1:9	196±38	314±111
  3:7	122±17	282±89
  5:5	115±19	198±85
  7:3	105±29	184±56

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