English

• 1.   引言

  纳米传感技术, 是指将纳米材料(例如纳米粒子、纳米线、纳米薄膜等)作为敏感元件的传感技术.纳米材料具有很高的比表面积, 可以很好地增强材料的表面吸附能力.通过调控纳米材料的种类、形状和表面形貌, 可以达到调整其化学活性的作用.许多纳米材料还具有一些独特的光电磁性质.比如, 贵金属纳米材料的光学特性与其尺寸和形貌密切相关; 四氧化三铁纳米材料的磁性可以方便地进行磁分离等^[1~5].与传统的传感技术相比, 纳米传感器具有尺寸小、灵敏度高和特异性强等优点, 使其在化学和生物传感中得到了日益广泛的应用^{[6, 7]}.

  近年来, 随着光学显微技术的不断发展, 基于光学显微术的单粒子传感成为纳米传感领域中一个新的研究热点.单粒子传感技术利用光学显微镜等具有空间分辨能力的研究工具, 通过对位于界面上或体系中的单个纳米粒子进行实时表征和监测, 以获取该纳米粒子所在微区中分析物的定性和定量信息.当纳米粒子表面发生分子识别反应时, 单个纳米粒子的光学或光谱学性质会发生变化并进而被光学显微成像技术所读取, 从而在同一个纳米粒子上实现分子识别和信号转换.从这个意义上讲, 单个纳米粒子即可视作一个完整的传感器.与传统纳米传感相比, 单粒子传感技术体现出以下四个主要特点.第一, 单粒子传感器着眼于单个纳米粒子个体的行为和性能, 有助于发现和获取具有优异传感性能的个体, 进而指导纳米材料的设计以改善传统纳米传感的性能.第二, 纳米粒子具有易于生物功能化和体积小等优点.将纳米传感器引入到单细胞等复杂体系中, 借助单细胞成像技术可以探究分析物丰富的时空动态变化过程.第三, 通过对单粒子进行计数可以将检测信号“数字化”, 有助于改善信噪比, 进一步提高分析检测的灵敏度、降低检测限.最后, 比起大量纳米粒子整体检测传感, 单粒子传感技术更易通过纳米阵列实现高通量、多参数检测.

  对单粒子光学传感的研究可以追溯到20世纪90年代单分子光学成像技术大发展的时期.当时, 单分子荧光、表面增强拉曼和局域表面等离激元共振(LSPR)等多种新原理和新技术的蓬勃发展为单粒子传感奠定了重要的技术基础^[8~14].美国西北大学的Van Duyne教授^[15]于2003年第一次较为完整地提出了单粒子传感理念.他利用金属纳米粒子的暗场散射光谱与其表面分子吸附量之间的关系, 实现了单个银纳米粒子对表面小分子吸附的实时定量检测及其吸附动力学的探究.此后, 以暗场显微镜和荧光显微镜为代表的多种光学显微成像技术被逐渐应用于单粒子传感领域.分析对象也从均相溶液很快拓展到单细胞等复杂生物体系.我国研究人员较早地开展了此方面的研究.西南大学黄承志^[16~20]、上海交通大学任吉存^[21~24]、华东理工大学龙亿涛^[25~27]、清华大学何彦等课题组^{[28, 29]}利用金、银等贵金属纳米材料的LSPR光学性质可通过其组成、形貌和表面化学性质来进行调控的特点, 设计了多种光散射探针作为纳米传感器, 提出了一系列基于暗场显微镜的定量分析技术.厦门大学颜晓梅课题组^[30~34]将瑞利光散射和鞘流技术相结合, 研制出超高灵敏纳米流式检测系统, 实现了对单个纳米颗粒的快速、灵敏、多参数检测.武汉大学庞代文教授^[35~39]提出基于量子点荧光标记的单病毒示踪技术, 可以实时、原位、定量、高灵敏度地监测病毒的侵染行为以及病毒组分与宿主细胞相互作用.山东师范大学张春阳课题组^[40~44]发展了基于单个量子点荧光共振能量转移的单分子技术, 可用于DNA、microRNA、蛋白质等生物分子的超灵敏检测.随着基于光学显微术的单粒子传感技术的不断发展, 涵盖该领域不同方向的优秀综述也层见叠出^{[2, 6, 29, 45~55]}.本文不局限于单一种类的纳米材料和成像技术的限制, 致力于介绍单粒子传感分析的基本理念以及基于不同光学显微术的多种具体传感原理, 并重点关注近五年来的最新进展.

  2.   单粒子光学传感的主要特点

  传统纳米传感器的信号通常来自于一个包含有大量纳米粒子的宏观体系或界面, 而单粒子传感则是以单个纳米粒子的光学信号作为定性和定量分析的依据, 因而具有以下四个方面的主要特点和优势.

  第一, 由于纳米材料具有内在的结构异质性, 不同个体的性质往往具有很大的个体差异性, 某些个体的分析传感性能可能显著优于其它的个体.单粒子传感可通过筛选出特定性质的纳米粒子个体, 起到放大检测信号、提高灵敏度的作用.比如, 银纳米粒子的表面增强拉曼散射效应的早期研究表明, 大量纳米粒子中某些个体的拉曼增强因子可达到10¹⁴至10¹⁵数量级, 显著强于整体平均的增强因子^[56].这种巨大的增强使得单分子拉曼信号甚至比单分子荧光还要强而稳定.

  许多传感器都利用光谱的移动来实现传感, 而光谱的线宽越窄, 传感器的灵敏度越高.以荧光发射光谱为例, 由于单发射体所处微观环境的多样性和随机性导致宏观体系的光谱线宽往往宽于单发射体的线宽(图 1a).因此, 基于单粒子荧光光谱的分析传感具有天然的优势. Bawendi等^[57]利用溶液相光子相关傅里叶光谱方法证实单个纳米晶粒相比于其整体而言具有更窄的谱线宽度.将单个纳米粒子作为传感器可以减小样品不均匀性对光谱线宽的展宽效应, 从而提高传感器的灵敏度. Sang等^[58]在PSA-ACT抗体与抗原修饰的金纳米粒子(GNP)的结合的研究中, 比较了多个具有不同尺寸的单粒子传感器性能.实验结果表明, 尺寸较小的GNP具有更好的检测灵敏度(如图 1b).

  图 1

  

  图 1.  (a) 几种不同材料组成的单粒子光谱和整体光谱的比较^[57].单粒子光谱线宽均明显窄于整体光谱线宽. (b)不同尺寸的GNP检测PSA-ACT复合物的浓度校正曲线^[58].尺寸小的纳米粒子具有更好的灵敏度

  Figure 1.  (a) The spectrum linewidths of single nanoparticles are narrower than that of ensemble nanomaterials^[57]. (b) Calibration curves describing detection of the PSA-ACT complex concentrations using individual GNPs with different sizes. Nanosensors with smaller size have better detection sensitivity^[58]

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  第二, 除了被动地筛选性能更为优异的纳米粒子个体以外, 单粒子传感还能够以一种“见微知著”的方式自下而上地反映纳米粒子的结构与其传感性能之间的关系, 从而指导宏观纳米传感器的性能优化.以贵金属纳米粒子为例, 纳米粒子的组成、形貌、尺寸和表面化学等多种因素均会影响其LSPR效应.因此, 纳米粒子结构上的微小变化会强烈地影响其折射率灵敏度(传感性能). Van Duyne等^[59]结合暗场显微镜(获取单粒子传感性能)和透射电子显微镜(测量单粒子结构), 研究了纳米三角尖端截断与其LSPR光谱特性之间的关系.结果表明将尖端截断从20 nm减小至10 nm会显著减小其散射光谱线宽, 为进一步提高基于纳米三角的分析传感性能指明了方向.

  改善纳米材料的电化学活性对发展高灵敏度电化学传感器至关重要.我们利用平面表面激元共振显微镜(SPRM)测量单个Ag纳米粒子的电化学反应动力学.将其与SPRM图像得到的单个纳米粒子尺寸结合起来, 可以研究颗粒尺寸与其电化学活性之间的关系^[60], 有助于进一步优化Ag纳米材料的电化学性能, 发展高灵敏度的电化学传感器.

  第三, 单粒子传感还能够以较高的时空分辨率监测微观复杂体系(如单细胞)内特定分析物的浓度分布及其动态变化过程.肖乐辉等^[61]将双波长正置暗场显微镜与高速相机结合, 实现对金纳米棒(GNR)的三维示踪, 以此研究修饰GNR的转铁蛋白与活细胞膜之间的相互作用.德国美因兹大学的Sönnichsen等^[62]在实验中使用单个GNP在超高时间分辨率下检测未标记蛋白质.该方法允许在毫秒尺度动态监测单个蛋白质的结合, 且信号的信噪比得到了显著提高.这些动态信息的获取不但需要较高的时空分辨率和信噪比, 对标记物的大小和生物相容性也有着较高的要求, 而单粒子传感技术恰好可以满足这些要求.

  第四, 单粒子传感比起大量纳米粒子整体检测传感, 更易实现高通量检测.颜晓梅等^{[32, 34]}采用高灵敏度纳米流式检测仪, 实现了不同大小GNP的尺寸分辨和其绝对浓度的测定, 检测速度可高达10000纳米粒子每分钟.美国的Nolan等^[63]展示了一种每秒钟可分析数百个纳米粒子的流式光谱技术, 并利用这个技术高通量分析每个纳米粒子的表面增强共振拉曼散射光谱.

  除了以上使用流式技术将纳米粒子按时序通过单点检测器的方法以外, 使用光学显微术对一个具有空间排布的纳米传感阵列进行成像分析也可以达到快速高通量检测的目的.美国麻省理工学院的Strano等^[64]报道了一种基于近红外单壁碳纳米管的非光漂白的荧光纳米传感器阵列, 并利用该阵列研究多巴胺从PC12类神经元细胞中释放的过程, 检测通量可超过20000个传感器每个细胞.

  3.   常见单粒子光学传感原理

  3.1   暗场显微镜

  基于LSPR效应的暗场显微镜是目前应用得最为广泛的一种单粒子传感技术. LSPR效应使得金属纳米粒子表面产生巨大的局部电场增强, 从而导致纳米粒子对特定入射光的强烈散射和吸收.研究表明, 即使单分子水平的表面吸附过程也可能引起LSPR散射光谱的显著偏移, 从而实现单分子检测(如图 2).与荧光相比, LSPR具有光路简单、无光漂白和光闪烁等优点, 因此被广泛应用于表面吸附、分子间相互作用和动态催化过程等方面的研究^[65].

  图 2

  

  图 2.  暗场显微镜检测单粒子传感的原理示意图.左图为纳米粒子表面发生分子吸附前后光谱移动示意图.右图为CCD采集到的多个纳米粒子的暗场图像

  Figure 2.  Representative single nanoparticle sensing mechanism using dark-field microscopy. A red shift occurs in the scattering spectrum of a single plasmonic nanoparticle when molecules adsorb on its surface

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  基于暗场显微镜的单粒子传感技术大多依据分析物对纳米粒子尺寸、形貌、化学组成和表面化学吸附量之间的定量关系来进行.比如, 利用暗场显微镜实时原位监测不同形状的GNP在碘刻蚀过程中散射光谱的变化可以探究其刻蚀机理.研究表明, GNP顶点处有最强的电磁场分布, 从而导致该处最先发生碘刻蚀反应^[17].利用银原子与硫离子之间强烈的相互作用, 可以将金核银壳纳米粒子作为探针, 通过其光谱变化来检测活细胞内硫化物的局部浓度, 检测限可低至0.01 nmol•L^-1[66].基于单粒子光谱的方法通常需要数秒甚至数十秒采集一条散射光谱, 这极大地限制了分析速度.龙亿涛等^[67]提出了一种利用彩色相机RGB通道的不同分量进行数据分析的宽场成像技术, 无需进行光谱扫描即可对纳米探针的光谱特性进行研究, 实现了对单细胞中多个纳米探针的高通量快速分析.暗场显微分析的灵敏度主要受到杂散光的限制.英国牛津大学的Kukura等^[68]提出了一种基于正入射宽场照明的暗场显微成像技术来观察了10 nm的GNP结合到功能化表面上这一过程.为了减小背景杂散光影响, 他们在实验中使用高数值孔径的物镜收集散射光, 并在暗场光路中加入一个圆形挡板来减少窄透射激发光束的干扰.结果表明, 该方法的检测灵敏度比其他方法高两个数量级以上.

  3.2   荧光显微镜

  荧光成像是实现单粒子检测的重要手段.荧光成像作为最早实现单分子检测的光学技术之一, 具有灵敏度高、选择性好等优点.研究发现, 分析物的存在往往会引起荧光发射光谱移动和量子效率的提高或降低(增强和抑制效应).基于荧光显微镜的单粒子传感也按照这两种机制分为光谱型和强度型两大类.强度型的传感分析不需要借助成像光谱仪, 应用较为广泛.

  由于本身具有荧光的物质比较少, 大多数荧光成像需要引入荧光探针.各种各样荧光纳米探针的设计与应用就成为一项重要的挑战.与分子探针不同, 用于荧光成像的纳米粒子亮度高、光稳定性强, 且易于进行表面功能化使其具有较好的生物相容性, 并减弱其与细胞内生物大分子的非特异性结合, 使之适合用于细胞内的荧光成像^[69].

  荧光碳点具有良好的光稳定性、生物相容性和低细胞毒性等特点.上官棣华教授^[70]采用一种基于荧光碳点的双重发射纳米传感技术来检测样品中Cu²⁺的浓度.在实验中, 荧光碳点包覆在掺杂罗丹明B的二氧化硅纳米粒子表面上.在单色光激发下, 罗丹明B产生红色荧光, 而荧光碳点发射蓝色荧光.当结合Cu²⁺时, 只有荧光碳点的荧光被猝灭, 导致二氧化硅纳米粒子荧光发射光谱的改变.通过检测蓝色和红色荧光的比率, 可以检测样品溶液中Cu²⁺浓度, 且该方法对Cu²⁺表现出优异的选择性.

  线粒体活性氧ROS和pH波动与线粒体功能障碍密切相关, 但目前同时监测线粒体活性氧浓度和pH的变化仍然是一个重要挑战.山东师范大学唐波教授^[71]将线粒体靶向荧光纳米传感器应用于实时检测过氧化氢和pH的波动.实验中, 将检测过氧化氢的分子荧光探针Cy-O-SeH和检测pH的绿色荧光蛋白负载在介孔二氧化硅纳米粒子中作为荧光纳米传感器, 通过双色成像同时监测过氧化氢和pH的变化.该方法适用于活细胞中多种亚细胞分析物的同时传感成像.

  3.3   平面表面等离激元共振显微镜

  平面表面等离激元共振显微镜(SPRM)可定量测量由纳米粒子的表面吸附或化学反应导致的纳米粒子自身或周围折射率的微小变化, 从而实现对单个纳米粒子的实时、原位、免标记检测(如图 3). SPRM技术可用于测量生物分子与单个细菌相互作用的结合动力学^[72].尽管荧光和AFM等技术也已被应用于该过程的研究, 但与SPRM相比, 荧光方法需要标记, 不适合用于量化动力学; AFM的扫描速度慢, 且探针可能扰乱结合过程.

  图 3

  

  图 3.  使用SPRM检测表面单个纳米粒子的聚集.当表面发生纳米粒子聚集时, SPR信号的强度显著增强

  Figure 3.  Single nanoparticle sensing by detecting single nanoparticle aggregation with SPRM. The intensity of SPR signal is significantly enhanced when the nanoparticles aggregate on the surface

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  除了直接测量单纳米粒子表面的分子吸附过程以外, 利用分析物引起的纳米颗粒聚集效应进行定量分析也是一种重要手段.纳米颗粒的聚集会引起体系中颗粒数目的减少和平均大小的增加, 这些变化都会反映在SPRM光学信号之中.

  SPRM成像的衬度来自于纳米粒子的折射率这一固有属性, 除了金、银等等离激元纳米粒子以外, 二氧化硅、聚苯乙烯、水凝胶、病毒等消光性质较差的粒子聚集也可以被SPRM检测, 这大大扩展了单粒子检测的应用范围.我们在2016年发表的工作中, 使用改进的SPRM对直径为20 nm的GNP进行成像和计数, 可以得到溶液中纳米粒子的尺寸分布.当往样品溶液中加入能诱导GNP的分散或聚集的分析物时, 通过计数可以得到处于聚集状态的GNP的百分比, 从而分析得到加入分析物的浓度^[73].

  3.4   干涉散射显微镜

  干涉散射显微镜(iSCAT)是一种无需标记、通过瑞利散射和入射光的干涉效应来对单个蛋白分子进行光学成像的检测方法.该方法不但可以计数目标蛋白质的个数, 还可以同时提供蛋白质结合的空间信息^[74]. Sandoghdar课题组^[75]利用iSCAT显微成像技术, 在含有大量干扰蛋白质的缓冲溶液中, 准确灵敏检测癌症标记蛋白, 并在纳米精度上提供蛋白质结合的空间信息.随后, 他们进一步利用该检测方法, 跟踪磷脂双分子层中的磷脂分子以及直径小至5 nm的GNP的运动.实验结果指出, 在目标物极化性足够大的前提下, 该方法能够检测单个小的未标记蛋白质分子.此方法没有理论上的检测极限, 实际的检测极限由光学系统的背景(环境)噪声决定^[76].

  3.5   纳米阵列传感

  纳米阵列传感是对单粒子传感器的扩展.纳米阵列传感将许多同种或不同种类的单粒子传感器按照特定空间排布形成阵列, 利用光学成像技术同时读取每一个传感器的信息, 从而具有很高的检测通量, 易于实现多参数检测^{[77, 78]}.

  新加坡南洋理工大学的Kim等^[79]将单个金属纳米粒子的应用扩展至二维等离激元纳米阵列的免标记传感中.实验将光学检测平台如暗场显微镜与CCD结合, 同时监测纳米阵列中每个纳米粒子表面的LSPR信号的变化, 实现了对结合到单个纳米粒子表面的分析物浓度的高通量检测.

  荧光纳米传感器是基础研究和生物分析的重要工具.单个荧光纳米传感器可以检测单分子, 而荧光纳米传感阵列不但可以检测分析物的体积浓度, 还可以提供纳米到微米尺度上的时间和空间信息, 适合于研究细胞间的化学信号传导等时空变化的动态过程^[80~83].

  神经递质的生物传感在神经科学的研究中发挥着重要的作用. Strano等^[64]使用一种基于近红外单壁碳纳米管的荧光纳米传感器阵列, 观察PC12神经元细胞中无标记多巴胺的释放过程, 进而研究细胞膜的形态与化学信号传导的关系, 分辨率可超过20000个传感器每个细胞.

  美国亚利桑那大学的Peyghambarian等^[77]在研究中发现CdTe纳米晶体与荧光团和荧光蛋白的紧密相互作用可导致可逆的光致发光的增强或猝灭.利用纳米晶体的这一特点, 可以将具有不同发射波长的纳米晶体组装成传感阵列.当目标分子接触或接近时, 纳米晶体的光致发光发生变化, 从而导致阵列的光谱分布的改变(如图 4).将阵列的光谱变化与已知的各种发射波长的纳米晶体的坐标相关联, 有望获得分析物分子在亚光谱分辨率下的运动信息.

  图 4

  

  图 4.  不同发射波长的纳米晶体阵列传感示意图.当分析物与纳米晶体接触或接近时, 其光致发光会发生变化, 从而改变阵列的平均光谱分布^[77]

  Figure 4.  An array consisted of fluorescent nanocrystals with different emission wavelengths. Molecules coming into contact with (or in close proximity to) a nanocrystals spot will affect its photoluminescence, consequently changing the averaged spectral profile of the array^[77]

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  4.   基于光学显微成像的单粒子计数

  金等金属纳米粒子因能产生LSPR效应而具有很大的消光系数, 而LSPR效应对纳米粒子的聚集状态非常敏感, 因此可以用纳米粒子溶液的颜色作为信号转导机制检测溶液中纳米粒子的聚集和分散^[84~86].这一原理是金溶胶的比色分析法的基础.但是, 传统的比色法一般都是利用目测溶胶颜色或定量测量其光谱来检测光学性质的变化, 这些信息反映的是溶胶中数以亿计的粒子的平均消光性质.在溶液中分析物浓度极低的情况下, 少数粒子的贡献就会被大量粒子平均, 从而大大限制了检测的灵敏度^[87~89].单粒子计数则可以避免这一问题.这种通过计数单个纳米粒子的传感机制已经在环境、药物和生物化学分析等多个领域得到应用.

  汞污染是一个全球性的问题, 因此对样品中微量汞的检测至关重要.江苏师范大学的盖宏伟课题组^[90]在研究中, 将GNP用寡核苷酸修饰并固定到载玻片上, 当溶液中存在Hg²⁺时, 寡核苷酸通过杂交作用使得固定的GNP与溶液中游离的GNP聚合, 颜色从绿色变为黄色.通过用暗场显微镜观察并统计黄色的GNP的个数, 可以计算得到Hg²⁺浓度(如图 5), 动态范围在0.005~25 nmol•L^-1之间, 且选择性好, 不易受其他金属离子的干扰.

  图 5

  

  图 5.  (a) 基于暗场显微镜的Hg²⁺传感示意图, (b)不同Hg²⁺浓度下GNP的暗场图像(A~D)及GNP的聚集比例与Hg²⁺浓度关系图(E)^[90].随着Hg²⁺浓度的增大, 暗场图像中聚集体(黄色)的比例升高.聚集态GNP的比例与Hg²⁺浓度的对数线性相关

  Figure 5.  (a) Scheme of Hg²⁺ sensor at the single-particle level using dark-field microscopy. (b) Dark-field images of GNPs in the presence of different concentrations of Hg²⁺(A~D) and a plot of GNP aggregation percentage against the logarithm of Hg²⁺concentration (E)^[90]

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  黄承志教授^[91]最近提出了一种基于暗场显微成像技术同时检测样品中AFP和CEA含量的方法.实验主要基于三明治夹心免疫测定法, 使用绿色的anti-AFP-AuNP和蓝色的anti-CEA-AgNP作为标记物与样品中AFP和CEA特异性结合, 然后通过分别计数暗场图像中蓝色和绿色粒子的数目, 实现对AFP和CEA浓度的同时检测, 检测范围为0.5~10 ng/mL, 且检测过程中两者的互相干扰可忽略不计.美国罗切斯特大学的Novotny等^[92]展示了一种将暗场显微镜和外差干涉法联用, 实时、无标记地定量检测人体病毒和噬菌体(检测半径小至24 nm)的方法.暗场方法可以避免背景光在粒子不存在的情况下到达检测器, 通过降低背景来提高检测灵敏度.外差干涉法可以有效地耦合检测信号的幅度和相位, 从而提高检测精度.这两种方法联用, 可以实时、高灵敏度、高选择性地检测混合物中的单个生物纳米颗粒, 通过计数可以分析得到目标物的浓度信息.

  荧光显微镜是单粒子成像的重要手段之一.基于荧光共振能量转移(FRET)效应, 张春阳等^{[93, 94]}采用单量子点组装纳米传感技术来检测样品中cAMP-依赖蛋白激酶(PKA)的浓度.实验中使用ATP类似物作为磷酸供体, 在PKA存在的情况下, PKA催化的磷酸化反应将生物素结合到Cy5标记的底物肽上, 底物肽被量子点捕获形成QD-肽-Cy5夹层纳米结构. QD和Cy5靠近产生FRET使Cy5产生可探测的荧光信号, 最后通过高信噪比的全内反射荧光成像来检测Cy5产生的荧光信号.通过计数产生Cy5荧光的粒子个数, 可以计算出PKA浓度, 检测限可低至9.3×10^-6 U/μL(如图 6).

  图 6

  

  图 6.  单量子点传感器在PKA不存在(A~C)和存在(D~F)条件下的荧光图像(a)及Cy5计数与PKA浓度关系曲线(b).只有PKA存在时Cy5才能产生红色荧光且Cy5计数个数与PKA浓度的对数线性相关^[94]

  Figure 6.  (a) Fluorescence images of single QD-based nano-sensors in the absence (A~C) and presence (D~F) of PKA. (b) Variance of Cy5 counts as a function of PKA concentration, only in the presence of PKA can Cy5 produce red fluorescence. Cy5 counts exhibit a linear correlation with the logarithm of PKA concentration^[94]

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  在传感、生命分析和纳米医学等领域, 纳米粒子的摩尔浓度或数目浓度是影响其质量控制和临床应用的关键参数之一.目前大多数单纳米粒子计数方法仍然只能提供相对浓度, 这意味着它们仍然需要标准样品以及标准曲线来补偿样品采集及信号转换中的不确定性.但由于不同的纳米粒子在大小、形态、表面化学特性等方面均具有较大的异质性, 导致纳米材料在原子尺度上没有统一的化学组成, 这使得以往通过测量纳米粒子整体的平均性质来计算其摩尔浓度的方法都在不同程度上具有不准确性.

  Corn等^[95]利用SPRM实时检测单个DNA功能化GNP的杂交吸附过程.通过成像并计数单位时间内单个粒子结合到金膜表面的事件, 他们发现在样品浓度100 fmol/L到5 pmol/L范围内, 观察到的单个粒子结合到金膜表面的事件个数与DNA浓度直接相关.实验结果说明SPRM可以应用于低浓度纳米粒子的浓度检测.我们进一步利用装有高速CCD相机的SPRM, 实时观测并统计单位时间内被布朗运动驱动的单个纳米粒子随机碰撞到金片表面的次数, 并通过理论建模分析得到一个纳米粒子的绝对浓度与物理参数及实验参数的关系式, 从而计算出实验纳米粒子的绝对浓度^[96].

  NTA纳米粒子跟踪分析技术是近年来新兴的检测纳米粒子粒度分布和浓度的技术.实验中, 样品溶液被泵到激光束照射样品池中. CCD相机测量每个粒子的散射光来反映粒子的运动行为, 然后通过Stokes-Einstein方程分析计算出粒子布朗运动的扩散系数和浓度.该技术可以同时多参数分析, 已经逐步应用于工业分析和生命分析等领域, 但在浓度检测范围、检测精度等方面仍有进一步提高的空间^[97~99].

  5.   单粒子追踪

  活细胞中的生物化学反应等分子事件往往具有显著的时空动态特性.当通过整体检测的方法测量时, 这些时空动态信息会大量丢失.单粒子示踪技术可以在单粒子水平检测这些分子事件发生的时刻和位置, 并通过精确追踪纳米粒子的运动轨迹研究其与研究对象中生物分子的相互作用.这已经成为纳米药物输运机制和生物学效应评价的有效方法之一.荧光量子点和等离激元纳米粒子是两种目前应用最广泛的纳米材料^[100~104].

  最近的研究显示了单量子点成像技术在细胞生物学中的应用潜力.相比于有机荧光染料, 量子点的荧光发射较强, 且光稳定性更好.在实验中, 用荧光量子点标记的单分子可以实时监测活细胞从几毫秒到几小时的时间尺度内的运动.单量子点荧光发射的另一个显著特征是其光闪烁特性.在连续光激发下, 量子点的荧光信号在明暗之间随机交替, 而这是在整体测量中无法观察到的一种现象, 有助于利用空间超分辨定位技术进行超分辨荧光成像, 空间分辨率可以达到纳米级^[105~109].

  GlyR是成人脊髓中主要的抑制性神经递质受体, 研究神经递质的横向迁移是理解突触的发育和可塑性的核心. Triller等^[110]通过量子点标记GlyRs来追踪其运动轨迹, 分析其在神经元细胞膜和突触缝隙中的横向动力学(这个过程的时间尺度一般在毫秒到分钟范围内), 并与电子显微镜联用同时得到时间动态和原位高分辨的细胞信息.这种检测方法不但大大延长了观测时间, 单量子点的荧光图像信噪比也比有机荧光团高一个量级. Rosenthal等^[111]同样使用量子点来标记脂筏中的鞘糖脂GM1, 利用高速线扫描共聚焦显微镜记录量子点的运动过程, 并通过强度分布的二维高斯拟合定位单个量子点的位置来追踪GM1的运动轨迹.对其扩散动力学的研究进一步证明了脂筏具有信号传导平台的功能.

  等离激元纳米粒子具有环境敏感的光学特性.与荧光有机分子相比, 等离激元纳米粒子具有亮度高、光稳定性强、易于制备等优点.与量子点相比, 则具有能避免荧光闪烁带来的信息缺失以及较低的细胞毒性等优点^[112~114].

  GNR已被广泛应用于研究药物和基因在细胞内的有效传递, 具有高负载、高内吞效率、高生物相容性和可控释放等优点.利用GNR的形态各向异性, 肖乐辉等将GNR作为局部定向传感器, 使LSPR分解成横向和纵向两种模式, 通过双波长正置暗场显微镜与高速相机结合, 实现对GNR的三维示踪, 研究修饰转铁蛋白的GNR与活细胞膜之间的相互作用^{[60, 115]}.除了暗场显微镜之外, 微分干涉显微成像^[116~118]、光热成像^{[119, 120]}、双光子成像^{[121, 122]}等多种显微成像技术都可利用GNR形状可调各向异性的光学性质, 研究单个GNR的运动模式.

  基于吸收的光热成像通过检测光激发后由快速非辐射弛豫产生的热量, 可以在均相溶液中检测到直径小至2 nm的金属纳米颗粒, 在单细胞环境中则可用于追踪5~10 nm大小的GNP标记的膜蛋白的运动, 以此获取GNR的取向信息^[114].光片显微镜也可用于单粒子追踪.肖乐辉等^[123]利用光片显微镜实现了对细胞内各向异性纳米粒子的旋转和平移扩散动力学过程的追踪.

  单粒子传感除了可以用来实时监测体外或细胞膜上的动态过程, 还可以应用于细胞内蛋白质和细胞器的研究.细胞质动力蛋白是将多种物质运输到微管负端的驱动蛋白, 为了探究该蛋白的两个催化头部在运动过程中的相互作用和移动, 美国加州大学伯克利分校的Yildiz等^[124]用单个量子点分别标记并记录两个头部的相对位置, 观察头部沿着微管的移动.研究发现两个头部在移动过程中并不完全同步, 且其移动机制与目前已知的驱动蛋白和肌球蛋白的移动机制明显不同(如图 7).

  图 7

  

  图 7.  单个QD-655标记头尾的GST-Dyn331kD的步长测量, 两个头部在运动过程中速率不相等, 故两者的移动是相对独立的^[124]

  Figure 7.  Step-size measurements of tail-and head-labeled GST-Dyn331kD with a single QD-655. The two heads are not equal in the rate constants during stepping, so their stepping are relatively independent^[124]

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  研究HIV-1病毒进入人体巨噬细胞的途径对人类了解HIV-1病毒的感染和发病机理至关重要.崔宗强等^[125]在2017新发表的研究工作中, 将量子点封装在HIV-1的病毒中, 在单粒子水平跟踪研究病毒进入巨噬细胞的方式.研究发现, 在巨噬细胞被病毒感染的早期阶段, HIV-1病毒通过非特异性包吞进入细胞后转移至Rab5A阳性内涵体中, 然后通过病毒包膜介导的内体融合将病毒内核释放.

  6.   结论

  近十几年来, 随着纳米传感和光学成像技术的飞速发展, 基于光学显微术的单粒子传感在单细胞和单分子分析方面取得了许多重要进展^{[126, 127]}.但是, 单粒子传感技术的发展仍然面临一些挑战.通过纳米探针、光学成像技术和图像分析等数据处理等技术的不断发展创新, 可望克服现有单粒子光学传感技术的不足, 进一步提升其传感性能.

  首先, 新型纳米探针的研发对单粒子传感技术的发展至关重要.荧光探针易受光漂白、光闪烁等不利因素的干扰, 而基于LSPR效应的贵金属纳米探针则受制于其较大的尺寸, 容易对分子识别产生不利的影响.理想的纳米探针应该兼具光学性质稳定, 对研究对象干扰小, 并能同时灵敏地检测到周围环境微小变化等特点.此外, 获得可以特异性分子识别的纳米探针, 以及纳米探针的表面功能化也是一项重要需求^[128~134].

  其次, 进一步发展光学成像技术, 提高光学显微技术的时空分辨率、灵敏度和信噪比, 有助于我们更好地实现对样品的实时、原位检测.免标记检测是传感分析的发展趋势之一.比如, 基于折射率变化的SPRM技术^{[60, 72~73, 96]}、基于散射干涉的iSCAT^[74~76]以及基于吸收的光热显微成像^{[119, 120]}等光学成像技术的发展将为开展免标记的单粒子传感研究提供坚实的技术基础.

  最后, 图像分析等数据处理技术的不断完善创新, 可以使我们从海量的图像数据中获得更多更准确的信息.在大数据时代, 随着对单粒子高通量检测需求的不断增长, 对大量图像的高速准确分析的重要性也日益突出.通过引入机器视觉等人工智能技术, 发展高度自动化的图像分析方法, 可以进一步提高单粒子检测的效率.

  随着纳米材料的不断发展和各学科的交叉融合, 通过纳米探针、光学成像技术、图像分析技术等方面的发展完善, 可进一步提高基于光学显微术的单粒子传感器检测的特异性、准确性、稳定性和重现性, 使之在更多领域发挥更重要的作用.

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  图 1  (a) 几种不同材料组成的单粒子光谱和整体光谱的比较^[57].单粒子光谱线宽均明显窄于整体光谱线宽. (b)不同尺寸的GNP检测PSA-ACT复合物的浓度校正曲线^[58].尺寸小的纳米粒子具有更好的灵敏度

  Figure 1  (a) The spectrum linewidths of single nanoparticles are narrower than that of ensemble nanomaterials^[57]. (b) Calibration curves describing detection of the PSA-ACT complex concentrations using individual GNPs with different sizes. Nanosensors with smaller size have better detection sensitivity^[58]

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  图 2  暗场显微镜检测单粒子传感的原理示意图.左图为纳米粒子表面发生分子吸附前后光谱移动示意图.右图为CCD采集到的多个纳米粒子的暗场图像

  Figure 2  Representative single nanoparticle sensing mechanism using dark-field microscopy. A red shift occurs in the scattering spectrum of a single plasmonic nanoparticle when molecules adsorb on its surface

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  图 3  使用SPRM检测表面单个纳米粒子的聚集.当表面发生纳米粒子聚集时, SPR信号的强度显著增强

  Figure 3  Single nanoparticle sensing by detecting single nanoparticle aggregation with SPRM. The intensity of SPR signal is significantly enhanced when the nanoparticles aggregate on the surface

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  图 4  不同发射波长的纳米晶体阵列传感示意图.当分析物与纳米晶体接触或接近时, 其光致发光会发生变化, 从而改变阵列的平均光谱分布^[77]

  Figure 4  An array consisted of fluorescent nanocrystals with different emission wavelengths. Molecules coming into contact with (or in close proximity to) a nanocrystals spot will affect its photoluminescence, consequently changing the averaged spectral profile of the array^[77]

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  图 5  (a) 基于暗场显微镜的Hg²⁺传感示意图, (b)不同Hg²⁺浓度下GNP的暗场图像(A~D)及GNP的聚集比例与Hg²⁺浓度关系图(E)^[90].随着Hg²⁺浓度的增大, 暗场图像中聚集体(黄色)的比例升高.聚集态GNP的比例与Hg²⁺浓度的对数线性相关

  Figure 5  (a) Scheme of Hg²⁺ sensor at the single-particle level using dark-field microscopy. (b) Dark-field images of GNPs in the presence of different concentrations of Hg²⁺(A~D) and a plot of GNP aggregation percentage against the logarithm of Hg²⁺concentration (E)^[90]

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  图 6  单量子点传感器在PKA不存在(A~C)和存在(D~F)条件下的荧光图像(a)及Cy5计数与PKA浓度关系曲线(b).只有PKA存在时Cy5才能产生红色荧光且Cy5计数个数与PKA浓度的对数线性相关^[94]

  Figure 6  (a) Fluorescence images of single QD-based nano-sensors in the absence (A~C) and presence (D~F) of PKA. (b) Variance of Cy5 counts as a function of PKA concentration, only in the presence of PKA can Cy5 produce red fluorescence. Cy5 counts exhibit a linear correlation with the logarithm of PKA concentration^[94]

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  图 7  单个QD-655标记头尾的GST-Dyn331kD的步长测量, 两个头部在运动过程中速率不相等, 故两者的移动是相对独立的^[124]

  Figure 7  Step-size measurements of tail-and head-labeled GST-Dyn331kD with a single QD-655. The two heads are not equal in the rate constants during stepping, so their stepping are relatively independent^[124]

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