反应型比例荧光探针检测多巴胺

引用本文: 赵振盛, 郭旭东, 李沙瑜, 杨国强. 反应型比例荧光探针检测多巴胺[J]. 化学学报, 2016, 74(7): 593-596. doi: 10.6023/A16030160 shu

Citation: Zhao Zhensheng, Guo Xudong, Li Shayu, Yang Guoqiang. Reaction-Based Ratiometric Fluorescence Probes For Dopamine Detection[J]. Acta Chimica Sinica, 2016, 74(7): 593-596. doi: 10.6023/A16030160 shu

反应型比例荧光探针检测多巴胺

a.
中国科学院化学研究所北京 100190
b.
中国科学院大学北京 100049

通讯作者: 杨国强, gqyang@iccas.ac.cn

基金项目:
国家自然科学基金 21233011

国家自然科学基金 21206122

摘要: 多巴胺是一种重要的神经递质，可调控脑功能和人体的行为反应，因此对多巴胺浓度的检测是非常重要的.合成了基于芘的荧光探针羟基（米基）（芘-1-基）硼烷（HMPB），能够在缓冲溶液中对多巴胺快速响应，并且在较低浓度下都有响应，同时具有很好的选择性.为生物体内检测多巴胺提供了一种潜在的高灵敏性、高选择性的检测方法.

关键词:

English

Reaction-Based Ratiometric Fluorescence Probes For Dopamine Detection

a.
Institute of Chemistry Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190
b.
University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049

Corresponding author: Yang Guoqiang, gqyang@iccas.ac.cn

Received Date: 06 April 2016
Fund Project:
the National Natural Science Foundation of China

the National Natural Science Foundation of China

Abstract: Dopamine (DA) is one of neurotransmitters in the human central nervous system and plays a very important role on human behavior and brain function. It is necessary to detect dopamine and determine its concentration in organism. Of all the dopamine detection methods reported, fluorescence probes exhibit high efficiency, considerate specifity and potential for real-time detection. Considering the high quantum field and strong trend to form an excimer of pyrene fluorophore, a fluorescent probe hydroxy(mesityl)(pyren-1-yl)borane (HMPB) based on pyrenyl boron compound was designed, synthesized and utilized in dopamine detection. In the phosphate buffer solution (PBS) with the aid of surfactant decyltrimethylammonium bromide, the water-insoluble HMPB could show two fluorescent bands: a monomer band of peaked at 388 nm and an excimer band peaked at 484 nm. The solubility of HMPB improved after addition of DA because it could react with HMPB to form a new compound HMPB-DA and it is better to dissolve in water. The excimer pyrenyl, therefore, gradually dissociated to generate monomer pyrenyl. Accordingly, as the addition of DA, fluorescent intensity at 484 nm (I_{484 nm}) decreased, while intensity at 388 nm (I_{388 nm}) increased. Within 10 min, the fluorescence intensity reached saturation and the ratio of I_{388 nm} to I_{484 nm} have great changed after adding dopamine. HMPB exhibited significant fluorescent response when the concentration range of DA is 10 nmol/L to 600 nmol/L in 10 min, which matched the physiologic concentration of DA. The ratio of I_{388 nm} to I_{484 nm} could be utilized to determine the concentration of dopamine. The detection limit of HMPB was as low as 14.6 nmol/L. HMPB showed no response to common amino acids, saccharides, proteins, ions, catecholamin and other bioactive molecules, even if the interference molecules were at high concentrations. Meanwhile, HMPB can be used to detect dopamine in urine of organisms. With fast response, high sensitivity and accuracy, HMPB represented considerable potential to act as a DA detector in physiological environment, which could become a promising tool in biochemistry, molecular biology and diagnostics investigation.

Key words:

1    引言

多巴胺(DA)是一种儿茶酚胺类神经递质, 对脑功能和行为反应起到重要作用, 诸如感觉、信息传导和成瘾等神经过程都受其影响^[1].体液(例如, 尿液、血浆和中枢神经系统的细胞外液)中的多巴胺浓度是许多疾病的诊断指标^[2].例如, 亨廷顿病可增加多巴胺的分泌, 造成体内多巴胺浓度过高, 进而引发代谢能力衰竭, 甚至致命; 此外, 某些疾病会使体内多巴胺浓度过低, 继而引发肌肉失控、注意力下降等症状, 甚至导致帕金森病.因此对人体中多巴胺浓度的检测具有重要的科学意义和诊断学意义.

芘是一种量子产率较高的荧光团, 且易于形成激基缔合物结构.利用其单体与激基缔合物的发光光谱不同, 可以构造比例荧光型探针.比例荧光探针与传统的荧光发光(“Turn-on”)型探针相比, 由于其具有自参比特征, 检测的准确度更高, 且容易避免激发光源的影响.因此, 本文主要介绍了一种用于检测多巴胺的反应型比例荧光探针:羟基(米基)(芘-1-基)硼烷(HMPB). HMPB是一种油溶性芘取代硼化合物, 使用癸基三甲基溴化铵作为表面活性剂增溶后, 可溶于磷酸缓冲液(PBS).多巴胺的加入可使HMPB的荧光显著改变, 利用其不同波长发光强度的比值, 即可检测体系中多巴胺的浓度.

已有多种多巴胺检测方法见诸报道, 如电致化学发光法^[3]、电化学法^[4]、毛细管电泳^[5]、比色法^[6]、紫外可见光谱法^[7]、高效液相色谱法^[8]和流动注射分析法^[9]等.而这些方法都有一定的局限性, 例如, 人体中的尿酸和抗坏血酸在很大程度上限制了电化学方法的选择性.与之相比, 荧光光谱法具有成本低、操作简单、高重复性和灵敏度高等一系列优点, 因此已被越来越多地用于多巴胺检测^[10].如, 吕弋课题组利用(3-氨基丙基)三甲氧基硅(APTMS)包覆的氧化锌量子点在水中和血清中检测多巴胺, 在0.05～10.0 μmol/L范围内, 探针的荧光强度与多巴胺浓度成线性关系, 检出限低达12 nmol/L[10c]; 钟新华课题组利用基于腺苷包覆Cd/ZnS量子点的荧光传感器尿样中检测多巴胺, 检出限为29.3 nmol/L[10b].但是, 生命体系中多巴胺浓度一般为26～40 nmol/L, 甚至更低^[11].因此, 发展灵敏性更好、选择性更好的多巴胺荧光探针仍是一项巨大的挑战.

2    结果与讨论

2.1    探针的合成

HMPB的合成主要分为两步(图 1):先利用2-溴均三甲苯与硼酸三甲酯反应生成米基硼酸二甲酯(MOME)^[12]; 再利用1-溴芘在乙醚溶液中与正丁基锂反应生成有机锂化物, 加入MOME后即可制得HMPB. HMPB通过了核磁共振和质谱表征(图S3).

图1 加入DA(2 μmol/L)后0～10 min时间内HMPB (10 μmol/L)的发光光谱变化情况, 25 ℃, PBS (pH 7.4, 100 mmol/L)中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 1. Time-dependent fluorescent spectral changes of 10 μmol/L HMPB after the addition of 2 μmol/L DA in 0～10 min. Data were acquired at 25 ℃ in 100 mmol/L PBS (pH 7.4) with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant. λ_ex＝365 nm.

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图图式1 HMPB合成过程

Figure 图式1. Synthesis of HMPB

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2.2    探针在缓冲溶液中对多巴胺的荧光响应

由于探针HMPB是油溶性化合物, 在PBS (pH 7.4)中溶解度很低, 因此, 选用癸基三甲基溴化铵作为表面活性剂, 以增强荧光探针在PBS中的溶解度.表面活性剂的浓度会引起检测效果不同, 经过筛选得到当表面活性剂最终的浓度为0.14 mol/L时荧光探针检测多巴胺具有最好的效果.未加入多巴胺时, 浓度为10 μmol/L HMPB的PBS溶液在484 nm处的荧光强度高于388 nm处; 而加入最终浓度为2 μmol/L的多巴胺后, 388 nm处荧光强度逐渐增强, 484 nm处荧光强度逐渐减弱, 10 min内, 光谱变化基本达到饱和, 388 nm处荧光强度不再增加(图S1), 和484 nm处荧光强度的比值增加了7倍左右(图 1).因此, 可以通过反应前后荧光的变化来检测多巴胺.上述过程中HNPB的吸收光谱基本没有变化(图S2).

2.3    探针的可能检测机理

图2 加入DA前、后HMPB (10 μmol/L)的荧光光谱, PBS (pH 7.4)中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 2. Fluorescence spectra of HMPB (10 μmol/L) before and after addition of DA. Data were acquired at 25 ℃ in 100 mmol/L PBS (pH 7.4) with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant. λ_ex＝365 nm.

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芘基非常容易形成激基缔合物, 在癸基三甲基溴化铵胶束中, HMPB的芘基有一部分以激基缔合物的形式存在.故癸基三甲基溴化铵增溶的HMPB PBS溶液的荧光光谱呈现两组发光峰(图 2), 长波长的发光可归因于芘的激基缔合物发光, 短波长的发光可归因于芘的单体发光. HMPB与多巴胺的反应如Eq. 1所示. HMPB与多巴胺的反应产物HMPB-DA的溶解性水溶性优于HMPB, 芘基的激基缔合物逐渐解离生成芘基单体.因此, 随着多巴胺的加入, HMPB的发光光谱长波长峰逐渐减弱, 短波长峰逐渐升高.

2.4    探针对多巴胺的定量检测

由图 3可知, 在10 min时, 10 μmol/L HMPB对不同浓度的多巴胺有不同的荧光响应.在10～600 nmol/L的范围内, 随着多巴胺浓度增加, 388和484 nm处荧光强度的比值(I_{388 nm}/I_{484 nm})不断增加.同时在10～600 nmol/L的范围内, I_{388 nm}/I_{484 nm}与多巴胺浓度间呈良好的线性关系, 这一浓度范围与生物体内多巴胺浓度范围匹配.通过计算可以得到探针HMPB对多巴胺的检出限为14.6 nmol/L, 与现有报道对比, 该值为较低水平.因此, HMPB的适用浓度范围和灵敏度都满足生物实验的需求.

图3 加入不同浓度DA (10～600 nmol/L) 10 min后HMPB (10 μmol/L)的I_{388 nm}/I_{484 nm}与DA浓度的关系. 25 ℃, PBS (pH 7.4, 100 mmol/L)中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 3. Concentration-dependent fluorescence spectral changes of 10 μmol/L HMPB after the addition of 10～600 nmol/L DA in 10 min: relationship between I_{388 nm}/I_{484 nm} of HMPB and concentration of DA added. Data were acquired at 25 ℃ in 100 mmol/L PBS (pH 7.4) with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant. λ_ex＝365 nm

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2.5    探针的选择性

图4 加入DA (2 μmol/L)和不同干扰物质(0.5 mmol/L)(左旋多巴和去甲基肾上腺素浓度为10 μmol/L) 10 min后, HMPB的I_{388 nm}/I_{484 nm}. 25 ℃, PBS (pH 7.4, 100 mmol/L)中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 4. I_{388 nm}/I_{484 nm}of HMPB after addition of DA (2 μmol/L) and interference reagents (0.5 mmol/L) in 10 min. Data were acquired at 25 ℃ in 100 mmol/L PBS (pH 7.4) with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant. λ_ex＝365 nm

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生物体内含有多种与多巴胺类似的化合物, 可能对HMPB的检测过程产生干扰.因此我们选取了生物体内的氨基酸、谷胱甘肽、葡萄糖、ATP、儿茶酚胺、阴阳离子等, 测试HMPB对这些干扰物质的响应性.当添加的干扰物质浓度达到0.5 mmol/L (L-DOPA、去甲肾上腺素浓度为10 μmol/L), HMPB的荧光光谱对除了去甲肾上腺素外其他干扰物未发生显著变化.而除了特殊的研究对象(如肾上腺), 生物体内多巴胺的浓度是去甲肾上腺素的浓度的几十倍, 甚至几百倍, 在这种情况下可以忽略去甲肾上腺素在多巴胺检测过程中的干扰.因此, HMPB对多巴胺表现出具有较高的选择性.

2.6    探针在尿液体系中对多巴胺的响应

生命体液中的多巴胺浓度是许多疾病的诊断指标, 接下来我们研究了在生命体液中HMPB对多巴胺的响应.我们选取了含有一定量多巴胺的尿液作为检测体系.首先在尿液体系中加入含有表面活性剂的HMPB溶液, 然后再加入多巴胺水溶液, 检测20 min内HMPB荧光光谱变化.实验结果显示加入多巴胺前后, I_{388 nm}/I_{484 nm}变化了2倍左右(图 5).相比在缓冲溶液中, 在尿液中HMPB对多巴胺响应比较缓慢, 其中可能的原因是尿液中含有的化学物质, 也可以起到表面活性剂的作用, 造成HMPB与多巴胺的反应比较慢.尽管如此, 实验结果说明HMPB可以在生命体液中检测外源多巴胺.

图5 加入DA (10 μmol/L)后20 min时间内HMPB (10 μmol/L)的I_{388 nm}/I_{484 nm}变化情况, 尿液中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 5. I_{388 nm}/I_{484 nm}changes of 10 μmol/L HMPB after the addition of 10 μmol/L DA in 20 min and in urine with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant, λ_ex＝365 nm

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3    结论

本文设计合成了用于检测多巴胺的比例荧光探针HMPB, 并利用表面活性剂使其应用于PBS缓冲溶液中. HMPB可与多巴胺反应生成水溶性更好的产物HMPB-DA, 此过程中HMPB的芘基激基缔合物逐渐解离, 故HMPB对多巴胺呈现显著的比例荧光响应, 可在10 min内完成检测, 且呈现明显的浓度效应, 可在10～600 nmol/L范围内检测多巴胺的浓度, 检出限低达14.6 nmol/L. HMPB对生物体内多种潜在干扰物都没有荧光响应, 呈现出对多巴胺的较强的选择性.同时可以在生命体液尿液中检测多巴胺, 因此, HMPB是一种高效、灵敏、准确的多巴胺比例荧光探针, 为在生物体内检测多巴胺提供了一种潜在的、有效的方法.

4    实验部分

MOME的合成见参考文献[1]. HMPB的合成:氩气保护下, 将0.56 g (2 mmol) 1-溴芘的25 mL新蒸乙醚溶液冷却至－78 ℃, 然后缓慢滴入正丁基锂溶液(1.6 mol/L, 2.5 mL, 4 mmol), 滴加完毕后, 低温反应1 h, 升至室温, 继续搅拌2 h.然后再次降温到－78 ℃, 滴入MOME乙醚溶液0.28 g (1 mmol), 滴加完毕后反应30 min, 升至室温, 搅拌过夜.然后加入20 mL稀盐酸, 继续搅拌0.5 h.用二氯甲烷萃取3次, 收集有机相, 抽干溶剂后用石油醚重结晶, 得到黄色晶体0.67 g, 1.9 mmol, 产率为96%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.214 (d, J＝12 Hz, 1H), 8.302 (d, J＝10 Hz, 1H), 8.268 (t, J＝8 Hz, 2H), 8.197 (t, J＝8 Hz, 2H), 8.140 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 8.09 (d, J＝8 Hz, 1H), 8.062 (t, J＝12 Hz, 1H), 6.975 (s, 2H), 6.346 (s, 1H), 2.417 (s, 3H), 2.332 (s, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 138.27, 136.19, 135.72, 133.80, 131.13, 130.64, 128.87, 127.56, 127.42, 125.73, 125.44, 125.40, 124.73, 124.63, 124.27, 22.20, 21.25. GC-MS m/z calcd: 348.17, found: 348.
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图式1 HMPB合成过程

Scheme 1 Synthesis of HMPB

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图 1 加入DA(2 μmol/L)后0～10 min时间内HMPB (10 μmol/L)的发光光谱变化情况, 25 ℃, PBS (pH 7.4, 100 mmol/L)中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 1 Time-dependent fluorescent spectral changes of 10 μmol/L HMPB after the addition of 2 μmol/L DA in 0～10 min. Data were acquired at 25 ℃ in 100 mmol/L PBS (pH 7.4) with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant. λ_ex＝365 nm.

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图 2 加入DA前、后HMPB (10 μmol/L)的荧光光谱, PBS (pH 7.4)中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 2 Fluorescence spectra of HMPB (10 μmol/L) before and after addition of DA. Data were acquired at 25 ℃ in 100 mmol/L PBS (pH 7.4) with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant. λ_ex＝365 nm.

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图 3 加入不同浓度DA (10～600 nmol/L) 10 min后HMPB (10 μmol/L)的I_{388 nm}/I_{484 nm}与DA浓度的关系. 25 ℃, PBS (pH 7.4, 100 mmol/L)中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 3 Concentration-dependent fluorescence spectral changes of 10 μmol/L HMPB after the addition of 10～600 nmol/L DA in 10 min: relationship between I_{388 nm}/I_{484 nm} of HMPB and concentration of DA added. Data were acquired at 25 ℃ in 100 mmol/L PBS (pH 7.4) with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant. λ_ex＝365 nm

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图 4 加入DA (2 μmol/L)和不同干扰物质(0.5 mmol/L)(左旋多巴和去甲基肾上腺素浓度为10 μmol/L) 10 min后, HMPB的I_{388 nm}/I_{484 nm}. 25 ℃, PBS (pH 7.4, 100 mmol/L)中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 4 I_{388 nm}/I_{484 nm}of HMPB after addition of DA (2 μmol/L) and interference reagents (0.5 mmol/L) in 10 min. Data were acquired at 25 ℃ in 100 mmol/L PBS (pH 7.4) with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant. λ_ex＝365 nm

1. Blank control, 2: Arg. 3: His. 4: Lys. 5: Ser. 6: Gln. 7: Cys. 8: Tyr. 9: Trp. 10: Gly. 11: Hcy. 12: Glu. 13: GSH. 14: glucose. 15: KI. 16: NaCl. 17: MgCl₂. 18: CaCl₂. 19: BSA. 20: AA. 21: ATP. 22: ADP. 23: L-DOPA (10 μmol/L). 24: NE (10 μmol/L). 25: DA.

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图 5 加入DA (10 μmol/L)后20 min时间内HMPB (10 μmol/L)的I_{388 nm}/I_{484 nm}变化情况, 尿液中, 癸基三甲基溴化铵(0.14 mol/L)为表面活性剂, λ_ex＝365 nm

Figure 5 I_{388 nm}/I_{484 nm}changes of 10 μmol/L HMPB after the addition of 10 μmol/L DA in 20 min and in urine with decyltrimethylammonium bromide (0.14 mol/L) as a surfactant, λ_ex＝365 nm

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