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纳米荧光探针用于核酸分子的检测及成像研究

杨立敏 ,  刘波 ,  李娜 ,  唐波

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引用本文: 杨立敏, 刘波, 李娜, 唐波. 纳米荧光探针用于核酸分子的检测及成像研究[J]. 化学学报, 2017, 75(11): 1047-1060. doi: 10.6023/A17080353 shu
Citation:  Yang Limin, Liu Bo, Li Na, Tang Bo. Fluorescent Nanoprobe for Detection and Imaging of Nucleic Acid Molecules[J]. Acta Chimica Sinica, 2017, 75(11): 1047-1060. doi: 10.6023/A17080353 shu

纳米荧光探针用于核酸分子的检测及成像研究

  • 山东师范大学化学化工与材料科学学院 济南 250014

    • 作者简介: 杨立敏, 山东师范大学化学化工与材料科学学院在读博士研究生, 主要从事功能纳米探针的构建及细胞内应用研究工作;
    刘波, 山东师范大学化学化工与材料科学学院2016级在读硕士生, 2016年获山东师范大学化学工程与工艺学士学位, 研究方向为纳米荧光探针的合成及其生物应用;
    李娜, 2009年于山东大学获得博士学位, 随后在加拿大McMaster大学进行1年博士后研究工作.回国后在山东师范大学任教.现为山东师范大学物化教研室主任, 教授, 博士生导师, 国家优青, 山东省杰青, 泰山学者青年专家.长期从事新型纳米荧光探针的设计、合成及可视化成像的研究.2014年获得"山东师范大学十佳优秀教师"称号, 2015年被评为"山东省优秀学士学位论文指导教师", 2016年被评为"齐鲁最美青年";
    唐波, 1994年毕业于南开大学化学系, 获理学博士, 山东师范大学校长、党委副书记, 化学化工与材料科学学院教授、博士生导师, 首届十佳全国优秀科技工作者提名奖获得者, 973计划首席科学家, 国家杰出青年科学基金获得者, "新世纪百千万人才工程"国家级人选.现主要从事分子及纳米荧光探针的合成及其在生物成像中的应用、绿色化工、荧光材料合成及太阳能化学转化与储存等方面研究工作.荣获山东省自然科学奖一等奖1项, 申请国家发明专利44项, 已授权31项; 荣获国家科技进步奖二等奖2项, 山东省科技进步奖一等奖2项、技术发明奖一等奖1项;
    通讯作者: 李娜, E-mail: lina@sdnu.edu.cn; 唐波, E-mail: tangb@sdnu.edu.cn
  • 基金项目:

    项目受973计划（No.2013CB933800）、国家自然科学基金（Nos.21390411，21535004，21422505，21375081，21505087）、山东省杰出青年科学自然科学基金（No.JQ201503）资助

摘要: 核酸，包括脱氧核糖核酸和核糖核酸，在生物的生长、发育、突变、炎症、癌症等正常或异常的生命活动中发挥着重要的作用，它们的异常表达与多种疾病的发生、发展也密切相关.因此，发展准确、有效的方法实现核酸分子的检测，对深入探究核酸的功能调控以及相关疾病的早期检测与治疗都具有重要的意义.荧光检测法与荧光成像技术具有灵敏度高、时空分辨率高等优点，为实时、准确的检测核酸分子提供了有力的工具.本文着重综述了近年来发展的纳米荧光探针用于疾病相关核酸分子的检测与细胞和活体成像工作的研究进展，最后提出了进一步构建新型纳米荧光探针用于核酸检测面临的挑战、未来发展方向与展望.

English

  • 1.   引言

    核酸, 包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA).其中, DNA是生物体重要的遗传物质、遗传信息的携带者和基因表达的物质基础.带有编码蛋白质的DNA片段称为基因, 支持着生命的基本构造和性能; 另外一些DNA序列直接发挥作用或者参与调控遗传信息的表达. DNA在细胞分化、生物发育、突变、癌变等生命活动中起着非常重要的作用[1].例如, 癌症病人会释放DNA到血液中, 并在血液中循环; 而循环DNA水平的变化与肿瘤的负荷和恶性进展密切相关[2].

    RNA包括mRNA、tRNA、microRNA (miRNA)和小分子RNA.其中, mRNA是携带遗传信息的单链核糖核酸, 能指导蛋白质的合成.目前, 与肿瘤相关的mRNA已被广泛用作特异性标志物来评估局部或血液中肿瘤细胞的迁移, 其表达水平的变化与肿瘤的发生、发展有着密切的关系[3]. MiRNA是一类非编码小分子RNA, 可直接调节至少30%的基因.它们在转录后水平上调控mRNA的降解从而抑制蛋白质的表达[4].已经研究证明miRNA参与增殖、分化、衰老、迁移和凋亡等大部分生物学过程, 以及癌症、白血病、糖尿病等多种疾病的发生发展过程[5].

    由上可见, 核酸分子与影响人类健康的各种疾病都密切相关且发挥着重要的作用.因此, 对其进行灵敏、有效的检测, 在药物筛选、临床诊治和预后评估等方面都具有非常重要的意义.目前核酸分子检测的分析方法主要有荧光检测法、电化学方法、酶检测法、光电化学法、实时定量PCR、微阵列和比色法等[6~12].其中, 荧光检测法具有选择性好、灵敏度高等优点, 已经被广泛用于疾病相关核酸分子的检测.同时结合具有高时空分辨、高灵敏度特点的荧光成像技术[13], 可以在细胞层面实现无损、高灵敏度的核酸分析检测及成像.

    纳米荧光探针具有生物相容性好、易于进行化学和生物学修饰等优点[14], 在分析化学、生物学和医学等领域引起了人们极大的关注.尤其是近几年来, 纳米荧光探针已经被广泛用于核酸分子的检测, 有力地推动了人们进一步了解核酸在疾病的发生与发展中所发挥的作用.本文系统综述了近年来发展的纳米荧光探针在DNA、mRNA和miRNA检测方面取得的研究成果和进展.并在构建新型纳米荧光探针、深入剖析核酸的功能等方面进行了探讨与展望.

    2.   检测核酸分子的纳米荧光探针的设计策略

    2.1   基于金纳米粒子(AuNPs)的纳米荧光探针

    基于AuNPs的荧光纳米探针用于核酸的检测是目前常用的策略之一, 主要有两种方法.如图 1A所示, 第一种方法是将特异性识别靶标核酸分子的分子信标(MB, 一端连接巯基, 一端连接染料)通过金-硫键(Au-S)组装到AuNPs表面.此时, 染料靠近AuNPs表面, 荧光被猝灭.当靶标核酸分子出现时, 与MB杂交将其茎环结构打开, 染料远离AuNPs后荧光恢复.第二种方法是纳米火焰法(图 1B).其设计原理是通过Au-S作用在AuNPs表面修饰与靶标核酸分子能特异性识别的寡核苷酸(识别链), 并与修饰有荧光染料的短链DNA(报告链)杂交, 此时由于报告链靠近AuNPs的表面, 荧光处于猝灭状态.在靶标核酸分子存在时, 与识别链结合形成更长、更稳定的双链, 释放报告链并远离AuNPs, 染料的荧光恢复.通过荧光强度的变化实现对核酸分子的检测.改变AuNPs表面修饰MB、识别链和报告链的种类, 可以实现多种核酸分子的同时检测.

    图 1

    图 1.  基于AuNPs的荧光纳米探针用于核酸检测的示意图
    Figure 1.  A design strategy of fluorescent nanoprobe for detection of nucleic acids based on AuNPs
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    2.2   基于氧化石墨烯(GO)、聚多巴胺(pDA)和单壁碳纳米管(SWNT)等通过π-π作用制备的纳米荧光探针

    基于GO的荧光纳米探针用于核酸的检测是另一种常用的策略.通常来讲, 基于GO的纳米荧光探针设计原理是通过π-π作用将修饰荧光染料的单链DNA (ssDNA)(图 2A)或发夹DNA(图 2B)吸附到GO的表面, 此时染料的荧光被GO猝灭.当靶标核酸分子存在时, 与发夹DNA或ssDNA杂交形成双链, 并远离GO表面, 导致染料的荧光恢复, 实现对目标核酸分子的检测.通过改变发夹DNA或ssDNA的种类, 可实现多种核酸分子的同时检测.同时, 在这个体系中引入一些辅助核酸探针, 可以实现对核酸的放大检测.其他材料, 如pDA和SWNT的设计原理与GO是相同的.

    图 2

    图 2.  基于GO的荧光纳米探针用于核酸检测的示意图
    Figure 2.  The design strategy of fluorescent nanoprobe for detection of nucleic acids based on GO
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    2.3   基于其它材料的纳米荧光探针

    选择纳米材料作为载体或者猝灭剂, 如DNA四面体、二氧化锰(MnO2), 然后通过物理吸附或者共价连接能够识别靶标分子的DNA检测探针, 猝灭其表面修饰染料的荧光.当靶标核酸分子存在时, 与DNA检测探针杂交形成双链后荧光恢复.

    另外一些荧光纳米探针的设计是基于荧光共振能量转移(FRET)原理.在靶标核酸分子不存在时, 供体染料分子和受体染料分子距离较远, 不能发生FRET, 此时供体处于强荧光状态, 而受体处于弱荧光状态.当靶标核酸分子存在时, 与检测探针结合后, 使得供体染料分子和受体染料分子之间的距离拉近, 发生FRET, 供体荧光减弱, 受体荧光增强, 以此达到检测的目的.

    除了使用商业化的染料标记核酸检测序列, 一些具有发光性质的纳米材料与检测探针结合, 如上转换纳米粒子、发光金纳米簇、发光银纳米簇和聚集诱导发光的分子等, 也可以利用其荧光信号变化实现核酸分子的检测.

    3.   荧光纳米探针用于外源性核酸分子的检测

    3.1   检测外源性DNA分子的纳米荧光探针

    3.1.1   检测一种外源性DNA分子的纳米荧光探针

    SWNT作为一种荧光猝灭材料, 可以猝灭不同荧光团的荧光.杨荣华和谭蔚泓等[15]基于SWNT和寡核苷酸设计了一种荧光纳米探针, 用于识别检测特定的DNA.修饰荧光染料的发夹DNA通过π-π堆叠作用吸附到SWNT表面, 此时荧光染料的荧光被猝灭.当靶标存在时, 与发夹DNA杂交形成双链, π-π堆叠作用减弱从而远离SWNT, 荧光增强, 实现对DNA的检测.并且与传统上“茎-环”结构的分子信标相比, 这种探针只需要在发夹DNA的一端修饰荧光染料, 极大地提高了信噪比.

    GO也是具有良好猝灭性质的纳米材料.王愈聪等[16]基于GO和双链特异性核酸酶(DSN)建立了一种恒温信号放大方法用于miRNA的高灵敏度检测.染料修饰的ssDNA吸附在GO表面时, 荧光处于猝灭状态.当加入靶标miRNA分子后, 与ssDNA形成DNA/RNA杂合结构, 然后DNA/RNA中的DNA被DSN水解, 释放miRNA再次与GO表面其它未被水解的ssDNA探针结合.数次循环后荧光信号被放大, 实现了对靶标miRNA的灵敏检测.

    贾春平等[17]基于荧光纳米金探针和基因芯片杂交发展了一种检测DNA的方法.在荧光纳米金表面修饰两种DNA探针:一种为起信号放大作用的带有Cy5荧光分子的信号探针, 另一种为与靶DNA一部分序列特异性识别的探针.当靶标DNA分子存在时, 芯片上的捕捉探针(可以与靶DNA的另一部分识别)通过碱基互补配对结合靶标DNA分子, 将荧光探针固定在芯片上, 形成一种“三明治”结构.通过检测信号探针上荧光分子的信号强度的变化实现对DNA的检测.

    Hoechst33258荧光染料与ssDNA作用时不产生荧光或荧光很弱, 而与dsDNA作用时荧光增强.基于这一原理, 何治柯等[18]将待测ssDNA与互补ssDNA杂交形成dsDNA, 实现了Hoechst染料对DNA的检测.将互补ssDNA与目标ssDNA杂交形成dsDNA, 然后加入hoechst溶液.由于Hoechst33258荧光染料与dsDNA的A/T碱基对特异结合, 使得溶液产生强烈的荧光.当ssDNA的碱基序列及含量不同时荧光强度也不同, Hoechst能与DNA特异性地结合, 与DNA中T/A碱基对结合显荧光, 而与C/G碱基作用无荧光, 由此建立检测ssDNA的方法.

    朱邦尚和朱新远等[19]基于共轭高分子复合物的能量转移设计了一种非标记DNA检测探针, 用于区分完全互补配对、双碱基错配和非完全互补配对的目标DNA.分别采用交叉偶联和氧化加成聚合方法制备了水溶性的阳离子共轭聚合物与阴离子共轭聚合物, 二者通过静电作用形成高分子复合物, 阳离子聚合物的荧光发射光谱同阴离子聚合物的紫外吸收光谱有较大的重叠, 能够实现能量共振转移.当加入负电性的DNA探针后, 由于存在竞争性抑制作用, 共轭聚合物给体和受体之间的能量转移效率降低; 当再次加入目标DNA后, 形成dsDNA, 电荷密度增加, 能量转移效率再次降低.利用共轭高分子复合物之间的能量共振转移, 实现了非标记的DNA检测.

    基于DNA序列可以诱导银纳米簇(AgNCs)的荧光发生变化这一原理, 李峰课题组[20]实现了对目标DNA的检测(图 3).在绿色荧光AgNCs序列的5'端连接一段特殊的DNA片段(5'-CACCGCTTT-3'), 可将绿色荧光AgNCs序列转化为红色荧光AgNCs序列, 其中(5'-CACCGC-3')在AgNCs荧光转化中发挥主要诱导作用, 该诱导序列与绿色AgNCs序列之间的间距对AgNCs荧光转化效率影响显著.基于上述荧光转化机制, 设计制备了一种新型比率荧光AgNCs的MB.该MB在目标物的诱导下发生构象变化, 进而导致AgNCs的红-绿荧光转化.通过计算红-绿荧光强度的比值, 可实现目标DNA序列的高灵敏荧光比率分析.

    图 3

    图 3.  基于目标诱导的模板转换策略检测DNA的示意图.[原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 3.  Illustration of DNA detection based on target-induced template transformation strategy. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    3.1.2   检测两种外源性DNA分子的纳米荧光探针

    实现DNA的高灵敏检测是科研工作者的重要目标之一. Willner课题组[21]基于GO和荧光修饰的DNA设计了一种生物传感器用于DNA的放大检测. GO上吸附了修饰有两种不同染料的ssDNA, 此时染料的荧光处于猝灭状态; 当靶标DNA分子存在时, 两条ssDNA分别和靶标分子结合, 导致荧光恢复.当核酸外切酶Ⅲ存在时, 又会切断带有荧光染料的一段DNA, 释放靶标DNA分子, 使之能够循环, 再次和GO上的DNA链反应, 实现了DNA的放大检测(图 4).这种探针的设计通过靶标DNA分子的循环, 实现了对低浓度DNA的检测.

    图 4

    图 4.  基于GO的平台用于DNA放大检测的多重分析. [原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 4.  Amplified multiplexed analysis of DNA based on GO platform. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    3.1.3   检测三种外源性DNA分子的纳米荧光探针

    将AuNPs与多种MB结合, 可以实现多种DNA分子的同时检测.因此, 樊春海和李根喜等[22]制备了多色纳米信标实现了多种DNA分子的检测.在三种MBs的一端连接不同的荧光基团, 并通过Au-S作用将三种MBs连接在AuNPs上, 此时, 染料的荧光被AuNPs猝灭.然后将短的“辅助”DNA修饰在AuNPs表面, 提高纳米信标的稳定性.当靶标DNA分子存在时, 打开MB, 使染料远离AuNPs的表面, 荧光恢复.该纳米信标具有高的特异性识别能力, 能够实现同时检测三种DNA.

    利用GO能够同时猝灭不同染料标记的多个DNA探针的性质, 樊春海和方海平等[23]制备了多色荧光DNA纳米探针, 通过GO和DNA分子之间的相互作用来快速、灵敏和选择性地检测均质溶液中的DNA靶标分子.由于GO的猝灭效应非常高, 修饰染料的ssDNA探针显示出很弱的背景荧光, 而当与特定DNA靶标分子形成双螺旋结构时, 观察到强烈的荧光信号, 实现了在相同溶液中同时检测多个DNA靶标分子.

    2013年, Willner课题组[24]基于核酸功能化修饰的银纳米团簇(AgNCs)和GO组成的复合系统实现了病原体DNAs的多元分析.使用了两种核酸稳定AgNCs:红外发射和近红外发射的AgNCs. ssDNA稳定的AgNCs吸附到GO表面时, 荧光被猝灭.与靶标DNA结合后, 远离GO, AgNCs的荧光恢复, 实现了HBV、HIV和梅毒的多重基因分析(图 5).

    图 5

    图 5.  DNA为模板的AgNCs/GO传感平台用于靶分子DNAs的检测.[原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 5.  Using DNA-templated AgNCs/GO hybrids as sensing platform for target DNAs detection. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    于然波和黄岭等[25]基于二维材料石墨炔纳米片(GD NSs)实现了三种靶标DNA分子的同时检测.由于石墨炔与DNA的结合力比石墨烯与DNA的结合力强, GD NSs能够完全猝灭三种不同染料标记的ssDNA的荧光.存在相对应的目标DNA时, 形成了dsDNA, 导致染料标记的DNA探针从GD NSs的表面释放下来, 相应的荧光信号得以恢复, 从而实现同时检测三种DNA靶标分子.

    3.2   检测外源性miRNA分子的纳米荧光探针

    3.2.1   检测一种外源性miRNA分子的纳米荧光探针

    miRNA具有易降解, 细胞内含量低等特点, 因此实现miRNA的高灵敏检测面临着很大的挑战.邢达课题组[26]基于GO/嵌层染料荧光发夹探针(HP)和等温聚合反应提出了一种免标记的、多重放大的方法来实现microRNA-21 (miRNA-21)的检测.当miRNA-21存在时, 与HP杂交形成双链结构, 之后激活等温聚合反应, 实现对信号的第一次放大.在与GO/嵌入染料孵育时, 形成的DNA复合物与高亲和力染料相互作用, 然后从GO表面脱离, 伴随着荧光恢复, 实现了第二次的信号放大.这种多重放大的策略实现快速、高选择性和高灵敏度的检测miRNA-21.

    2012年, 何农跃和张立明等[27]基于GO猝灭染料修饰ssDNA的荧光这一原理设计了一种纳米探针实现了快速检测miRNA.同时, 蔡称心和吴平等[28]基于AuNPs的荧光猝灭作用和发夹DNA的构象转换, 建立了检测microRNA-122的策略.利用GO的猝灭作用和内切酶位点特异性切割作用, 他们又实现了microRNA-126 (miRNA-126)高灵敏度、高选择性的检测[29].将修饰染料的ssDNA通过吸附作用修饰在GO的表面, 此时染料的荧光被GO猝灭.在miRNA-126的存在下, miRNA-126与ssDNA部分杂交, 使得修饰染料的一端序列形成双链并脱离GO.然后在内切酶的作用下, 双链的一端被切下, 荧光恢复, 实现在几种不同的细胞中快速评估miRNA-126的含量.

    同时, 李正平和刘成辉等[30]基于杂交链式反应(HCR)和GO表面固定的手段, 提出了一种无酶信号放大策略实现miRNA的灵敏检测.设计了两种茎环结构的DNA探针(H1*和H2*), 并在H1*和H2*的一端修饰荧光染料.没有靶标miRNA存在时, 加入GO后, H1*和H2*会吸附在GO的表面, 导致染料的荧光被猝灭.当靶标miRNA存在时, 引发HCR形成长链dsDNA结构.加入GO后, HCR产物一端的ssDNA吸附在GO表面, 但其长链dsDNA由于DNA双链的刚性结构却远离了GO表面, 从而产生较强的荧光信号, 基于此实现了miRNA的灵敏检测(图 6).

    图 6

    图 6.  用于检测miRNA的HCR/GO平台的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 6.  HCR/GO platform for detection of miRNA. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    结合等温指数扩增技术, 叶邦策和尹斌成等[31]设计了一种温和的、无标记的荧光纳米探针用于miRNA的定量检测.利用具有五个区域(AXAXB)的单分子DNA寡聚体作为扩增模板, 聚合酶和核酸内切酶作为激活剂, 将miRNA靶标作为触发剂.两个重复的A区域是靶标T的结合序列.两个重复的X区域是核酸酶内切识别位点. B区是合成荧光Cu纳米簇的序列.在靶标miRNA存在下, 通过A与miRNA的杂交来启动等温指数扩增反应.然后, 可以在聚合酶/三磷酸脱氧核糖核苷酸的存在下扩展部分DNA双螺旋, 得到具有用于核酸内切酶的两个识别位点的稳定的双链DNA.第一识别位点的切割导致二级聚合循环的引发, 第二识别位点的切割导致大量寡核苷酸R的合成.扩增后, 所得R与另外的cDNA杂交(与R互补)以通过抗坏血酸还原铜离子形成荧光双链DNA-Cu纳米簇的DNA双链模板.通过检测dsDNA-Cu纳米簇形成的荧光强度可以定量miRNA的含量.

    利用双链特异性核酸酶可以水解异源双链核酸分子的DNA链这一原理, Pompa和Fiammengo等[32]发展了一种荧光探针, 实现了miRNA的直接绝对定量.荧光标记的ssDNA连接在PEG修饰的AuNPs表面, 此时染料的荧光被猝灭; 当靶标miRNA存在时, miRNA与ssDNA杂交形成DNA-RNA异源双链核酸分子, 接着在双链特异性核酸酶作用下水解异源双链核酸分子的DNA链, 染料分子远离AuNPs表面, 导致荧光恢复.根据荧光强度值就可以对miRNA绝对定量.并且, 在这个过程中靶标miRNA保持完整, 可以循环使用, 实现信号放大.这种策略可以用于从细胞中提取的总RNA样品中miRNA-203和miRNA-21的直接定量.

    GO具有保护miRNA, 防止其被酶降解的作用.唐波课题组[33]结合这一原理与环状指数扩增反应发展了一种精确的、灵敏的检测miRNA的方法(图 7).首先, 目标靶分子miRNA吸附在GO表面后, 可有效防止其被酶切降解.然后, miRNA与部分互补的发夹DNA杂交后启动链取代反应, 形成复合双链结构.在切口酶的作用下, 大量的DNA Trigger序列被释放.释放的DNA Trigger继续与发夹DNA杂交, 启动下一个循环.通过重复的杂交、延伸、酶切和DNA Trigger的释放, 完成环状指数扩增.释放的DNA Trigger作为下一轮扩增的引物更加稳定, 能够更好的在反应中持续进行.无限循环后形成大量的dsDNA结构. SYBR Green I嵌入双链DNA后发出强烈的荧光信号. miRNA的浓度越大, 形成的dsDNA越多, 加入SYBR Green I (SG)后荧光越强, 以此实现对miRNA检测的目的.基于GO保护的目标靶分子miRNA的环状指数扩增反应展现了很好的特异性, 能够区分单核苷酸的不同, 能够灵敏的定量检测miRNA到10.8 fM.同时对人类肺细胞miRNA进行了定量检测.

    图 7

    图 7.  基于GO荧光开关协同放大检测目标miRNA的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 7.  Detection of target miRNA Based on GO fluorescence switch cooperative amplification. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    程国胜课题组[34]利用AuNPs的高猝灭荧光效率实现了miRNA-205的灵敏检测.首先制备了粒径为10和20 nm的AuNPs, 并研究发现相比于商业化的猝灭剂BHQ2, 它们对Cy3染料具有更高的猝灭效率.然后将一段与靶标miRNA互补并用Cy3修饰的DNA探针固定在玻璃基底表面, 在AuNPs表面修饰两条DNA序列, DNA1和DNA2, 其中, DNA1是与靶标分子能够竞争的序列, DNA2用来稳定AuNPs.当靶标分子不存在时, DNA1和DNA2修饰的AuNPs与DNA探针杂交, 猝灭Cy3的荧光; 当靶标分子存在时, 先与DNA探针结合, 使得DNA1和DNA2修饰的AuNPs不能与DNA探针杂交, 此时Cy3呈现高的荧光信号实现了miRNA-205的灵敏检测, 检测限达到了3.8 pM.同时, 该方法表现了良好的特异性, 实现了对人血清中的miRNA-205的含量的检测.

    基于等温指数放大策略、SG选择性嵌插dsDNA产生强荧光信号和GO吸附单链核酸并保护miRNA免受酶水解的独特性质, 李峰课题组[35]构建了免标记荧光生物传感平台, 实现了便捷、高灵敏的检测miRNA. GO能够保护miRNA免受酶水解, 当目标miRNA存在时, 发夹DNA与之杂交而被打开, 随之发生的DNA聚合与链置换反应, 引发了后续的目标物循环过程.由此产生的dsDNA被内切酶识别并切断, 产生与目标miRNA具有相同序列的触发DNA, 进而引发新的链增长过程, 实现了目标miRNA的循环等温指数放大.当SG嵌插入形成大量的dsDNA后, 检测到显著增强的荧光信号, 从而实现miRNA的高灵敏检测, 检测限为3 fM.由于采用了免标记策略, 避免了昂贵且繁琐的标记过程, 因此该方法还具有简单、成本低等突出优点.

    3.2.2   检测两种外源性miRNA分子的纳米荧光探针

    在很多病理学过程中, 往往是多种miRNAs同时发挥着作用.因此, 实现多种miRNAs的同时检测具有非常重要的意义.宓现强和左小磊等[36]基于石墨烯量子点和芘修饰的MB探针用于检测miRNAs.在两种MB的两端分别修饰染料和芘分子, 芘分子通过π-π作用修饰在石墨烯量子点的表面, 使得MB的染料与石墨烯量子点距离足够近从而能够发生FRET, 导致染料分子荧光增加.当靶标miRNA分子存在时, 相应的MB被打开形成刚性的双链结构.此时, 染料分子远离石墨烯量子点, FRET被阻碍, 染料分子荧光降低.通过荧光强度的改变来达到检测两种miRNA的目的.该体系具有高特异性, 良好的稳定性, 实现了对miRNA浓度从0.1到200 nmol/L的识别检测.

    3.2.3   检测三种外源性miRNA分子的纳米荧光探针

    基于GO保护的DNA探针和循环酶促扩增方法, 杨朝勇课题组[37]发展了一种简单、灵敏的方法检测复杂生物样品中的三种miRNAs.三种不同染料标记的ssDNA吸附在GO表面后, 染料的荧光处于猝灭状态.当靶标miRNA存在时, 与相应的ssDNA杂交形成DNA-RNA复合物, 并从GO表面脱落下来, 使得荧光恢复.同时, 释放下来的DNA-RNA复合物被DNase I水解, 释放靶标miRNA继续和ssDNA反应, 无限循环后得到放大的荧光信号.该方法可以在均质溶液中同时检测多个高度相似的miRNA序列.

    同时, 利用等温链置换聚合酶反应, 张学记和鞠熀先等[38]发展了简单、高灵敏、高选择性的方法用于多种miRNA的检测.设计了三条ssDNA序列P1、P2和P3, 分别用来识别miRNA-16、miRNA-21和miRNA-26a, P1、P2和P3分别修饰了不同的染料.当靶标分子不存在时, 修饰染料的ssDNA吸附在GO的表面, 荧光被猝灭.当相应的靶标分子存在时, 与ssDNA杂交后形成DNA-miRNA双链.同时在等温链置换聚合酶反应后产生更多的DNA-miRNA双链, 它与GO的作用力弱, 使得荧光恢复.基于这一设计原理, 实现了在同一溶液对三种miRNAs的同时检测.

    4.   荧光纳米探针用于内源性核酸分子的检测

    4.1   检测内源性miRNA分子的纳米荧光探针

    4.1.1   检测一种内源性miRNA分子的纳米荧光探针

    在细胞水平上检测miRNA并实现可视化的观察miRNA变化, 有利于更进一步的研究其在疾病中的作用.鞠熀先和严枫等[39]构建了一种集细胞识别、细胞成像及miRNA抑制或检测的多种功能SnO2纳米基因载体.在SnO2纳米颗粒上修饰上叶酸, 同时用二硫键结合上不同的基因探针后, 得到功能化的纳米颗粒, 能够特异性识别含有叶酸受体的肿瘤细胞, 并进行转染.纳米颗粒进入细胞后可利用自身荧光进行示踪, 同时释放的探针能够抑制miRNA的表达或对miRNA检测, 建立了一种对miRNA进行半定量的方法.

    基于纳米级金属有机框架(NMOF)和肽核酸(PNA), Xu和Kang等[40]设计了一种荧光纳米探针(PANMOF), 用于检测活细胞中的miRNA. PANMOF是由修饰有荧光染料并与靶标miRNA特异性识别的PNA和NMOF构成, PNA与纳米多孔的NMOF紧密结合, 由于光诱导电子转移(PET)机制, 荧光染料的荧光猝灭, 在靶标miRNA的存在下, PNA与miRNA杂交结合后从NMOF中释放, 荧光恢复, 实现对miRNA的检测.

    基于MNAzyme原位扩增技术, 朱俊杰和闵乾昊等[41]设计了一种可编码的多功能纳米器件, 用于细胞内miRNA的特异性识别和原位扩增.将DNA酶分裂为两段, 得到MNAzyme, 将其底物链通过共价键连接在介孔硅包裹的金纳米棒表面. MNAzyme的两条催化链与它们的底物链通过末端碱基互补配对组装在纳米粒子表面, 形成去活化的MNAzyme三重体.由于构型的错配, 三重体的切割能力被封闭.当靶标miRNA存在时, MNAzyme三重体结构发生重排, 其催化能力被激活, 从而切割荧光标记的底物链.切割完成后, MNAzyme自发地与相邻的底物链杂交, 并依次切割, 从而产生酶促增大的荧光信号.同时, 通过光照条件可以同时控制纳米粒子内部装载的药物, 实现细胞内miRNA的多通道检测和可控药物释放.

    利用AuNPs可以猝灭UCNPs的荧光这一性质, 匡华课题组[42]发展了一种自组装的手性纳米金字塔, 用于在活细胞中双模式超灵敏定量miRNA.纳米金字塔以4条DNA链为框架, 其中包含与待检测miRNA特异性识别的序列, 在每条DNA链上连接AuNPs或UCNPs, 通过DNA杂交自组装形成DNA链不完全互补配对的纳米金字塔.当靶标miRNA不存在时, 由于UCNPs和AuNPs发生FRET, UCNPs的发光被猝灭; 当靶标miRNA存在时, 靶标miRNA与识别序列互补配对, 导致金字塔结构解体, UCNPs和AuNPs分离, UCNPs荧光恢复, 实现对miRNA的灵敏检测和定量(图 8).

    图 8

    图 8.  用于miRNA检测的Au-UCNP金字塔(A)及其核酸骨架(B)的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 8.  Illustration of Au-UCNP Pyramids for miRNA Detection (A) and nucleic acid skeleton of pyramid (B). [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    娄筱叮等[43]制备了TPEPy-LDNA纳米探针, 在外切酶Ⅲ的辅助下, 实现了活细胞中miRNA-21的检测与成像.其中LDNA是与miRNA-21杂交的识别序列, TPEPy能够在聚集情况下发出黄色的荧光.由于识别序列LDNA的强水溶性, 使得TPEPy-LDNA是水溶的, 此时TPEPy的荧光很弱.当miRNA-21存在时, 与识别序列DNA结合形成双链DNA-RNA, 在外切酶Ⅲ的作用下, 切断双链中的DNA识别序列, 释放miRNA-21和TPEPy分子.释放的miRNA-21再继续与另一个探针结合, 无限循环后释放的TPEPy分子聚集, 发出强烈的荧光.该方法能够区分癌症病人和健康者的尿样中miRNA-21表达量的不同, 以及不同癌细胞中miRNA-21的表达量的不同.

    MnO2纳米片与细胞内的谷胱甘肽(GSH)反应从而被分解, 向云课题组[44]基于这一性质发展了可降解的MnO2纳米片介导的信号扩增方法, 实现细胞内下调的miRNA的检测.在MnO2纳米片上吸附带有不同荧光染料的两种分子信标, 此时染料的荧光处于猝灭状态.进入细胞后, MnO2与GSH反应, 释放出分子信标, 在miRNA-21的存在下, 使两种分子信标会进行HCR, 使两种染料距离靠近发生荧光共振能量转移, 实现细胞内痕量miRNA-21的检测与成像.

    基于核酸分子团聚物和GO, 张书圣课题组[45]实现了单细胞内miRNA-21的检测与成像.首先制备了功能化的三螺旋探针, 由适体区域和DNA启动区域组成, 适体结构用于识别靶标序列, DNA启动区域用于触发滚环放大反应.通过共价作用将三螺旋分子探针和羧基修饰的磁珠连在一起, 当它进入细胞时, 能够特异性的与miRNA-21结合, 从而激活滚环扩增反应, 另一方面, 修饰有荧光染料的DNA链和带有猝灭基团的DNA链杂交后连接到GO上, 使得染料的荧光被进一步猝灭, 当它进入细胞以后, 滚环扩增的产物能够将带有猝灭基团的DNA链竞争下来, 从而实现荧光的恢复.该探针的设计不仅能够区分正常细胞和癌细胞, 还能实现低浓度的miRNA-21的检测.

    4.1.2   检测两种内源性miRNA分子的纳米荧光探针

    基于GO和HCR反应, 唐波课题组[46]实现了同时灵敏地检测两种miRNAs, 并在活细胞内对两种miRNAs进行同时成像.在两种MB的一端均修饰相同的染料, 与GO结合后, 染料的荧光被猝灭.当靶标miRNA存在时, 引发HCR反应, 形成长的双链DNA结构, 并富集在GO的表面, 产生相对集中的高荧光强度.由于杂交链反应的特异性, 这种方法能够很好地用于活细胞内两种miRNAs同时成像, 为多个低水平表达生物标志物的高灵敏和同时成像提供了新工具, 从而提高了早期疾病诊断的准确性.

    利用Au@pDA能够吸附ssDNA并猝灭其修饰染料荧光的这一性质, Bian和Choi等[47]基于Au@pDA和MBs制备了纳米探针用于人间质干细胞中两种miRNAs的检测(图 9).在MB的一端修饰染料, 与Au@pDA结合后, 染料的荧光被猝灭.与靶标分子miRNAs (miR-29b和miR-31)结合后, 染料的荧光恢复.纳米探针具有长时间追踪miRNAs变化的能力, 因此通过对细胞内miR-29b和miR-31变化的长时间追踪, 实现了区分人间质干细胞的分化状态(分化与未分化).

    图 9

    图 9.  (A) 基于Au@pDA和MBs纳米探针的制备示意图(B)活细胞间质干细胞中miR-29b和miR-31的检测. [原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 9.  (A) Illustration of the preparation of nanoprobe based on Au@pDA and MBs (B) Detection of miR-29b and miR-31 in living human mesenchymal stem cells. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    2017年, 匡华课题组[48]基于UCNPs、Ag2S NPs、Au-Cu9S5NPs和核酸设计了一种多功能杂合纳米金字塔探针, 实现了细胞和活体中两种miRNA的同时检测和成像.六种ssDNA通过杂交结合构成纳米金字塔结构的框架, 其中两种具有茎环结构的DNA分别连接有Ag2S NPs和UCNPs, 用来分别识别miRNA-21和miRNA-203b; 另一种DNA上连接有Au-Cu9S5NPs, 并与其他三种DNA杂交结合.当两种靶标不存在时, 金字塔中的UCNPs和Ag2S NPs荧光被Au-Cu9S5NPs猝灭.当两种miRNA存在时, miRNA可以分别与金字塔中的识别链杂交结合, 使其脱离DNA框架, 此时在808 nm激发下, 在可见光区541 nm和近红外Ⅱ区1227 nm处能分别检测到UCNPs和Ag2S NPs的发光信号, 实现对两种miRNA的同时检测.在单一波长激发下, 这种自组装的纳米金字塔不仅能对活细胞中两种miRNA进行超灵敏荧光检测, 而且实现了对活体中miRNA响应的生物成像.

    林跃河等[49]基于MnO2纳米管和带有荧光染料的ssDNA实现了同时检测细胞内的多种肿瘤标志物.在MnO2纳米管表面吸附能够与miRNA特异性结合的识别序列DNA, 并且DNA上修饰的荧光染料的荧光能很好地被MnO2猝灭.当靶标miRNA存在时, 与识别序列反应后形成DNA-miRNA复合体, 使得荧光染料的荧光恢复, 从而达到检测的目的.另外, MnO2进入细胞以后, 能被细胞内的酸性环境及谷胱甘肽还原成Mn2+, 因此还能作为核磁成像的造影剂.该方法实现了对乳腺癌细胞中不同种类的miRNA-155和miRNA-21的同时检测, 为癌症的诊断提供了更为可靠的信息.

    将染料标记的PNA和GO结合, Min课题组[50]发展了检测miRNA的平台, 用于实时监测活细胞中的多种miRNA(图 10).设计原理是在PNA的一端修饰染料分子, 在纳米氧化石墨烯(NGO)存在时, 染料分子的荧光被猝灭.加入目标miRNA后, 与标记染料的PNA结合, 使得与NGO表面紧密结合的染料标记的PNA荧光恢复.使用PNA作为探针和NGO作为荧光猝灭剂的miRNA传感策略, 稳定性高, 背景信号低, 对靶miRNA具有高选择性和特异性.

    图 10

    图 10.  基于PNA和GO组成的miRNA传感平台. [原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 10.  A sensing platform based on PNA and GO for miRNA detection. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    4.2   检测内源性mRNA分子的纳米荧光探针

    4.2.1   检测一种内源性mRNA分子的纳米荧光探针

    对细胞内肿瘤相关的mRNA的检测与成像, 有利于实现癌症的早期诊断和治疗. 2009年, Mirkin课题组[51]基于AuNPs的纳米火焰设计了一种纳米荧光探针, 用于检测和调节细胞内的mRNA水平.随后, Wright课题组[52]基于AuNPs和MB构建了一种荧光纳米探针, 用于对活细胞中mRNA的检测成像.

    由于细胞内存在大量的GSH, 可以释放AuNPs表面修饰的用于检测mRNA的DNA检测探针, 因此产生“假阳性”信号.为了解决这一问题, 王柯敏课题组[53]设计了一种FRET纳米火焰探针, 用于细胞内mRNA的检测(图 11).在AuNPs表面功能化修饰靶标mRNA的特异性识别序列(识别链), 并杂交与其互补的短链DNA (Flare报告链), Flare报告链的5ʹ端和3ʹ端分别修饰能发生FRET的供体荧光染料和受体荧光染料, 并且报告链能形成发夹结构.当靶标mRNA不存在时, Flare报告链与识别链结合, 供体和受体分开, FRET效率很低, 此时只能检测到供体荧光信号.当靶标mRNA存在时, Flare报告链被靶标mRNA从识别链上取代下来形成发夹结构, 导致供体和受体距离靠近, 此时可以检测到受体荧光信号, 实现对细胞内mRNA的检测.与单染料纳米火焰相比, FRET纳米火焰还能避免“假阳性”信号的产生, 极大地提高了检测准确性.

    图 11

    图 11.  FRET纳米火焰探针用于细胞内mRNA的检测.[原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 11.  FRET nanoflares for intracellular mRNA detection. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    谭蔚泓和张晓兵等[54]设计了一种由MB与二酰基脂自组装形成的纳米胶束实现细胞内mRNA的成像和基因治疗.在MB的一端修饰荧光团和猝灭基团, 并在猝灭基团的一端修饰二酰基脂, 修饰后的MB会自动形成胶束纳米粒子, 此时荧光基团的荧光处于猝灭状态.当靶标分子mRNA存在时, 与MB发生杂交反应, 荧光信号得以恢复, 从而实现对mRNA的检测.除此之外, 纳米胶束进入细胞后可以对相应的mRNA进行基因沉默, 从而实现对肿瘤细胞的治疗.该胶束合成简单, 容易被细胞摄取、抗酶切性能好, 同时还具有高的信噪比, 优异的选择性, 以及好的生物相容性, 是一种很好的检测与治疗纳米材料.

    唐波课题组[55]发展了一种双重靶向的纳米粒子, 同时靶向癌细胞表面的受体和细胞内的肿瘤mRNA, 实现肿瘤细胞内mRNA的成像和肿瘤细胞的治疗.将修饰叶酸的DNA和靶向细胞内mRNA的分子信标组装到AuNPs表面, 叶酸可以与癌细胞表面的叶酸受体相结合增强细胞对纳米载体的摄取, 分子信标茎部的GC序列携带Dox分子, 当遇到癌细胞中过表达的mRNA时, 释放出药物分子, 达到双重靶向的目的.另外, 该纳米载体可以根据肿瘤细胞中mRNA的表达水平释放药物分子实现在肿瘤细胞中的可控释放.另外, 该课题组进一步将修饰光敏剂Ce6的MB组装到AuNPs表面, 然后将阿霉素分子嵌入分子信标茎部GC序列当中, 遇到肿瘤细胞中过表达的mRNA时, 茎环结构打开释放出阿霉素, 光敏剂同时恢复作用, 从而实现癌细胞mRNA的检测成像与治疗[56].

    DNA四面体具有合成简单, 易于修饰等优点, 在生物传感方面得到了广泛的应用.黄晋和王柯敏等[57]设计了一种包含了MB的DNA四面体用于活细胞中肿瘤相关的mRNA的检测与成像.在DNA四面体的一条棱边上设计了能对靶标mRNA分子特异性识别的MB.当DNA四面体探针遇到靶标mRNA分子时, 使得MB被打开, 荧光基团远离猝灭基团, 荧光信号得到恢复, 从而实现了对活细胞内肿瘤相关mRNA的检测.同时, 该课题组又基于MnO2纳米片和ssDNA设计了一种“双供体-受体(DD-A)”FRET二元探针, 用于灵敏检测细胞内mRNA[58].在MnO2纳米片表面吸附两种与待检测的mRNA序列特异性识别的单链DNA, 其中在一种DNA上修饰有两分子荧光染料作为发生FRET的供体, 另一种DNA上修饰一分子荧光染料作为FRET的受体, 此时两种荧光染料的荧光被MnO2猝灭.当MnO2被细胞内谷胱甘肽还原成Mn2+后, 两种ssDNA被释放, 荧光恢复.只有遇见特定的mRNA靶标序列, 两种DNA序列与其杂交, 供体和受体荧光染料距离靠近, 发生FRET, 以供体荧光染料的激发光照射从而可以得到受体发射的荧光, 实现对mRNA的特异性检测.这种“DD-A”FRET二元探针, 可以极大地增加FRET效率, 从而提高检测mRNA的灵敏度.

    利用HCR方法, 蒋健晖课题组[59]构建了一种静电组装的核酸纳米结构, 在活细胞中实现了mRNA的超灵敏成像(图 12).以AuNPs为内核, 在其表面通过Au-S键修饰带正电的多肽, 在疏水作用力下形成紧密的多肽层, 最后两种分别修饰有荧光供体染料和荧光受体染料的发夹DNA (H1、H2)通过静电作用结合组装到多肽层表面, 此时由于表面能量转移, 两种荧光团的荧光都被AuNPs猝灭.在靶标mRNA存在下, 引发mRNA与H1杂交后再与H2杂交, H1和H2的不断杂交形成刚性双链, 导致其与纳米组装体的亲和性降低, 从而远离纳米组装体表面.同时形成的H1和H2的杂交双链将荧光团供体和受体距离拉近, 激活FRET荧光信号, 实现细胞内mRNA的超灵敏成像.

    图 12

    图 12.  基于HCR实现细胞内mRNA检测的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 12.  Illustration of intracellular HCR for mRNA detection. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    通过荧光寿命成像, 周明课题组[60]设计了一种纳米火焰探针, 实现了活细胞中BRCA1 mRNA的检测.首先, Au-S将核苷酸链连接在AuNPs表面, 再将一段修饰有Cy5染料的DNA短链通过序列互补修饰在上面.此时Cy5靠近AuNPs时, 其荧光寿命显著降低.当靶标mRNA分子存在时, 将Cy5修饰的短链核酸释放下来, 导致Cy5的荧光寿命增加.通过观察荧光寿命的变化, 实现了在活细胞中对BRCA1 mRNA的检测与成像.

    王柯敏和黄晋等[61]发展了一种竞争介导的FRET切换DNA四面体分子信标用于细胞内与肿瘤相关的mRNA的检测.通过4条不同的DNA链的自组装形成DNA四面体, 在其中的一条棱上的一条链上嵌入一个发夹结构, 在另一条链上连接上两个染料, 供体(FAM)和受体(TAMRA).识别链部分的存在使发夹结构开放, 诱导两个标记的染料在空间上分离, 此时不能发生FRET.在靶mRNA的存在下, 四面体通过靶的竞争逐渐远离识别链, 引导形成发夹结构, 导致两个染料靠近发生FRET.利用两种染料的荧光变化建立了比率的方法对靶标mRNA分子进行定量与细胞内成像.随后, 谭蔚泓和张晓兵等[62]发展了一种基于FRET的DNA四面体纳米粒子, 用于高度可靠的检测活细胞中的肿瘤相关mRNA.该DNA四面体是由四条ssDNA自组装形成, 其中有两条链上分别修饰Cy3和Cy5, 它们分别作为共振能量转移的供体和受体.当靶标mRNA分子存在时, 供体和受体距离变小, 发生FRET, 基于此实现了对mRNA的检测(图 13).

    图 13

    图 13.  DNA四面体纳米粒子用于检测肿瘤相关mRNA的示意图.[原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 13.  Illustration of tumor-associated mRNAs detection based on DNA tetrahedral nanoparticles. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    李红荣课题组[63]基于ZnO、pDA和发夹DNA (hpDNA)设计了一种无酶双重信号放大的纳米系统, 用于对细胞内mRNA的超灵敏检测和成像.以ZnO纳米粒子为内核, 其表面沉积一层pDA, 在pDA上通过π-π作用和氢键固定四种hpDNA (H0, H1, H2, H3).这种核壳结构的纳米系统可以促进hpDNA的细胞内化, 避免其被核酸酶降解, 在内吞进入细胞后, ZnO内核在酸性的核内体/溶酶体中分解, 纳米系统解离释放四种hpDNA.在特异性靶标mRNA存在下, H0与靶标mRNA杂交, 进而引发H1和H2的打开并且通过HCR自组装形成线形DNA酶, 在Mg2+存在下可以催化切断荧光猝灭的基底H3, 产生可检测到的荧光信号, 从而实现对mRNA的检测与成像.

    陈小元、马庆杰和王忠良等[64]设计合成了一种由抗多药耐药性分子信标与阿霉素组成的纳米微胶束, 实现细胞内mRNA的成像及多药耐药性癌细胞的治疗.首先通过分子信标与阿霉素自组装形成的微胶束.当其与靶标分子mRNA结合后, 阿霉素荧光得以恢复, 可以通过荧光强度的变化来检测细胞内的mRNA含量.此外, 纳米微胶束不但可以通过基因沉默来解决多药耐药性的问题, 而且当纳米胶束降解后, 还可以释放阿霉素治疗癌症, 从而实现检测与治疗的一体化.

    4.2.2   检测两种内源性mRNA分子的纳米荧光探针

    由于肿瘤相关的mRNA在某些正常细胞内也会过表达, 因此, 多种mRNA的同时检测可以有效地避免“假阳性”信号的产生.基于此, 唐波课题组[65]发展了一种复合荧光探针, 实现乳腺癌细胞中的两种特异性mRNA的检测与成像.将两种MB分子通过Au-S作用修饰在AuNPs的表面, 此时染料的荧光处于猝灭状态.当靶标mRNA分子存在时, 与相应的MB发生杂交反应, 使得染料远离AuNPs, 荧光恢复, 达到检测mRNA的目的.通过双色荧光成像实现了对乳腺癌细胞内的两种特异mRNA的同时测定, 该纳米荧光探针有效地减少了“假阳性”结果的出现, 有利于肿瘤的早期诊断.随后, Mirkin等[66]基于AuNPs和球形核酸发展了一种复合纳米火焰, 也实现了同时检测活细胞内两种不同的mRNA.相比于单一检测的纳米火焰, 这种复合纳米火焰能更精确地确定个体细胞中的相对mRNA水平, 改善细胞分选和定量分析.

    陈小元和王忠良等[67]设计了一个多功能纳米复合物(fNC), 能够对神经元干细胞分化时连续表达的mRNAs进行成像.设计了两种识别序列, 通过Au-S将识别序列修饰到AuNPs表面, 然后与修饰染料的报告序列杂交, 此时染料靠近AuNPs, 荧光处于猝灭状态.在识别序列的末端通过席夫碱反应连接视黄醛得到fNC.当fNC进入细胞时, 亚胺键被水解, 产生了小分子视黄醛和DNA修饰的AuNPs成像探针.在哺乳动物细胞中, 醛脱氢酶将视黄醛转化成视黄酸.生成的视黄酸启动神经干细胞分化, 随着分化过程的进行, 生成的mRNA在细胞质中逐渐表达, 与成像探针中的识别序列反应, 释放报告探针, mRNA的表达与产生的荧光信号成正比关系.该纳米复合物在不使用转基因操作的情况下实现了神经干细胞分化期间的连续表达的mRNA的动态成像.

    唐波课题组[68]基于Au NPs、MB和肽链构建了一种复合纳米探针, 实现对活细胞中多种肿瘤标志物的同时检测和成像.将两种MBs和两种肽链通过Au-S作用修饰在AuNPs表面, MB和肽链上分别标记不同的染料.待测物不存在时, 染料的荧光处于猝灭状态.当目标mRNA分子和基质金属蛋白酶(MMP)存在时, 相对应的荧光得以恢复, 从而实现对细胞内两种mRNAs和两种MMPs的多种肿瘤标志物的同时检测和成像, 并区分了正常细胞和肿瘤细胞不同标志物表达水平的变化, 既可以防止“假阳性”结果的出现, 同时也可以提高肿瘤细胞早期诊断的准确性.同时, 该课题组基于荧光共振能量转移(FRET)的原理发展了一种单一波长激发同时检测两种mRNA的方法[69].将能够发生FRET的两种染料分子分别修饰到两种识别不同mRNA的MB上, MB的另一端修饰巯基.通过Au—S作用将MB修饰到AuNPs的表面.当两种mRNA同时存在时, 才能收集到荧光信号, 实现同时对细胞内的两种mRNA检测与成像.该方法有效降低背景干扰以及避免多次激发引起的细胞损伤, 还可避免单一检测可能造成的“假阳性”结果.

    杨荣华和郑晶等[70]设计合成了一种AuNPs整合的可编程的三螺旋分子开关, 实现了在活细胞内对多种mRNA的同时成像.首先在AuNPs表面修饰富含A/G碱基的DNA序列, 然后通过Watson-Crick和Hoogsteen作用将两种mRNA的捕获DNA探针修饰在AuNPs上.捕获DNA探针的一端修饰染料分子, 由于此时距离AuNPs较近, 荧光处于猝灭状态.当相应的mRNA存在时, 与捕获DNA探针反应后远离AuNPs的表面, 导致荧光恢复.纳米探针进入细胞后, 能够同时对两种mRNA进行检测与成像, 为肿瘤的早期检测提供更全面准确的信息.

    4.2.3   检测三种及三种以上内源性mRNA分子的纳米荧光探针

    实现细胞内三种及三种以上内源性mRNA分子的检测与成像, 能更有效地避免“假阳性”信号的产生.唐波课题组[71]设计了一种多色纳米荧光探针, 实现同时检测细胞内的三种肿瘤标志物(图 14).在AuNPs表面通过Au-S键功能化修饰三种待检测mRNA的特异性识别序列, 并杂交与其互补的修饰荧光染料的短链DNA, 从而使得荧光染料的荧光被AuNPs猝灭.当靶标mRNA存在时, 与相应的识别序列杂交, 释放修饰染料的短链, 使得荧光恢复, 首次实现了在活细胞中对三种肿瘤mRNA的同时检测.该探针可以有效区分乳腺癌细胞、肝癌细胞及正常乳腺细胞和肝细胞, 并能评估肿瘤mRNA在细胞中的不同表达水平.相比较传统的单一mRNA检测, 该方法可以为癌症诊断提供更加全面可靠的信息, 有效避免“假阳性”结果, 从而提高癌症早期诊断的可靠性.

    图 14

    图 14.  检测细胞内三种肿瘤相关的mRNA的多色纳米探针的示意图. [原文引用]-由版权结算中心许可转载
    Figure 14.  Illustration of the multicolor nanoprobe for three tumor-related mRNAs detection in living cells. [Original citation]-Reproduced by permission of Copyright Clearance Center, Inc.
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    基于DNA四面体, 张四纯等[72]构建了一个多色纳米探针, 也实现了三个肿瘤相关的mRNA同时检测.在构建四面体的三条核酸序列分别添加三个不同荧光基团修饰的识别序列.在没有mRNA靶标的情况下, 猝灭剂修饰的3个11碱基互补序列与识别序列杂交并猝灭染料的荧光.靶标mRNA分子存在时, 与识别序列杂交形成更长的双链体, 释放出11个碱基的序列, 荧光恢复. DNA四面体的多色纳米探针成功地实现细胞内对三个肿瘤相关mRNA的同时可视化成像.

    将四种MB修饰在AuNPs表面, 唐波和李娜等[73]又合成了一种四色的纳米荧光探针, 实现了四种mRNA的同时检测.将特异性识别四种肿瘤mRNA的分子信标组装到AuNPs表面, 染料的荧光被AuNPs猝灭, 当mRNA出现以后, 其与MB杂交后其茎环结构被打开, 染料远离AuNPs, 荧光恢复(图 15).此研究首次实现了活细胞中四种肿瘤标志物的快速检测, 进一步提高了癌症早期诊断的可靠性, 更有效地避免“假阳性”结果.

    图 15

    图 15.  检测细胞内多个mRNA的四色纳米探针的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载
    Figure 15.  Detection of multiple intracellular mRNAs based on four-color nanoprobe.[Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society
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    4.3   同时检测miRNA和mRNA的纳米荧光探针

    唐波课题组[74]构建了一种基于AuNPs的多色荧光探针, 通过同时对PI3K/AKT通道相关的miRNA-221、PTEN mRNA和基质金属蛋白酶(MMP-9)成像用于评价细胞的迁移和侵袭.该探针由20 nm的AuNPs、可响应miR-221和PTEN mRNA的MBs以及可以被MMP-9特异性切断的肽链组成.在没有靶标分子存在的情况下, 荧光被AuNPs猝灭; 当有相应的靶标分子存在时, 发夹结构可被打开, 多肽链会被切断, 从而恢复荧光.该探针提供了一种简单易行、非侵入式的、即时并且直接的方法来评价细胞迁移和侵袭, 有望用于建立有效的抑制癌细胞转移的治疗方式.

    5.   荧光纳米探针用于活体水平上核酸分子的检测

    匡华课题组基于设计了一种多功能杂合纳米金字塔探针, 不仅实现了细胞内和miR-21和miR-203b的同时检测, 还实现了活体水平上miR-21和miR-203b的成像[48].唐波课题组[75]发展了一种荧光纳米复合物实现活细胞和活体内的缺血再灌注损伤过程中miR-21的成像.纳米复合物探针以二氧化硅@pDA-DNA1纳米粒子作为内核, CeO2-DNA2纳米粒子作为卫星.当miRNA-21和H2O2存在时, DNA1和DNA2从纳米复合物释放下来, DNA表面修饰的染料荧光恢复.该复合物纳米探针在活体小鼠心脏缺血再灌注过程中, 实现了miRNA-21和H2O2的成像.同时, 该课题组基于AuNPs和MB设计了一种双色荧光探针, 实现了在活体水平上microRNA-155 (miRNA-155)和骨桥蛋白mRNA (OPN mRNA)的成像[76].该探针是通过同时将两种修饰不同染料的MB修饰到AuNPs表面, 此时染料的荧光处于猝灭状态.当与相应的靶标核酸分子作用之后, 荧光信号能得到恢复.通过在活体水平上对miRNA-155和OPN mRNA的成像, 监测了酒精性脂肪肝到脂肪肝炎的转化过程, 有望用于酒精性脂肪肝的早期预警、治疗以及预后处理.

    6.   总结与展望

    核酸分子在生物的生长、发育、突变等正常或异常的生命活动中发挥着重要的作用, 与疾病的发生发展密切相关.因此, 发展高选择性、高灵敏度的检测各类核酸分子的荧光探针, 对于详细阐明核酸分子发挥的功能作用, 实现疾病的早期诊断及治疗、新药开发及疗效监测等方面都具有非常重要的意义.在这篇综述中, 我们阐述了各种核酸分子在生命中的作用, 系统地展示了近年来检测一种或多种核酸分子的纳米荧光探针.介绍了这些纳米探针的构建过程、检测机理以及在细胞内的成像应用.由于核酸分子在生理学和病理学过程中都具有重要的作用, 这些探针在化学生物学、生命医学等领域必将有广泛的应用前景, 为深入剖析核酸分子在疾病发生、发展过程的功能作用提供新材料, 为研究者今后设计合成核酸分子的检测探针提供重要的依据.

    许多核酸分子在细胞内的含量极低、且是动态变化的.然而, 目前已经发展的探针用于细胞内核酸分子检测时, 存在着灵敏度低、选择性差的问题.同时, 在许多疾病的发展过程中, 往往是多种核酸分子同时发挥着作用.但是, 同时检测不同种类核酸分子的探针还很有限.此外, 很多探针不能快速、实时动态地监测核酸分子的变化, 也限制了人们对核酸分子生物学功能研究的进一步了解.基于目前核酸检测探针的研究现状, 我们认为在未来几年, 发展新型核酸荧光探针应着重注意以下4个方面的问题: (1)急需发展快速、高灵敏度、高选择性以及同时动态示踪核酸分子及其定量的分析方法, 实现对细胞内低含量、动态变化的核酸分子的实时、原位检测, 为研究其细胞学功能提供重要的参考信息. (2)结合超分辨光学成像技术实现单细胞单个核酸分子的检测与成像, 或者多种不同种类核酸分子的单分子成像, 为进一步探索其生理学功能奠定基础. (3)发展简便、有效的策略, 实现活体水平上非入侵式的检测多种核酸分子, 对于探索复杂的核酸分子相关的信号调控通路, 以及对多种疾病的检测和治疗都具有非常重要的意义. (4)发展能够在活细胞和活体水平上检测核酸分子甲基化、烷基化和酰基化的荧光探针, 推动人们进一步了解其在疾病中的作用.

    总之, 随着纳米材料和纳米技术研究的不断深入, 发展细胞和活体水平上快速、有效检测核酸分子的新型纳米荧光探针仍将是今后发展的重要研究内容之一, 这将为阐明各类核酸分子在相关疾病发生、发展、迁移、转化过程中的作用提供新平台、新方法.

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  • 图 1  基于AuNPs的荧光纳米探针用于核酸检测的示意图

    Figure 1  A design strategy of fluorescent nanoprobe for detection of nucleic acids based on AuNPs

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    图 2  基于GO的荧光纳米探针用于核酸检测的示意图

    Figure 2  The design strategy of fluorescent nanoprobe for detection of nucleic acids based on GO

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    图 3  基于目标诱导的模板转换策略检测DNA的示意图.[原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 3  Illustration of DNA detection based on target-induced template transformation strategy. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 4  基于GO的平台用于DNA放大检测的多重分析. [原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 4  Amplified multiplexed analysis of DNA based on GO platform. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 5  DNA为模板的AgNCs/GO传感平台用于靶分子DNAs的检测.[原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 5  Using DNA-templated AgNCs/GO hybrids as sensing platform for target DNAs detection. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 6  用于检测miRNA的HCR/GO平台的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 6  HCR/GO platform for detection of miRNA. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 7  基于GO荧光开关协同放大检测目标miRNA的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 7  Detection of target miRNA Based on GO fluorescence switch cooperative amplification. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 8  用于miRNA检测的Au-UCNP金字塔(A)及其核酸骨架(B)的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 8  Illustration of Au-UCNP Pyramids for miRNA Detection (A) and nucleic acid skeleton of pyramid (B). [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 9  (A) 基于Au@pDA和MBs纳米探针的制备示意图(B)活细胞间质干细胞中miR-29b和miR-31的检测. [原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 9  (A) Illustration of the preparation of nanoprobe based on Au@pDA and MBs (B) Detection of miR-29b and miR-31 in living human mesenchymal stem cells. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 10  基于PNA和GO组成的miRNA传感平台. [原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 10  A sensing platform based on PNA and GO for miRNA detection. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 11  FRET纳米火焰探针用于细胞内mRNA的检测.[原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 11  FRET nanoflares for intracellular mRNA detection. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 12  基于HCR实现细胞内mRNA检测的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 12  Illustration of intracellular HCR for mRNA detection. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 13  DNA四面体纳米粒子用于检测肿瘤相关mRNA的示意图.[原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 13  Illustration of tumor-associated mRNAs detection based on DNA tetrahedral nanoparticles. [Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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    图 14  检测细胞内三种肿瘤相关的mRNA的多色纳米探针的示意图. [原文引用]-由版权结算中心许可转载

    Figure 14  Illustration of the multicolor nanoprobe for three tumor-related mRNAs detection in living cells. [Original citation]-Reproduced by permission of Copyright Clearance Center, Inc.

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    图 15  检测细胞内多个mRNA的四色纳米探针的示意图. [原文引用]-由美国化学学会许可转载

    Figure 15  Detection of multiple intracellular mRNAs based on four-color nanoprobe.[Original citation]-Reproduced by permission of American Chemical Society

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  • 发布日期:  2017-11-15
  • 收稿日期:  2017-08-03
  • 网络出版日期:  2017-11-18
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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