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  1    引言

  近红外发射的荧光探针因其具有对生物体较低的光学损伤, 较深的组织穿透力, 较低的自体荧光干扰等优势, 在癌症诊断领域具有重要的应用前景^[1~9].目前, 研究较为广泛的近红外荧光材料主要集中在无机量子点^[10~13]和有机荧光染料^{[1, 3, 14~18]}.无机量子点通常在氧化性环境中会释放出对生命体有害重金属离子^{[19, 20]}, 限制了其实际应用.然而, 传统商业化的荧光染料在生物应用领域虽有广泛报道^[21~25], 但由于强的分子间相互作用^{[26, 27]}, 使其聚集态荧光急剧降低, 这就是聚集导致荧光淬灭(aggregation-caused quenching, ACQ)现象.此外, 有机荧光染料通常具有较小的斯托克斯位移, 容易与背景光重叠, 不利于在生物成像领域的应用^[28].因此, 开发具有高亮度, 大斯托克斯位移, 低毒性, 好的光学稳定性的近红外荧光探针依然是一个挑战.

  在本文中, 通过两亲性聚合物Pluronic F-127共包覆油溶性AIE小分子TPE-Me和TPABDFN, 制备了一种稳定的高效近红外发射聚合物纳米粒子.设计合成的AIE近红外荧光染料TPABDFN荧光量子效率较低, 采用FRET的方式改变染料的荧光性质.以TPABDFN作为FRET的受体, 同时使用与TPABDFN光谱匹配的TPE-Me作为给体, 采用两亲性聚合物Pluronic F-127作为包覆基质, 利用亲疏水相互作用自组装制备了高效近红外发光聚合物纳米粒子TPABDFN/TPE-Me@F127(FRET NPs).FRET NPs具有很大的Stokes位移, 可以避免粒子本身的吸收和发射的相互影响, 同时近红外的发射还可以避开生物组织的自吸收, 有利于生物成像荧光信号的检测.由于Pluronic F-127聚合物良好的生物相容性, FRET NPs具有很好的生物相容性, 同时也具有良好的单分散性、抗光漂白性、低毒以及高的荧光亮度.用FRET NPs对HepG2细胞进行荧光生物成像, 得到很好的细胞成像效果.这些结果都表明制备的FRET NPs具有很好的生物成像的应用价值.

  2001年, 唐本忠等^[29]发现1-甲基-1, 2, 3, 4, 5-五苯基硅杂环戊二烯分子具有独特的光学性能, 即在溶液状态下, 有机分子基本没有荧光, 当分子处于聚集状态或者固体状态下, 其荧光发射明显增强, 并将这一现象命名为聚集诱导发光(Aggregation-induced Emission, AIE)现象.随后一系列具有AIE性质的荧光分子, 如四苯基乙烯, 二苯乙烯基蒽等, 被开发出来^[30~38].这些AIE分子通常具有扭曲的分子构型, 在稀溶液中可通过自由旋转和分子振动耗散能量, 从而降低荧光发射.但是在固体或聚集态条件下, 由于其分子内旋转和振动受到限制, 而使其发光显著增强^{[39, 40]}.已经有很多研究组以AIE分子为基础在生物检测和生物成像等领域开展了很多研究^[41~49].荧光共振能量转移(FRET)是一种受两种荧光团距离影响的光物理过程.在FRET体系中激发态的能量会由给体传递给受体^[50~52].与复杂的化学修饰相比, FRET策略可以非常简单直接的调节AIE分子在纳米粒子中的荧光性质.

  2    结果与讨论

  2.1    TPE-Me和TPABDFN分子的合成

  TPABDFN分子的合成步骤如图S1所示.其合成过程为:首先对溴苯乙腈在碘和甲醇钠等的催化作用下生成富马酸腈类化合物2 [2, 3-bis (4-bromophenyl) fumaronitrile], 再将其与通过Wittig反应制备成的化合物1分子通过Heck反应得到TPABDFN分子.TPE-Me分子是通过一种典型的McMurry反应制备(见支持信息).通过核磁与质谱(图S2、S3)证明了分子结构符合化合物的分子设计.

  2.2    聚合物包覆AIE分子纳米粒子的制备

  

  图1 TPABDFN/TPE-Me@F127纳米粒子的制备示意图

  Figure 1. Schematic illustration of the fabrication of TPABDFN and TPE-Me co-loaded NPs using Pluronic F-127 as the matrix

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  采用超声自组装的方法制备纳米粒子.其方法是将AIE分子和两亲性聚合物溶解在THF溶液中, 在加热超声条件下快速加入到水中, 在亲疏水相互作用下自组装制备纳米粒子.FRET NPs是通过聚合物Pluronic F-127将TPE-Me与TPABDFN共同包覆在纳米粒子中制备的(如图 1所示).油溶性的AIE分子与疏水链结合聚集成核, 亲水性的PEG链分布在粒子表面使粒子产生水溶性, 同时保证纳米粒子能够在水中均匀分散而不会相互聚集, 加热持续吹氮气将THF去除, 粒子逐渐稳定.得到FRET NPs具有很好的水溶性和单分散性.由图 2 DLS测试可见FRET NPs的粒径分布很均一, 其平均水合粒径在65 nm左右.通过透射电镜照片可以看出, FRET NPs的平均粒径大约在38 nm左右, 比DLS测试的结果要小, 这可能是由于在透射电镜的真空环境下, 粒子表面的亲水链段收缩从而使粒径减小.

  

  图2 TPABDFN/TPE-Me@F127纳米粒子的透射电镜图, 插图为DLS图

  Figure 2. SEM image of FRET NPs, the inset shows the DLS distribution of the NPs

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  2.3    TPABDFN分子及纳米粒子光物理性质

  首先, 研究了TPABDFN分子的光学性质, 包括它的吸收、发射、荧光量子效率等.图S4为TPABDFN分子在溶液和固体中的吸收发射谱, TPABDFN分子在THF溶液中有两个主吸收峰, 峰位分别位于345 nm和453 nm左右, 这主要是来源于分子间的π-π*跃迁.TPABDFN分子在THF溶液中表现出一个较宽的发射峰, 峰位位于785 nm左右.TPABDFN分子在溶液中表现出较弱的荧光发射, 荧光量子效率仅为1.03%, 寿命也仅为0.25 ns (图S5).这主要是因为在溶液中, TPABDFN分子外围的三苯胺基团能够自由的振动和旋转, 通过非辐射跃迁方式消耗激发态分子的能量, 使其效率和寿命降低, 发射峰变宽.TPABDFN溶液中的斯托克斯位移很大, 是330 nm, 这说明其基态和激发态的结构明显不同, 主要是TPABDFN分子中间的富马酸腈基团含有两个氰基, 具有很强的吸电子效应, 而通过双键与其连接的三苯胺基团上的N原子具有孤对电子, 可以作为很强的给体基团, 整个分子形成给-受体结构, 这种分子结构有助于减少激发态轨道间的重叠, 形成CT态.TPABDFN固体具有较强的荧光发射, 其发射峰位位于690 nm左右.TPABDFN的固态荧光寿命为4.5 ns, 固体的荧光量子效率增大到了5.9%, 相对于THF溶液来说荧光量子效率和寿命都有明显的提升, 这在一定程度上说明TPABDFN分子具有一定的AIE性质.

  

  图5 不同比例的TPABDFN/TPE-Me@F127纳米粒子的荧光发射光谱

  Figure 5. PL spectra of different ratios of TPABDFN/TPE-Me@F127 NPs

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  TPE-Me分子是一种典型的AIE分子, 其在有机良溶剂中没有发光, 其能量都以非辐射跃迁的方式释放掉, 而在聚集态时由于其分子振动转动等运动受限, 其能量主要以辐射跃迁的方式释放出去, 从而发出很强烈的荧光.为了研究TPE-Me纳米粒子的光物理性质, 我们制备了一系列不同染料负载量的TPE-Me@F127纳米粒子(制备过程见支持信息), 图S7为TPE-Me@F127纳米粒子的紫外可见吸收谱和发射谱, 由图可见, 随着纳米粒子染料浓度变化其吸收峰并没有明显变化, 其吸收拖尾可能是由于纳米粒子的光散射引起的.通过发射光谱可以看到, 随着染料负载量的增大, 纳米粒子最大发射峰都在480 nm左右.随染料负载量增加, 纳米粒子的荧光量子效率也逐渐增大, 当负载比例达到1:6时, 荧光量子效率达到最大6.89%, 随着染料继续增加, 荧光量子效率开始下降, 这是因为随染料的增加, 粒子核中的聚集体越来越大, 在紫外光激发下, 位于核中心的分子可能没有被激发导致的.

  

  图3 TPE-Me NPs和TPABDFN NPs的归一化的紫外吸收光谱和365 nm激发光激发下的荧光发射光谱

  Figure 3. Normalized UV-vis absorption and PL emission spectra (excitation wavelength: 365 nm) of TPABDFN NPs and TPE-Me NPs

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  图6 TPE-Me NPs, TPABDFN NPs和FRET NPs的荧光衰减曲线

  Figure 6. Fluorescence decay curves of TPE-Me NPs, TPABDFN NPs and FRET NPs. Instrument response (IRF) is also indicated

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  给受体之间的能量转移常常与给体在有无受体存在时的荧光寿命变化有关, 越大的寿命改变往往代表着越大的给受体间能量转移效率.为了研究FRET NPs的能量转移效率, 我们分别测试了TPABDFN NPs、TPE-Me NPs和染料TPABDFN、TPE-Me质量比1:16时FRET NPs的荧光寿命, 如图 6所示.表 1为三种粒子的一些光物理数据, 由表可知TPE-Me@F127纳米粒子的荧光寿命为7.09 ns, FRET NPs的荧光寿命为3.88 ns, 其FRET效率可由公式1-τ_DA/τ_D来估算, 其中τ_DA为FRET粒子的寿命, τ_D为无受体时纳米粒子的寿命.由衰减曲线计算得到FRET NPs的能量转换效率为45.3%, 表明TPABDFN与TPE-Me之间确实发生了能量转移.

  高亮度近红外荧光纳米粒子对于生物成像来说是非常重要的, 高亮度可以得到更高的荧光信号, 近红外光可以实现更深的成像深度和更小的组织损伤, 降低自体荧光背景的干扰.我们所制备的TPABDFN@F127纳米粒子本身已经是近红外发光, 如何提高其荧光量子效率是需要解决的问题.众所周知, FRET体系中给体分子的发射峰和受体分子的吸收峰有一定的重叠, 它们之间就很有可能发生能量转移.图 3所示, TPE-Me@F127纳米粒子的发射峰为480 nm, 而TPABDFN@F127纳米粒子的最大吸收峰也为480 nm, 几乎完全相同, 而且它们的峰位有很大面积的重叠, 因此这两个分子之间发生能量转移的可能性非常大.由图 4照片可知, TPABDFN@F127纳米粒子在365 nm的紫外灯照射下只有很微弱的红光发射, 而当TPABDFN与TPE-Me共同包覆在纳米粒子中, 纳米粒子可以发出很亮的近红外光.

  荧光共振能量转移效率及荧光信号输出与给受体之间的比例是有很大关系的, 因此研究不同给受体比例的纳米粒子的光物理性质是非常必要的.我们固定了TPE-Me和F127聚合物的质量比, 通过改变TPABDFN分子的负载量使TPABDFN/TPE-Me的质量比逐渐变化, 制备一系列FRET NPs (制备过程见支持信息), 研究它们的光物理性质.图 5为FRET NPs的荧光发射光谱(FRET NPs的紫外可见吸收光谱见S9).由图可知, 随着TPABDFN负载量的增加, 400~520 nm之间TPE-Me的发光急剧降低, 最后基本淬灭, 说明TPE-Me的能量转移给了TPABDFN分子.同时还可以看到纳米粒子的主要发光范围都在红光区域, 而通过其荧光量子效率测试可以看到, 其荧光量子效率随TPABDFN负载量的减少而增加, 当TPABDFN/TPE-Me质量比1:16时得到的纳米粒子的最大发射峰是645 nm, 荧光量子效率达到最大, 为19.9%, 这比TPABDFN@F127纳米粒子的最大量子效率提高了近10倍, 虽然其最大发射峰位有一定的蓝移, 但其发光区域依然有很大部分位于近红外区.同时可以看到在这个条件下, 纳米粒子具有较大的Stokes位移, 是265 nm, 这对于成像来说是非常有利的, 因此选用此条件制备纳米粒子作为生物成像的探针.采用365 nm的激光器作为光源长时间照射上述纳米粒子, 采集照射不同时间的荧光发射光谱, 如S10所示, 从图中可以看出, 照射时间从0到30 min, 发射峰的强度只有很小程度的减弱, 说明其有很好的光学稳定性和抗光漂白.

  

  图4 TPE-Me NPs、FRET NPs, TPABDFN NPs在365 nm紫外光照射下的荧光照片

  Figure 4. Fluorescent image of TPE NPs, FRET NPs, TPABDFN NPs under illumination of 365 nm UV light

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  为了进一步验证TPABDFN分子的AIE性质, 我们测试了不同THF/水比例下, TPABDFN聚集体的发射变化.我们设计的TPABDFN分子主要分为两个部分:作为受体的富马酸腈以及做为给体的三苯胺, 这是一种典型的D-A型分子, 这种分子一般都会存在扭曲的分子内电荷转移(TICT), 一般TICT分子的发光强度会随着溶剂极性增大而变弱, 发射峰位也有一定的蓝移.如图S6所示, TPABDFN的THF溶液具有一定的发光, 当水含量为10%时, 荧光强度马上降低, 这可能是由于溶剂极性增大, 分子形成TICT态引起的.随着水含量继续增加, 其荧光强度略有升高, 但强度依然不高, 这可能是分子没有形成较大的聚集体引起的, 此时主要表现为TICT主导分子的发光行为, 而不是AIE性质主导.当水含量增加到50%以上时, 分子聚集体开始大量形成, 荧光强度开始快速增大, 最终其荧光强度变为THF溶液中的两倍.以上数据表明, TPABDFN分子具有AIE和TICT两种性质.

  表1 TPE-Me NPs、FRET NPs和FRET NPs三种纳米粒子的光物理数据 Table1. The light physical data of TPE-Me NPs, TPABDFN NPs and FRET NPs

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  	Φf, max	τ/ns	kr/(107s-1)	knr/(107s-1)
  TPE-Me@F127	6.9%	7.09	0.959	13.1
  TPABDFN@F127	2.1%	2.44	0.86	40.1
  FRET	19.9%	3.88	5.13	20.6

  表1 TPE-Me NPs、FRET NPs和FRET NPs三种纳米粒子的光物理数据
  Table1. The light physical data of TPE-Me NPs, TPABDFN NPs and FRET NPs

  同样制备了不同TPABDFN负载量的纳米粒子(制备过程见支持信息).图S8为TPABDFN@F127纳米粒子的紫外可见吸收谱和发射谱, 由图可知, TPABDFN@F127纳米粒子的吸收峰位随染料负载量的变化没有明显的变化, 其最大吸收峰位为480 nm左右.TPABDFN@F127纳米粒子的发射峰位相对于固体来说出现了25 nm左右的红移, 这说明聚合物的包覆使TPABDFN分子与溶剂隔绝开来, 使其TICT效应降低, 其荧光强度的增加说明TPABDFN分子在纳米粒子中堆积的更紧密, 限制了其分子运动, 增加了辐射跃迁几率.当负载比例达到1:30时, TPABDFN@F127纳米粒子荧光量子效率是2.11%, 这也在一定程度上证明了TPABDFN分子具有AIE性质.但是TPABDFN@F127纳米粒子的荧光量子效率其实是很低的, 这在生物成像应用方面是一个不利的因素.

  2.4    细胞毒性试验与细胞成像

  FRET NPs的体外细胞成像研究是通过共聚焦荧光显微镜(CLSM)进行的.首先, 我们将HepG2细胞在生理环境下用50 mg•L^-1的FRET NPs培养4 h, 然后用4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)对细胞核染色10 min左右.在408 nm的激发光源下, 用共聚焦荧光显微镜分别收集DAPI的荧光信号和纳米粒子的荧光信号.如图所示, 图 8a是细胞明场下的成像, 图 8b是采集的纳米粒子红色荧光信号, 图 8c为DAPI的蓝色荧光信号, 以图 8c定位的细胞核作为参照, 图 8b、8c叠加得到图 8d, 观察到在HepG2细胞的细胞质中有强烈的红色荧光, 这表明FRET NPs能够被细胞摄入并滞留富集在细胞质中, 这些结果证明FRET NPs能够作为一种近红外成像探针对HepG2细胞进行荧光标记并得到很好的成像结果.在测试过程中即使长达10 min照射细胞, 细胞的荧光信号也没有明显的降低, 这说明制备的纳米粒子具有很好的抗光漂白性.

  材料的毒性对细胞成像来说是需要考虑的一个非常重要的因素.我们用人体肝癌细胞株HepG2通过MTT法对FRET NPs的细胞毒性进行了研究.图 7为HepG2细胞在0~200 mg•L^-1的不同FRET NPs浓度下培养12 h的细胞活性图.对于所有的培养浓度来说, 细胞活性基本都在95%以上, 这表明FRET NPs对细胞成像基本是无毒的且有很好的生物相容性.这表明我们制备的FRET NPs能够应用于生物成像领域不会对生物体产生危害.

  

  图7 HepG2细胞在不同FRET NPs浓度下培养12 h的细胞活性图

  Figure 7. Metabolic viability of HepG2 cell after incubation with FRET NPs suspensions for 12 h at different concentrations

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  图8 FRET NPs培养HepG2细胞荧光共聚焦显微镜成像

  Figure 8. Confocal imaging of HepG2 cell after incubation with 50 mg•L^-1 FRET nanoparticles

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  3    结论

  设计合成了近红外发射的AIE荧光分子TPABDFN, 基于荧光共振能量转移机理, 使用与TPABDFN光谱匹配的TPE-Me作为给体, TPABDFN作为受体, 采用超声自组装的方法, 利用两亲性聚合物Pluronic F-127将油溶性AIE小分子TPE-Me和TPABDFN共同包覆, 制备了一种稳定的近红外发射的聚合物纳米粒子.纳米粒子具有很大的Stokes位移, 可以减小粒子本身的吸收和发射的相互影响, 同时近红外发射还有利于避免生物组织的自吸收从而得到非常好的荧光成像效果.由于Pluronic F-127聚合物良好的生物相容性, FRET NPs具有很好的生物相容性, 同时也具有良好的单分散性、抗光漂白性、低毒以及高的荧光亮度.用FRET NPs对HepG2细胞进行荧光生物成像, 得到很好的细胞成像效果.这些结果都表明制备的FRET NPs具有很好的生物成像的应用价值.

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  图 1  TPABDFN/TPE-Me@F127纳米粒子的制备示意图

  Figure 1  Schematic illustration of the fabrication of TPABDFN and TPE-Me co-loaded NPs using Pluronic F-127 as the matrix

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  图 2  TPABDFN/TPE-Me@F127纳米粒子的透射电镜图, 插图为DLS图

  Figure 2  SEM image of FRET NPs, the inset shows the DLS distribution of the NPs

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  图 3  TPE-Me NPs和TPABDFN NPs的归一化的紫外吸收光谱和365 nm激发光激发下的荧光发射光谱

  Figure 3  Normalized UV-vis absorption and PL emission spectra (excitation wavelength: 365 nm) of TPABDFN NPs and TPE-Me NPs

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  图 4  TPE-Me NPs、FRET NPs, TPABDFN NPs在365 nm紫外光照射下的荧光照片

  Figure 4  Fluorescent image of TPE NPs, FRET NPs, TPABDFN NPs under illumination of 365 nm UV light

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  图 5  不同比例的TPABDFN/TPE-Me@F127纳米粒子的荧光发射光谱

  Figure 5  PL spectra of different ratios of TPABDFN/TPE-Me@F127 NPs

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  图 6  TPE-Me NPs, TPABDFN NPs和FRET NPs的荧光衰减曲线

  Figure 6  Fluorescence decay curves of TPE-Me NPs, TPABDFN NPs and FRET NPs. Instrument response (IRF) is also indicated

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  图 7  HepG2细胞在不同FRET NPs浓度下培养12 h的细胞活性图

  Figure 7  Metabolic viability of HepG2 cell after incubation with FRET NPs suspensions for 12 h at different concentrations

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  图 8  FRET NPs培养HepG2细胞荧光共聚焦显微镜成像

  Figure 8  Confocal imaging of HepG2 cell after incubation with 50 mg•L^-1 FRET nanoparticles

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  表 1  TPE-Me NPs、FRET NPs和FRET NPs三种纳米粒子的光物理数据

  Table 1.  The light physical data of TPE-Me NPs, TPABDFN NPs and FRET NPs

  	Φf, max	τ/ns	kr/(107s-1)	knr/(107s-1)
  TPE-Me@F127	6.9%	7.09	0.959	13.1
  TPABDFN@F127	2.1%	2.44	0.86	40.1
  FRET	19.9%	3.88	5.13	20.6

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