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  1    引言

  液相色谱是蛋白质分离纯化的有力工具^{[1, 2]}, 但对于成分复杂的蛋白质样品, 仅用一维单模式色谱很难提供足够的分辨率将目标蛋白纯化至所需纯度. 二维液相色谱(two-dimensional liquid chromatography, 2DLC)是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统, 通过柱切换技术实现样品在一维和二维色谱柱之间的流动. 这种2DLC的两种不同模式的组合一般认为具有分离的正交性(即保留机理不同), 对于完全正交的二维色谱系统, 理论上系统的分辨率是对应每一种一维模式分辨率平方和的平方根, 峰容量是对应每一种一维模式峰容量的乘积^[3]. 在一维色谱中没有达到完全分离的组分, 有可能在二维系统中被较好的分离, 所以2DLC分辨率高, 峰容量大, 分离能力强, 可实现复杂样品的高通量分析, 已成为蛋白质组学等复杂样品分离分析的关键技术 ^[4]. 通常, 一根色谱柱只能利用一种分离模式对生物大分子进行分离纯化, 只能“一柱一用”, 所以目前2DLC的构建就需要两根分离模式完全不同的色谱柱. 此外, 样品如何在两根色谱柱之间进行切换以及两种模式流动相之间的兼容性问题一直是限制2DLC发展的瓶颈^[5].

  混合模式色谱(Mixed mode chromatography, MMC)是利用蛋白质与固定相配基之间多种相互作用进行分离的色谱模式, 具有高选择性、高负载量等优点^[6]. 最近我们课题组设计合成出了一类同时具有离子交换(ion exchange chromatography, IEC)和疏水色谱(hydrophobic interaction chromatography, HIC)性能的新型双功能高效色谱分离介质^[7～10]. 该介质在高盐浓度下表现为HIC的性质, 可作为HIC固定相使用; 而在低盐浓度条件下表现为IEC的性质, 可作为IEC固定相使用. 因此, 用一根色谱柱就可实现在IEC和HIC两种模式下对蛋白质的高效分离, 具有“一柱二用”的功能, 被形象地称之为“2D色谱柱”. 以此为基础, 利用阀切换技术, 采用一根IEC/HIC双功能色谱柱构建了2DLC分离系统, 称之为单柱二维液相色谱(two-dimensional liquid chromatography with one single column, 2DLC-1C)^[11]. 与常规2DLC不同的是, 2DLC-1C在一根色谱柱上就可实现HIC-IEC或IEC-HIC二维分离, 无疑该技术的发展将给传统的2DLC技术带来一场技术革新.

  2DLC通常将反相色谱(reversed-phase liquid chromatography, RPLC)作为第二维色谱使用^[12], 但蛋白质经RPLC 分离后会变性失活. 由于IEC和HIC是在盐水体系中对蛋白进行分离, 其色谱条件温和, 因此IEC和HIC被认为是整体活性蛋白分离纯化的最佳选择. 耿等^[13]虽然利用在线2DLC-1C对牛胰腺中细胞色素C进行了分离纯化, 但样品的收集和阀门的切换动作都是手动进行的. 最近我们对2DLC-1C分离系统进行了改造升级, 通过控制器对阀门的切换动作进行控制, 同时与计算机串联, 设计了阀门切换时间程序, 根据样品的色谱出峰时间, 完成样品的自动采集和二次自动进样. 整个分离过程完全通过系统自动控制, 称之为色谱专家分离系统(ChromatoExpert). 本文将利用该系统采用在线2DLC-1C技术对蛋清中活性蛋白进行分离, 建立一种整体活性蛋白快速分离纯化的新方法.

  2    结果与讨论

  2.1    SCX/HIC双功能色谱柱对标准蛋白的保留

  

  图1 SCX/HIC双功能色谱柱在疏水作用色谱(a)和强阳离子交换色谱模式(b)下对蛋白的色谱分离图

  Figure 1. Chromatograms of standard proteins separated with SCX/HIC dual-function column (50×4.6 mm I.D) in the HIC (a) and SCX modes (b), respectively

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  以硅胶为基质, 将磺酸基和苄基键合到硅胶表面, 合成了一种新型的强阳离子交换(strong cation exchange chromatography, SCX)/HIC双功能式色谱填料^[10]. 该固定相在低盐浓度下表现出SCX的性质, 在较高盐浓度下表现出HIC的性质. 图 1为该双功能色谱柱在SCX和HIC两种模式下对标准蛋白的色谱分离图. 从图中可看出该色谱柱在SCX和HIC模式下均能对蛋白质实现高效分离, 所以该色谱柱具有“一柱二用”的功能. 深入研究了蛋白质在两种分离模式下的质量和活性回收率、吸附量、重现性、柱寿命以及配基疏水性、pH、流速、梯度模式对蛋白质分离的影响, 探讨了蛋白质在该色谱柱上的混合模式保留机理. 结果表明该色谱柱具有高分辨率、高负载量、重现性好、使用寿命长等特点^[10], 可代替两根常规的SCX和HIC色谱柱对蛋白质进行分离纯化.

  2.2    在线2DLC-1C的构建

  由于SCX和HIC均采用盐水体系做流动相, 在SCX模式下, 蛋白质在低盐浓度下保留, 在高盐浓度下被洗脱, 而在HIC模式下恰恰相反, 因此二者可共用相同的流动相. 研究表明^[10], 在硫酸铵盐水体系中, 随盐浓度增大蛋白质在此SCX/HIC双功能色谱柱上的洗脱曲线呈现U型, 且在两种分离模式下均有很好的分离效果, 表明二者可共用相同的流动相. 在进行二维分离时, 只需通过调节两种流动相之间的配比, 即可完成两种分离模式之间的快速切换, 既避免了不同模式之间流动相不兼容的问题, 又缩短了系统的平衡时间.

  虽然IEC和HIC被认为是活性蛋白分离纯化的最佳组合, 但采用2DLC-1C分离蛋白质, 存在IEC和HIC分离模式中哪一个作为第一分离模式, 即分离模式排序的问题. 从理论上讲, 可以仅通过改变流动相中强和弱的洗脱液顺序就能实现在同一根双功能色谱柱上用这两种机理对蛋白进行正交二维色谱分离. 哪一种模式在先都不重要, 取决于样品溶液的组成和目标蛋白在两种分离模式下保留的强弱.

  

  图3 卵清蛋白(a)和卵转铁蛋白(b)在疏水模式下的非同步进样色谱图

  Figure 3. The chromatograms of ovalbumin (a) and ovotransferrin (b) separated by HIC with nonsynchronous sampling

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  由于所合成的SCX/HIC双功能色谱柱在SCX和HIC两种模式下对蛋白质均可进行高效分离, 而且二者的分离机理完全不同是正交的. 基于这种IEC/HIC双功能色谱分离介质, 利用阀切换技术, 采用一根该双功能色谱柱构建了在线2DLC-1C分离系统, 如图 2所示.

  

  图2 在线单柱二维液相色谱流路图

  Figure 2. Schematic representation of the instrumentation used for comprehensive on-line separation of intact protein by 2DLC-1C

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  图4 卵清蛋白(a)和卵转铁蛋白(b)的保留时间对进样时间作图

  Figure 4. Retention time T_R vs. sampling time T_inj for ovalbumin (a) and ovotransferrin (b)

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  生物大分子与小分子在色谱中的保留行为有很大的差别. 小分子的保留与柱长有关而蛋白质的保留几乎与柱长无关^[14]. 耿等^[15]研究表明在HIC中, 蛋白的保留存在着双变量分离机理, 即由随进样时间变化的“迁移区(MR)”和不随进样时间变化的“停滞区(SR)”的双变量参数控制的. 如果进样时间在停滞区之前, 物质的出峰时间不变, 这一事实表明在该特定的保留时间之前存在着一个可供利用的“进样区域”, 在该区域内的任意一处进样, 包括了在该区域内的不同进样体积、洗脱剂浓度和样品浓度对蛋白质的保留均无影响. 图 3为在HIC模式下, 采用非同步进样的方式测定ovotransferrin和ovalbumin在不同进样时间T_inj下的保留时间T_R. 以进样时间T_inj对保留时间T_R作图(图 4), 计算得到ovotransferrin和ovalbumin的临界进样时间分别为15.17 min和19.54 min. 由双变量机理可知, 在进样时间小于临界进样时间时, ovotransferrin和ovalbumin的出峰时间均保持不变, 此时对应的(NH₄)₂SO₄浓度分别为1.48 mol/L和1.02 mol/L, 即当进样时的样品溶液的盐浓度大于临界浓度时, 可保证样品在第二维分离时完全保留. 通过在原来一维色谱系统的基础上, 增加一个外置的泵和一个在线 混合器, 在进样时通过调节外置泵与原流路的流速比, 增加样品溶液的盐溶度, 使样品溶液中的盐浓度位于进样区内, 实现样品从第一维向第二维分离模式的定量转移.

  当第一维采用IEC分离模式, 第二维采用HIC模式时, 经第一维IEC分离, 将不保留或者未完全分离的组分分别在线定量地收集于5 mL样品环中, 此时样品溶液的盐溶度较低, 如果直接大体积进样进行第二维HIC分离, 会导致前端样品由于溶液盐溶度太低, 在HIC模式下无法保留而导致样品损失. 第一维分割收集的馏分如何能定量转移到第二维以及如何进行溶剂交换是实现2DLC-1C的关键.

  2.3    在线2DLC-1C对标准蛋白的分离

  将在线2DLC-1C分离系统用于标准蛋白的分离, 结果如图 5所示. 八种标准蛋白经过第一维SCX分离后只有RNase B、RNaseA和lysozyme被完全分离, 而ovalbumin、BSA和insulin三种酸性蛋白不保留而随溶剂峰直接流出色谱柱, 收集其馏分于样品环1中. α-chymotrypsin A和cytochrome C有部分重叠, 不能完全分离, 亦收集其馏分于样品环2中. 当第一维SCX模式梯度分离完成后, 用100% 3.0 mol/L (NH₄)₂SO₄溶液交换5 min, 将其转变为HIC模式后, 再将样品环1中第一维不保留的三种酸性蛋白馏分进入色谱柱, 进行第二维HIC模式分离. 经过HIC分离后, ovalbumin、BSA和insulin三种酸性蛋白被完全分离. 以类似的步骤再将样品环2中未完全分离的馏分α-chymotrypsin A和cytochrome C进行HIC分离. 经HIC二维分离后, 二者亦被完全分离. 所以, 利用SCX/HIC双功能色谱柱所构建的在线2DLC-1C在2 h内可完成8种蛋白的快速分离.

  

  图5 在线单柱二维液相色谱对标准蛋白的分离图

  Figure 5. Chromatogram of eight kinds of proteins separated by on-line 2DLC-1C

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  2.4    在线2DLC-1C对蛋清中活性蛋白的分离

  

  图6 在线单柱二维液相色谱对鸡蛋清中蛋白的分离图(a)和电泳图(b)

  Figure 6. Chromatogram (a) and SDS-PAGE analysis (b) of egg white separated by on-line 2DLC-1C

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  鸡蛋清中含有丰富的蛋白质、脂类、碳水化合物等物质, 其中蛋白质主要包括卵清蛋白(ovalbumin, 54%)、卵转铁蛋白(ovotransferrin, 12%)、卵粘蛋白(ovomucin, 3.5%)和溶菌酶(lysozyme, 3.4%)^[16], 这些蛋白具有独特的功能, 在食品加工和药物上被广泛使用^[17～20]. 本文采用SCX/HIC双功能色谱柱, 利用在线2DLC-1C对蛋清中的活性蛋白进行快速分离纯化. 针对蛋清样品, 我们采用SCX-HIC分离顺序. 因为若采用HIC-SCX分离顺序, 由于HIC是一种通用型色谱, lysozyme、ovalbumin和ovotransferrin三种蛋白在HIC模式下均可保留, 但lysozyme的色谱峰分别与后两者重叠而不能完全分离, 因此需要收集这三个组分的馏分再进行第二维SCX分离. 但是, 酸性蛋白ovalbumin (pI 4.7) 和ovotransferrin (pI 6.1) 在SCX模式下是不保留的, 无法进行二维分离. 因此采用SCX-HIC分离顺序是最佳选择. 在线2DLC-1C对蛋清中的活性蛋白快速分离纯化如图 6a所示. 从图 6a可看出, 500 mL蛋清处理液经第一维SCX分离后, 仅有碱性蛋白lysozyme (Peak 2, pI 11.0) 被完全分离, 而酸性蛋白不保留随溶剂峰一起流出. 收集不保留馏分(Peak 1) 于样品环中. 不保留馏分经HIC二维分离后, ovotransferrin (Peak 3, pI 6.1) 和ovalbumin (Peak 4, pI 4.7) 被完全分离. 收集色谱峰1～4进行电泳分析, 结果如图 6b所示, 被分离出的溶菌酶、卵清蛋白和卵转铁蛋白纯度分别为95%、93%和97%, 质量分别为0.021、0.33和0.069 mg, 回收率分别为96%、93%和94%. 结果表明, 采用在线SCX/HIC单柱二维液相色谱可在70 min内完成对蛋清中三种活性蛋白的分离纯化.

  3    结论

  利用SCX/HIC双功能色谱柱构建的在线2DLC-1C在70 min内实现了对蛋清中的溶菌酶、卵清蛋白和卵转铁蛋白三种活性蛋白的快速分离纯化. 与常规2DLC 不同的是, 2DLC-1C在一根色谱柱上就可实现HIC-IEC或IEC-HIC二维色谱分离, 两种分离模式共用相同的盐水体系流动相, 解决了传统2DLC流动相不兼容的难题.

  目标产品可定量从上一维转移到下一维, 解决了目前全2DLC每次取样的体积仅为纳升(nL)到微升(L)难以应用于制备规模的难题. 在线2DLC-1C使蛋白质的分离纯化在一个密闭恒温系统中进行, 可防止样品污染和失活, 更易实现自动化操作和放大到制备规模, 在活性蛋白的快速分离制备和工业化生产方面具有广阔的应用前景.

  4    实验部分

  4.1    试剂与仪器

  LC-10AVP高效液相色谱系统, 包括高压泵, 紫外可见检测器, 系统控制器, 四元低压梯度仪, 脱气装置, 色谱工作站(日本Shimadzu公司); 超纯水系统(Cascada LS, Pall, 美国); 紫外可见分光光度计(UV-1601PC, 日本Shimadzu公司); 电泳仪(DYY-6C型, 北京市六一仪器厂); 高速冷冻离心机(Sorvall Evolution RC, 美国科峻仪器公司); 薄层扫描仪(CS-3000, 日本Shimadzu公司); 色谱专家(ChromatoExpert)系统其中包括: LC-10AVP高压泵(Shimadzu, 日本)、六通进样阀(Rheodyhe 7725i, 美国), 四通、六通、八通和十通切换阀(C5-2004、C5-2006、C5H-2008和C5H-2000) 以及八通(Z8M1) 和十通(Z10M1) 均购自瑞士VICI公司.

  色谱柱为50 mm×4.6 mm I.D.不锈钢管, 采用匀浆法装填由本实验室合成的SCX/HIC双功能色谱填料^[7].

  4.2    化学试剂

  溶菌酶(lysozyme, 蛋清)、核糖核酸酶A (RNaseA, 牛胰脏)、细胞色素-C (cytochrome-C, 马心)、核糖核酸酶B (RNaseB, 牛胰脏)、α-糜蛋白酶原A (α-chymotrypsingen A, 牛胰脏)、肌红蛋白(myoglobin, 马心)、胰岛素(insulin, 牛胰脏)、卵白蛋白(ovalbumin, 蛋清)、卵转铁蛋白(ovotransferrin, 蛋清)、α-淀粉酶(α-amylase, 枯草杆菌)、蛋白质分子量标准(Marker, 分子量14200～97000) 购买自Sigma公司(St. Louse, MO, 美国). 考马氏亮兰R250为Fluka进口分装, 其它所用试剂均为分析纯.

  4.3    在线单柱二维分离系统对蛋白质的分离

  样品经第一维SCX色谱分离, 不保留或未完全分开的馏分通过阀切换技术分别收集于样品环中. 具体流路如图 2所示: 样品→进样阀1(2-3) →二位四通阀6(1-3) →二位四通阀7(2-1) →色谱柱→检测器→二位四通阀8(1-2) →waste. 收样时, 将二位四通阀8的阀门位置置于(1-3) , 流经二位四通阀5(3-1) →八位八通阀4(1) →定量环1→八位八通阀3(1) 流出, 收集一号样于定量环1. 样品1收集完后, 切换二位四通阀8的阀门位置于(1-2) . 通过切换八位八通阀3、4的阀门位置, 可将不同的样品收集于不同的样品环中. 第一维分离完成后, 系统进行缓冲液交换, 由SCX模式转换为HIC分离模式. 待系统平衡后, 进行在线进样和二维分离. 二维进样时, 切换八位八通阀于3(1) 位, 流动相流经样品环1→八位八通阀4(1) →二位四通阀5(1-2) →二位六通进样阀1(4-3) →二位四通阀6(1-2) →混合器→二位四通阀7(3-1) →色谱柱→检测器→二位四通阀8(1-2) →废液, 完成第二维HIC进样. 通过切换八位八通阀, 可将一维分离收集的馏分依次完成二维分离.

  4.4    色谱条件

  HIC模式: 流动相A液, 3.0 mol/L (NH₄)₂SO₄+0.02 mol/L KH₂PO₄, pH 6.5; B液, 0.02 mol/L KH₂PO₄, pH 6.5; SCX模式: 流动相A液, 0.02 mol/L KH₂PO₄, pH 6.5; B液, 0.02 mol/L KH₂PO₄+1.0 mol/L NaCl, pH 6.5.

  4.5    鸡蛋清的预处理

  用20 mmol/L KH₂PO₄溶液(pH 7.0) 将蛋清稀释5倍, 在4 ℃下缓慢搅拌1 h待沉淀完全后, 在4 ℃下12000 r/min离心20 min, 取上清液, 用0.45 μm微孔滤膜过滤, 4 ℃保存备用.

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  图 1  SCX/HIC双功能色谱柱在疏水作用色谱(a)和强阳离子交换色谱模式(b)下对蛋白的色谱分离图

  Figure 1  Chromatograms of standard proteins separated with SCX/HIC dual-function column (50×4.6 mm I.D) in the HIC (a) and SCX modes (b), respectively

  (a) HIC mode; mobile phase: Solution A, 3.0 mol/L (NH₄)₂SO₄+0.02 mol/L KH₂PO₄ (pH 6.5) ; Solution B, 0.02 mol/L KH₂PO₄ (pH 6.5) ; (b) SCX mode; mobile phase: Solution A, 0.02 mol/L KH₂PO₄ (pH 6.5) , Solution B, 0.02 mol/L KH₂PO₄+1.0 mol/L NaCl (pH 6.5) . The flow rate was 1.0 mL/min; linear gradient elution: 0→100% mobile phase B, 30 min; detection wavelength: 280 nm. Pressure: HIC mode 2.0～3.1 MPa, IEC mode 2.0～2.4 MPa. Peaks: 1. cytochrome c; 2. RNase A; 3. myoglobin; 4. ovalbumin; 5. lysozyme; 6. α-amylase; 7. insulin; 8. α-chymotrypsin A; 9. RNase B

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  图 2  在线单柱二维液相色谱流路图

  Figure 2  Schematic representation of the instrumentation used for comprehensive on-line separation of intact protein by 2DLC-1C

  1, Sample injector; 2, box for maintaining the temperature at 4 ℃; 3 and 4, eight-position valves; 5～8, three-position valves

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  图 3  卵清蛋白(a)和卵转铁蛋白(b)在疏水模式下的非同步进样色谱图

  Figure 3  The chromatograms of ovalbumin (a) and ovotransferrin (b) separated by HIC with nonsynchronous sampling

  Mobile phases in the HIC mode: Solution A, 3.0 mol/L (NH₄)₂SO₄+0.02 mol/L KH₂PO₄ (pH 6.5) ; Solution B, 0.02 mol/L KH₂PO₄ (pH 6.5) . The flow rate was 1.0 mL/min, linear gradient elution: 30 min, 0～100% mobile phase B; detection wavelength: 280 nm

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  图 4  卵清蛋白(a)和卵转铁蛋白(b)的保留时间对进样时间作图

  Figure 4  Retention time T_R vs. sampling time T_inj for ovalbumin (a) and ovotransferrin (b)

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  图 5  在线单柱二维液相色谱对标准蛋白的分离图

  Figure 5  Chromatogram of eight kinds of proteins separated by on-line 2DLC-1C

  Mobile phase is the same as that of HIC in Figure 1, Solutions B and A in the SCX mode and Solutions A and B in the HIC mode. Flow rate is 1.0 mL/min except for re-sampling with 5.0 mL/min and the detection wavelength is at 280 nm. The linear gradient elution program is represented by the dashed line in the chromatogram. Column pressure is about 2.0～3.5 MPa except for re-sampling with 15.0～15.8 MPa. Peaks: 1, BSA; 2, ovalbumin; 3, insulin; 4, RNase B; 5, RNase A; 6, α-chymotrypsin A; 7, cytochrome C; 8, lysozyme

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  图 6  在线单柱二维液相色谱对鸡蛋清中蛋白的分离图(a)和电泳图(b)

  Figure 6  Chromatogram (a) and SDS-PAGE analysis (b) of egg white separated by on-line 2DLC-1C

  (a) Chromatographic condition: Solution 1, 20 mmol/L KH₂PO₄ (pH 6.5) ; Solution 2, 20 mmol/L KH₂PO₄+3.0 mol/L (NH₄)₂SO₄ (pH 6.5) , linear gradient elution: 0～30 min, Solution 1％～33% Solution 2; 30～40 min, 100% Solution 2; 40～70 min, Solution 2～100% solution 1. The flow rate is 1.0 mL/min except for re-sampling with 5.0 mL/min and the detection wavelength is at 280 nm, Column pressure is about 2.0～3.5 MPa except for re-sampling with 15.0～15.8 MPa pressure. Sample size: 500 mL. (b) Lane: 1. marker; 2. fraction of peak 1; 3. fraction of peak 3; 4. fraction of peak 4; 5. Ovotransferrin; 6. fraction of peak 2; 7. lysozyme; 8. ovalbumin

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