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  1    引言

  整个PTP1B催化结构域在拓扑结构上形成8个α螺旋和12个β折叠,其中活性催化区域(P-loop)214～222位氨基酸构成刚性环状催化口袋,半胱氨酸Cys215去质子后的巯基对底物的磷酸进行亲核攻击,形成共价的硫代磷酰,带有正电荷的Arg 221和酸性氨基酸Asp181提供的质子可以稳定中间体,接着水分子被Asp181去质子化对中间体进行亲核攻击,得到脱去磷酸的酪氨酸蛋白和PTP1B蛋白^[6]. 1994年,PTP1B的晶体结构首次报道,通过对PTP1B晶体结构的分析发现,除去P-loop活性中心外,在Arg24和Arg254区域还存在着一个可以和磷酸基团等负电分子团相互作用的位点,且该位点与P-loop区域在空间上间隔较近. 为此,P-loop所在区域被称为A位点,而Arg24和Arg254等氨基酸组成区域被称为B位点^[7](图 1). 目前报道的PTP1B 小分子抑制剂从化学结构上有羧酸类、磷酸类、磺酸类及杂环类衍生物等结构^[6]. 此外,来源于天然植物的结构也有报道^[8]. 已知抑制剂中既有仅与催化中心的A位点结合的小分子,也有能结合A、B两个位点PTP1B抑制剂^[9～11]. 高选择性抑制剂的K_i值能达到(0.022±0.006) μmol•L^-1[12]. 其中,同时针对A、B两个位点的抑制剂通常具有更好的选择性^{[12, 13]}.

  

  图1 PTP1B表面电势图

  Figure 1. The electrostatic surface of PTP1B

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  利用基于片段筛选的方法获取能与两个位点结合的小分子片段,在此基础上进行合理化设计是得到双位点抑制剂的有效手段^{[12, 14, 15]}. 在前期的工作中,我们通过初步的研究已经得到一个PTP1B的抑制剂^[16]. 与已报道的基于NMR的片段筛选方法不同,为得到活性与选择性均更优的PTP1B抑制剂,我们采用两种与蛋白质晶体结构紧密结合的手段——结构辅助药物设计和药物分子片段筛选方法来设计新型PTP1B抑制剂. 以PTP1B蛋白质晶体为载体,通过高通量浸泡法使分子片段与晶体中蛋白质结合,利用X射线晶体衍射的方法确定蛋白结构以及与其有结合能力分子片段的结构,然后根据与PTP1B蛋白A和B点结合的分子片段用计算机辅助药物设计的方法设计出新的化合物,最后通过化学合成得到目标分子并对其进行体外活性及初步的毒性评价.

  酪氨酸磷酸酶(PTPs)是细胞应对外界刺激的一类重要的调节因子^[1]. 其中,1988年首次克隆并表达的酪氨酸磷酸酶PTP1B是公认的治疗Ⅱ型糖尿病药物的理想靶标蛋白^[2]. 它对胰岛素受体有负调控作用,在胰岛素非敏感的糖尿病人体内该蛋白含量明显偏高. 抑制PTP1B的活性可延长胰岛素受体的激活状态,使血液中更多的葡萄糖被摄入细胞内以降低血糖含量^[3～5].

  2    结果与讨论

  2.1    PTP1B蛋白样品和晶体的制备

  

  图2 (a) GST融合标签的PTP1B蛋白、(b) HIS融合标签的PTP1B蛋白及(c) PTP1B蛋白晶体图和衍射图其中图(a) 1,2,3道为去掉GST-tag后的PTP1B蛋白,图(b) 1,2,3道为没有切掉His-tag的PTP1B蛋白

  Figure 2. (a) 12% SDS-PAGE analysis of purified PTP1B with GST-tag,(b) 12% SDS-PAGE analysis of purified PTP1B with His-tag and (c) the crystal and diffraction pattern of PTP1B

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  图3 小分子片段与PTP1B相互作用三维结构图

  Figure 3. Cartoon representation of interactions between small fragments and active sites on the surface of PTP1B

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  通过构建不同的PTP1B质粒,优化该蛋白相应的纯化策略,最终获得大量的蛋白样品. 再通过结晶条件筛选和已有文献情况调研等分析综合,获得可以在室内X射线衍射仪上有较强衍射能力(＞2.1 Å)的晶体(图 2和图 3).

  2.2    晶体浸泡

  通过图 3可以看出,所获得5个片段分子中,化合物1和化合物2结合位点与已知位点(A位点以及B位点)在空间距离上较远,而化合物3～5距离基本落在A位点上,因此再以这三个分子与蛋白的结合为基础,进行计算机辅助药物设计.

  在获得PTP1B高衍射能力的晶体以后,利用本实验室自有的小分子片段库中768个片段分子进行反复浸泡筛选实验后,共获得5个片段分子与PTP1B有相互作用,如图 3所示.

  2.3    分子设计

  从目标化合物的结构来看,分子中的二苯乙酰胺的结构来自于片段3,苯甲酸甲酯结构片段则来自于14种PTP1B抑制剂中的8,9,10,16(图 4b).

  

  图5 (a)化合物20与PTP1B三维结合模式图和(b)化合物20在PTP1B蛋白表面结合图

  Figure 5. (a) The binding mode of compound 20 wtih PTP1B and (b) surface representation of PTP1B with compound 20. Carbon is in green for 20 and in purple for key active site residues

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  图4 (a) 14种与B位点结合的PTP1B抑制剂和(b)化合物20的设计思路示意图

  Figure 4. (a) 14 kinds of PTP1B inhibitors binding with B site and (b) the design of compound 20

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  以新设计的化合物20为配体,PTP1B为受体,通过分子对接研究二者的结合模式和作用机制. 图 5为对接结果图,图 5a显示化合物20与PTP1B三维结合模式,为了更便于观察分析,图 5b展示化合物20在PTP1B蛋白表面的结合. 结果显示化合物20很好地嵌合在A位点和B位点,同时化合物20与PTP1B蛋白上的Arg221,Ser216,Ala217,Asp48等关键氨基酸残基发生氢键相互作用. 对接计算结果说明目标化合物20与PTP1B蛋白A、B位点能较好地结合.

  通过晶体浸泡实验得到与PTP1B的A位点结合的小分子片段后,考虑利用已知能与B位点结合的PTP1B抑制剂作为模板,我们从已报道的PTP1B抑制剂中选取了不同结构类型且活性较好(IC₅₀(K_i): 2.4 nmol/L～22 μmol/L)的能与B位点相结合的14种PTP1B抑制剂(图 4a)^{[6, 12, 15, 17]}. 通过将化合物3～5与所选取的14种PTP1B抑制剂进行基于片段的药物筛选和对接计算,不同的小分子片段与选定14种抑制剂经片段重组后获得大量的潜在先导化合物分子(＞1000). 基于生成的候选化合物分子,通过分子对接软件SybylX1.1的评分功能,首先删除评分较低的化合物,对剩余的化合物分子,再通过C-score对输出结果进行评价. 通过分子对接中的多级筛选的流程删除计算结果较差和不能与A位点和B位点两位点同时结合的化合物,剩余化合物与PTP1B的作用模式和结合机制进行分析,结合数值筛选与PTP1B结合构象较好的化合物分子,再根据化学合成的可行性分析,我们最终选取化合物20作为目标化合物,对其进行合成和生物活性评价(图 4b).

  2.4    目标化合物的合成

  对目标化合物进行逆合成分析,可将其分为苯甲酸甲酯侧链及酪氨酸类似物两部分,分别合成后再连接,最后得到目标分子. 最终通过13步反应得到目标化合物20.

  2.5    目标化合物的酶活测试

  利用比色法测定化合物对PTP1B酪氨酸磷酸酶活性的抑制能力,PTP1B有去磷酸化作用,底物对硝基苯磷酸盐(pNPP)在PTP1B的作用下生成产物对硝基苯(pNP),在碱性条件下对硝基苯去质子化,生成黄色水溶性产物,在405 nm下有强的吸收峰. 如化合物对PTP1B有抑制作用,则反应体系中产物生成量减少,405 nm处吸光值减弱,酶反应速率下降.

  我们对目标化合物20进行了PTP1B的体外活性检测. 阳性对照为钒酸钠(广谱PTP1B抑制剂^[18]),其IC₅₀为(18.9±1.1) μmol/L. 化合物20的IC₅₀值达到了(3.4±1.2) μmol/L,优于阳性对照药(图 6).

  

  图6 化合物20 (a)及阳性对照药(b)的量效曲线图

  Figure 6. Drug effect graph of 20 (a) and sodium vanadate (b) against PTP1B

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  2.6    目标化合物的细胞活性测试

  

  图7 化合物20对HepG2细胞及胰岛素抵抗(IR)的HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响柱状图

  Figure 7. Effect of compound 20 on glucose consumption in insulin resistance (IR) of HepG2 and HepG2 cell

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  选用HepG2细胞,其来源于人的肝胚胎瘤细胞,是一种表型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株. 采用地塞米松刺激诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗^[19]. 经地塞米松处理的细胞对葡萄糖的利用率降低. 细胞经地塞米松处理后加入目标化合物20 24 h后,与对照组相比,细胞胰岛素抵抗的状态得以改善,对葡萄糖的利用率显著增加(P＜0.01). 在给药浓度为50 μmol•L^-1时,化合物20对胰岛素抵抗细胞的葡萄糖利用率的改善能力与阳性药匹格列酮相当(图 7).

  2.7    目标化合物初步的毒性评价

  

  图8 化合物20斑马鱼初步急性毒性测试结果

  Figure 8. Preliminary zebrafish acute toxicity test results of compound 20

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  使用斑马鱼幼鱼初步评价化合物20的急性毒性. 斑马鱼幼鱼采用2 d大孵化的野生型幼鱼,排于48孔板中,每孔放入10条幼鱼. 每个药物处理组共6孔幼鱼,药物梯度分别设为50,100,200,300,400,500 μmol•L^-1. 对照组中加入等量体积的DMSO. 显微镜下观察处理后6 h和24 h两个时间点幼鱼的毒性反应. 结果表明,化合物20在浓度为50和500 μmol•L^-1时,幼鱼的血流速度和体型均未出现异常反应,心跳数据与对照组相比没有显著差异,未有死亡(图 8). 由于临床上出现急性毒性反应的药物,在斑马鱼上通常在100 μmol•L^-1以下就会出现毒性反应,因此化合物20的毒性比较低微.

  2.4.2    苯丙氨酸类似物27的合成

  首先,对溴苯甲醛与手性碘代化合物进行Negishi偶联反应得到手性化合物26,然后在碱性条件下脱去甲酯基得到化合物27(图式2).

  

  图图式2 苯丙氨酸类似物片段的合成路线

  Figure 图式2. The synthetic route of compound 27

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  2.4.3    目标化合物20的合成

  

  图图式3 目标化合物的合成路线

  Figure 图式3. The synthetic route of target compound

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  化合物24与化合物27在TBTU和HOBt下缩合得到化合物28. 化合物28再与(S)-叔丁基亚磺酰胺反应生成手性化合物29. 接着与Boc-O-乙醇酸甲酯反应得到化合物30. 脱除叔丁基亚磺酰基后得到的化合物31再与苯乙酰氯反应得到化合物32. 至此目标化合物的基本骨架已经完成. 化合物33在酸性条件下脱除两个Boc保护基后,再用Boc酸酐保护氨基得到化合物34,最后经Dess-Martin氧化得到目标化合物20. 13步反应的总产率为1.7%(图式3).

  2.4.1    苯甲酸甲酯侧链24的合成

  由4-(N-叔丁氧羰基氨基)-1-丁醇为起始原料,与2,6-二羟基苯甲酸甲酯缩合得到化合物22. 通过苯甲基氧基保护酚羟基后,再用氯化氢二氧六环溶液脱去Boc保护基得到化合物24(图式1).

  

  图图式1 侧链的合成路线

  Figure 图式1. The synthetic route of compound 24

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  3    结论

  通过对PTP1B蛋白的大量表达、提纯和结晶条件优化等,获得有较强衍射能力(＞2.1 Å)的晶体. PTP1B蛋白晶体与768种小分子化合物进行浸泡,得到复合物晶体,再通过晶体衍射和结构解析,最终获得了PTP1B与小分子片段的结合信息及其小分子片段的化学结构. 考虑到在本实验中,所获得三个片段分子均落在PTP1B的A结合位点,因此引入其它已有结构中在B位点有相互作用的分子. 以片段分子以及B位点分子为基础,利用计算机辅助药物设计方法中的组合化学方法,将分子片段组合生成候选化合物分子库,再通过分子对接中的多级筛选详细分析候选化合物分子与PTP1B的结合模式设计和筛选目标化合物. 通过13步反应得到了目标化合物,并对其进行体外PTP1B活性及毒性的初步测试. 结果表明,目标化合物20对体外人重组PTP1B的IC₅₀值达到(3.4±1.2) μmol/L,优于阳性对照药; 此外,化合物20还能有效改善胰岛素抵抗细胞对葡萄糖的利用能力,其改善效果与阳性药匹格列酮相当. 初步的斑马鱼毒性检测表明,目标化合物在浓度为500 μmol/L时未对幼鱼产生明显毒性. 按照此思路获得的目标分子具有良好的活性及较低的毒性,未来可以此为先导化合物,进行进一步的研究与开发,以期获得高效低毒的新型PTP1B抑制剂.

  4    实验部分

  4.1    PTP1B蛋白的大量制备和高衍射能力晶体的实验室重复

  除去GST标签的PTP1B(1-321)[简称PTP1B (Δ321)]通过悬滴扩散法方法获得晶体,结晶条件为: 100 mmol• L^-1 HEPES-NaOH pH 7.5,200 mmol•L^-1 Mg(Ac)₂•4H₂O,5 mmol•L^-1DTT,沉淀剂为19%～21% PEG8000,生长温度为4 ℃. 利用此结晶条件,可以得到生长状态较好的蛋白晶体,室内光机分辨率最高可达到2.1 Å.

  将上述得到的较好晶体备选. 首先处理片段分子,用生长晶体的池液稀释至蛋白与化合物的摩尔浓度比为1:10; 再将片段分子溶液滴加在有较好晶体的玻璃片上,盖上玻片平衡30 min; 再将晶体放入进化合物滴并确保晶体的完整性,浸泡2～4 h; 最后将浸泡的晶体放入液氮后迅速冷却,并进行衍射数据收集.

  所有浸泡后的PTP1B晶体先通过衍射实验挑选分辨率在3 Å以上的样品进行数据收集. 数据收集后再通过同晶置换方法进行相位解析,对于在新的结构中出现连续的差值密度(信噪比＞3σ)的情况则将片段分子模型放入其中进行计算匹配.

  4.2    计算机辅助药物设计

  采用Sybyl X1.1软件中的Surflex-dock模型对新设计合成的化合物20和PTP1B蛋白的结合模式和作用机制进行研究. PTP1B蛋白晶体三维结构来自实验室解析的分辨率达到2.1 Å的PTP1B蛋白晶体. 蛋白的前处理步骤包括除去晶体结构中的水分子、加入氢原子、优化键能键角以及蛋白结构能量最小化. 化合物20的处理包括加氢原子、质子化以及能量最小化. 分子对接的活性位点根据site A和site B位点氨基酸定义. 最大输出构象设为20,其他参数均采用Sybyl X1.1的默认参数^[16].

  4.3    目标化合物的合成

  4.4    目标化合物酶活测试

  反应体系的缓冲液为50 mmol•L^-1 Tris-Cl,pH7.2,10 mmol•L^-1 NaCl,10% glycerol,0.1% BSA,在96孔板中总反应体系为100 μL,实验组每孔依次加入48 μL 100 nmol•L^-1的PTP1B,2 μL的 50 mmol•L^-1化合物,震荡30 s混匀,30 ℃孵育10 min,然后加入50 μL 50 mmol•L^-1 pNPP,震荡30 s混匀,每3 s测定1次405 nm光吸收,测定300次,同时设定加入磷酸酶抑制剂Na₃VO₄的孔为阳性对照组,不含化合物的孔为阴性对照组,反应在30 ℃下进行,平行测定3次. 阴性对照组酶反应初速率为V₀,实验组酶反应初速率为V_i,V_i/V₀表示加入化合物后酶的剩余活性,因此化合物对PTP1B的抑制活性(抑制率)为1 -V_i/V₀. 将化合物进行梯度稀释,测定不同浓度下化合物对PTP1B的抑制率,用Origin软件进行分析得出化合物的半数抑制浓度IC₅₀值.

  4.5    目标化合物糖耐量试验

  4.3.5    (S)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(对甲酰苯基)丙酸(27)的合成

  室温下,向100 mL三口瓶中加入30 mL二氧六环、甲醇、水混合溶剂[V:V:V=1:1:1]及化合物26 (1.6 g,5.2 mmol),搅拌5 min后冰浴下加入2 mol•L^-1 NaOH溶液(5.2 mL,10.4 mmol),室温搅拌40 min后停止反应. 向体系中加入40 mL水,用甲基叔丁基醚萃取,弃有机相. 水相再用1 mol•L^-1 HCl溶液调pH 3～4,然后用甲基叔丁基醚萃取,有机相干燥,抽滤,浓缩得1.24 g浅棕色固体,产率81%. ¹H NMR (400 MHz,DMSO) δ: 1.27 (d,J=22 Hz,9H),2.80～3.01 (m,1H),3.13 (d,J=10 Hz,1H),3.95～4.28 (m,1H),7.21 (d,J=8 Hz,1H),7.48 (d,J=8 Hz,2H),7.83 (d,J=8 Hz,2H),9.97 (s,1H),12.71 (s,1H); HRMS calcd for C₁₅H₁₈N₁O₅ (M-H)⁺292.1185,found 292.1194.

  4.3.9    化合物31的合成

  室温下,将MeOH、化合物30(832 mg,0.926 mmol)加入50 mL瓶中,全溶后加入浓盐酸/二氧六环(V:V=1:2)混合溶液(1.39 mL),室温搅拌3 h后原料转化完全. 向体系中加入10 mL水,冰浴下用5 mL饱和碳酸氢钠溶液调pH 7～8,所得体系用乙酸乙酯萃取,有机相干燥,抽滤,浓缩得到粗品. 粗品过200～300目硅胶柱纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=2:5]得到无色油状物450 mg,产率47%. ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 1.38 (s,9H),1.43 (s,9H),1.50～1.77 (m,4H),2.72 (br s,2H),2.90～3.10 (m,2H),3.23～3.24 (m,2H),3.64 (s,3H),3.87 (s,3H),3.97 (t,J=6 Hz,2H),4.38～4.40 (m,1H),4.98 (d,J=5 Hz,0.5H),4.39 (d,J=5 Hz,0.5H),5.10 (s,3H),6.19 (s,1H),6.55 (dd,J=14,8 Hz,2H),7.14～7.40 (m,10H); HRMS calcd for C₄₂H₅₆N₃O₁₂ (M+H)⁺ 794.3864,found 794.3876.

  4.3.11    化合物33的合成

  室温下,将化合物32 (250 mg,0.274 mmol)和5 mL 2.2 mol•L^-1 HCl二氧六环溶液加入5 mL瓶中,室温搅拌1.5 h后原料转化完全. 将体系减压浓缩至无馏分后,再用5 mL乙腈减压浓缩两次,所得粗品中加入3 mL水,用饱和碳酸氢钠溶液调pH 7～8,所得溶液用乙酸乙酯萃取,有机相干燥,抽滤,浓缩得到158 mg白色固体,产率81%. ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 1.53～1.82 (m,4H),2.53～2.70 (m,1H),3.14 (dd,J=14,4 Hz,1H),3.20～3.38 (m,2H),3.54 (s,2H),3.69 (s,3H),3.88 (s,3H),3.98 (t,J=6 Hz,2H),4.41 (d,J=2 Hz,1H),5.09 (s,2H),5.47 (dd,J=9,2 Hz,1H),6.51～6.58 (m,3H),7.05～7.38 (m,16H); HRMS calcd for C₄₀H₄₆N₃O₉ (M+H)⁺ 712.3234,found 712.3231.

  4.3.13    目标化合物6的合成

  室温下,向10 mL两口瓶中加入化合物34(99 mg,0.122 mmol)、二氯甲烷(2 mL)及Dess-Martin氧化剂(129 mg,0.305 mmol),体系pH 5～6,室温搅拌反应1 h后,原料转化完全. 向体系中加入3 mL饱和硫代硫酸钠溶液,分液,水相再用3 mL二氯甲烷萃取. 有机相合并,先后用饱和碳酸氢钠溶液2 mL及饱和食盐水2 mL洗后浓缩,所得粗品经200～300目硅胶柱纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=1:2]得到白色固体69 mg,产率70%. ¹H NMR (400 MHz ,DMSO) δ: 1.22～1.35 (m,9H),1.69～1.41 (m,4H),2.64～2.98 (m,2H),3.13 (d,J=34 Hz,2H),3.67 (s,2H),3.75 (s,3H),3.90～4.03 (m,2H),4.03～4.17 (m,1H),5.14 (s,2H),5.76 (s,1H),5.95 (d,J=6 Hz,1H),6.73～7.39 (m,17H),8.06～7.75 (m,1H),9.10 (t,J=5 Hz,1H); HRMS calcd for C₄₅H₅₂N₃O₁₁ (M+H)⁺810.3602,found 810.3579.

  4.3.8    化合物30的合成

  氩气保护下,向100 mL三口瓶中加入1 mol•L^-1LiHMDS的THF (8.5 mL,8.46 mmol)溶液,降温至 -75～-80 ℃后,向体系中滴加O-叔丁氧羰基乙酸甲酯(1.34 g,7.06 mmol)的THF (20 mL)溶液,控制滴速约30 min滴完. 保温-75～-80 ℃搅拌30 min后,向体系中滴加化合物29 (1.0 g,1.41 mmol)的THF (20 mL)溶液,控制滴速约30 min滴完. 保温-75～-80 ℃搅拌反应2 h后原料转化完全. 向体系中加入30 mL饱和碳酸氢钠溶液,回至室温后,浓缩除去THF,剩余水相用乙酸乙酯萃取,有机相干燥,抽滤,浓缩得到粗品. 粗品过200～300目硅胶柱纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=1:2]得到无色油状物1.14 g,产率66%. ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 1.17 (s,9H),1.40 (s,9H),1.42 (s,9H),1.69 (s,4H),3.01 (s,2H),3.23 (s,2H),3.74 (s,3H),3.88 (s,3H),3.98 (s,2H),4.92 (s,1H),5.11 (s,3H),5.18 (s,1H),6.51～7.34 (m,12H); HRMS calcd for C₄₆H₆₃Na₁N₃O₁₃S₁ (M+Na)⁺ 920.3979,found 920.3955.

  4.3.4    (S)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-(对甲酰苯基)丙酸甲酯(26)的合成

  氩气保护下,向50 mL三口瓶中加入无水DMF (15.2 mL)、锌粉(5.93 g,0.09 mol)、单质碘(80 mg,催化量),再加入(S)-N-Boc-3-碘丙氨酸甲酯(5.00 g,0.015 mol),搅拌20 min后冷却至室温备用; 氩气保护下,向另一50 mL三口瓶中加入对溴苯甲醛(3.66 g,0.02 mol)、P(o-Tol)₃ (0.46 g,0.09 mol)、醋酸钯(0.17 g,00015 mol),用注射器抽取另一瓶中的上清液加入,将体系至于50 ℃反应2.5 h后停止反应,冷却至室温后加入150 mL水,用乙酸乙酯萃取,有机相干燥、抽滤、浓缩得到的粗品经硅胶柱层析[100～200目,V(石油醚):V(乙酸乙酯)=9:1洗脱]分离得到3.38 g浅棕色固体,产率70%; ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 1.42 (s,9H),3.08～3.26 (m,2H),3.73 (s,3H),4.60～4.67 (m,1H),5.02 (d,J=7 Hz,1H),7.82 (d,J=8 Hz,2H),7.32 (d,J=8 Hz,2H),10.0 (s,1H).

  4.3.6    (S)-2-(苯甲基氧基)-6-(4-(2-[(叔丁氧羰基)氨基])-3- (4-甲酰基苯基)丙酰氨基)丁氧基)苯甲酸甲酯(28)的合成

  室温下,向10 mL单口瓶中加入3.2 mL DMF、化合物27 (141 mg,0.48 mmol)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU) (169 mg,0.53 mmol)及HOBt (6 mg,0.044 mmol),全溶后加入化合物24(160 mg,0.44 mmol),溶解后控温＜10 ℃,滴入三乙胺(133 mg,1.32 mmol),室温搅拌1 h后TLC跟踪显示原料转化完毕. 将体系倒入30 mL水中,乙酸乙酯萃取(10 mL×3),有机相经饱和碳酸氢钠滴溶液及饱和食盐水洗后,加入无水硫酸钠干燥、抽滤,浓缩得到粗品. 粗品过100～200目硅胶柱纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=1:1]得到无色油状物241 mg,产率91%. ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 1.37 (s,9H),1.63～1.70 (m,4H),2.89 (s,1H),2.96 (s,1H),3.04 (s,1H),3.16～3.19 (m,2H),3.20～3.29 (m,2H),3.87 (s,3H),3.97 (t,J=5 Hz,2H),4.12 (q,J=7 Hz,1H),4.34 (s,1H),5.11 (s,3H),6.23 (s,1H),6.55～7.78 (m,12H),9.94 (s,1H); HRMS calcd for C₃₄H₄₀Na₁N₂O₈ (M+Na)⁺ 627.2682,found 627.2684.

  4.3.7    2-(苯甲基氧基)-6-{4-[(S)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]]}-3-｛4-[((S)-叔丁基亚磺酰基)亚氨基]甲基｝苯基)丙酰胺基)丁氧基)苯甲酸甲酯(29)的合成

  室温下,氩气保护下向10 mL单口瓶中加入20 mL甲苯,化合物28(1.0 g,1.65 mmol),Ti(O-iPr)₄(1.78 g,6.3 mmol),室温搅拌30 min后加入(S)-叔丁基亚磺酰胺(0.55 g,4.54 mmol),升温至60 ℃搅拌2 h后原料转化完全. 将体系冷至室温后,向体系加入饱和氯化钠溶液25 mL,搅拌30 min后过硅藻土,滤液分液,水相再用EA萃取,有机相用无水硫酸钠干燥,抽滤浓缩,粗品过硅胶柱层析[100～200目,V(石油醚):V(乙酸乙酯)=1:1洗脱]得到1.25 g产品,产率97%; ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 1.27 (s,9H) 1.39 (s,9H),1.65～1.71 (m,4H),3.04 (s,1H),3.14～3.19 (m,1H),3.29 (d,J=5 Hz,2H),3.90 (s,3H),3.99 (t,J=5 Hz,2H),5.13 (s,3H),6.54 (d,J=8 Hz,1H),6.60 (d,J=8 Hz,1H),7.28～7.40 (m,9H),7.77 (d,J=8 Hz,2H),8.56 (s,1H); HRMS calcd for C₃₅H₅₀N₃O₈S (M+H)⁺ 708.3318,found 708.3327.

  4.3.1    甲基-2-{4-[(叔丁氧羰基)氨基]丁氧基}-6-羟苯酯(22)的合成

  氩气保护下,向50 mL三口瓶中加入重蒸后的THF (12 mL)、化合物7 (208 mg,1.1 mmol)、2,6-二羟基苯甲酸甲酯(168 mg,1.0 mmol)和三苯基膦(393 mg,1.5 mmol),降温至0 ℃后,控温＜5 ℃,滴入偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD) (303 mg,1.5 mmol),然后将反应体系放置室温搅拌17 h后停止,减压浓缩除去溶剂后,经100～200目硅胶柱纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=8:1]得到淡黄色油状物166 mg,产率65%. ¹H NMR (400 MHz,DMSO) δ: 1.46 (s,9H),1.65～1.95 (m,4H),3.23 (s,2H),3.97 (s,3H),4.03 (t,J=5.9 Hz,2H),4.66 (s,1H),6.41 (d,J=8.3 Hz,1H),6.60 (d,J=8.4 Hz,1H),7.33 (t,J=8.3 Hz,1H),11.48 (s,1H); HRMS calcd for C₁₇H₂₄N₁O₆ (M-H)⁺ 338.1604,found 338.1599.

  4.3.3    2-(4-氨基丁氧基)-6-(苯甲基氧基)苯甲酸甲酯盐酸盐(24)的合成

  室温下,向10 mL单口瓶中加入4 mL 2.2 mol•L^-1氯化氢二氧六环溶液及化合物23 (215 mg,0.5 mmol),室温搅拌1 h后,将体系减压浓缩至无馏分后,再用4 mL乙腈减压浓缩两次,真空干燥得到白色固体168 mg,产率92%. ¹H NMR (400 MHz,DMSO) δ: 1.59～1.79 (m,4H),2.83 (t,J=7 Hz,2H),3.79 (s,3H),4.01 (t,J=6 Hz,2H),5.15 (s,2H),6.75 (dd,J=22,8 Hz,2H),7.26～7.44 (m,6H),7.90 (s,3H); HRMS calcd for C₁₉H₂₄N₁O₄ (M+ H)⁺ 330.1705,found 330.1696.

  4.3.2    2-苯甲基氧基-6-｛4-[(叔丁氧羰基)氨基]丁氧基｝苯甲酸甲酯(23)的合成

  室温下,向5 mL单口瓶中加入DMF (2 mL),化合物22 (113 mg,0.3 mmol),碳酸钾(124 mg,0.9 mmol),α-溴甲苯(62 mg,0.36 mmol),室温搅拌1 h后反应完全. 将体系倒入20 mL水中,乙酸乙酯萃取,有机相干燥、浓缩得到粗品. 粗品过100～200目硅胶柱纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=6:1]得到淡黄色油状物166 mg,产率＞99%. ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 1.46 (s,9H),1.59～1.88 (m,2H),3.18～3.21 (m,2H),3.92 (s,3H),4.03 (t,J=6 Hz,2H),4.64 (s,1H),5.14 (s,2H),5.32 (s,1H),6.57～7.39 (m,8H); HRMS calcd for C₂₄H₃₁Na₁N₁O₆ (M+Na)⁺ 452.2049,found 452.2045.

  4.3.10    化合物32的合成

  室温下,将THF (9 mL)、化合物31 (440 mg,0.554 mmol)及N,N-二异丙基乙胺(DIEA) (179.0 mg,1.385 mmol)加入50 mL三口瓶中,冰浴降温至0～5 ℃后,滴入苯乙酰氯(102.8 mg,0.665 mmol),室温搅拌1 h后原料转化完全. 将体系浓缩后加入30 mL 乙酸乙酯溶解,所得到的溶液用5 mL饱和碳酸氢钠溶液和5 mL饱和食盐水洗后浓缩,经200～300目硅胶柱纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=2:3]得到白色固体305 mg,产率60%. ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ: 1.38 (s,9H),1.43 (s,9H),1.52～1.70 (m,4H),2.99 (d,J=5 Hz,2H),3.22～3.23 (m,2H),3.55 (s,2H),3.65 (s,3H),3.87 (s,3H),3.96 (t,J=6 Hz,2H),4.26 (s,1H),5.06～5.10 (m,4H),5.61 (d,J=8 Hz,1H),6.08 (s,1H),6.46～7.33 (m,17H); HRMS calcd for C₅₀H₆₂N₃O₁₃ (M+H)⁺ 912.4298,found 912.4283.

  4.3.12    化合物34的合成

  室温下,向10 mL两口瓶中加入化合物33 (158 mg,0.22 mmol)、二氯甲烷3 mL、三乙胺(45 mg,0.44 mmol)及二叔丁基二碳酸酯(97 mg,0.444 mmol),所得体系室温搅拌反应2 h后原料转化完全. 将体系浓缩后经200～300目硅胶柱纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)=1:4],得到白色固体99 mg,产率55%. ¹H NMR (400 MHz,DMSO) δ: 1.24 (s,1H),1.28 (s,9H),1.42～1.68 (m,4H),2.61～2.93 (m,2H),3.01～3.16 (m,2H),3.35 (s,2H),3.49 (s,3H),3.76 (s,3H),3.97 (t,J=6 Hz,2H),4.33 (dd,J=6,4 Hz,1H),5.14 (s,2H),5.24 (dd,J=9,3 Hz,1H),5.71 (d,J=6 Hz,1H),6.73 (dd,J=19,8 Hz,2H),6.86 (d,J=8 Hz,1H),7.14～7.40 (m,15H),7.88 (t,J=6 Hz,1H),8.48 (d,J=9 Hz,1H); HRMS calcd for C₄₅H₅₄N₃O₁₁ (M+H)⁺ 812.3759,found 812.3784.

  4.5.1    细胞复苏

  液氮细胞库中取出HepG2细胞,迅速置于37 ℃水浴振荡,使细胞在1 min内融化; 超净工作台内将溶化后的细胞转入含3.5 mL高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)的灭菌离心管中,800 r/min离心5 min. 超净工作台内弃去上清液,加入高糖DMEM全培1 mL,轻轻吹吸均匀,将细胞悬液移入培养皿并另加3.5 mL高糖DMEM全培,混匀后置于细胞培养箱内培养.

  4.5.2    细胞冻存

  预先配制冻存液,培养基/胎牛血清/DMSO体积比为5:4:1,提前放于4 ℃冰箱保存预冷. 用细胞消化液对细胞进行消化后,以800 r/min离心5 min. 在无菌超净台内,弃去上清液,加入冻存液,轻轻吹打混匀. 将细胞悬液转入冻存管中,1 mL/管,用封口膜密封管口,标记细胞名称和冻存日期. 将冻存管放入冻存盒中在 -80 ℃冰箱过夜后,放入液氮罐保存.

  4.5.4    胰岛素抵抗模型的建立与检测

  (3) 诱导: 同步化12 h后,模型组中每孔加入含0.1 μmol/L地塞米松的低糖DMEM培养基100 μL; 空白对照组中每个孔加入相等体积不含地塞米松的低糖的DMEM培养基. 细胞培养箱内培养24 h.

  (1) 铺板: 待细胞长满培养皿底部,用胰蛋白酶将HepG2细胞消化,800 r/min离心5 min,弃去上清液,用低糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)悬浮. 测细胞悬液密度后,按照1×10⁴个/孔稀释细胞,并将细胞混匀后转入96孔细胞培养板中继续培养.

  (5) 检测: 24 h后,上清液移至新96孔板中,原96孔板每孔加入100 μL的1×MTT缓冲液,4 h后弃去液体,每个孔加150 μL的DMSO,酶标仪中振荡30 s后测定A492以及A570吸光值. 用葡萄糖检测试剂盒[葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶法(Glucose oxidase-peroxidase,GOD-POD)法]测定细胞上清液中葡萄糖的含量,并计算出各浓度组细胞对葡萄糖的消耗量和葡萄糖相对消耗量.

  (4) 给药: 24 h后,排枪吸去96孔板中的培养液,用pH 7.4的PBS洗涤2次,空白对照组以及阴性对照组(IR)加入无血清、无酚红DMEM 100 μL,加药组分别加入含50 μmol•L^-1盐酸匹格列酮的无血清无酚红低糖DMEM、含50 μmol•L^-1化合物20的无血清无酚红的低糖DMEM. 继续进行培养24 h.

  (2) 换液: 铺板6 h后细胞完全贴壁,用PBS洗涤2～3次,洗净培养基中血清后更换为无血清低糖DMEM培养基同步化12 h.

  其中葡萄糖含量的计算公式为: 葡萄糖的含量(mmol•L^-1)=5.4×[A(实验)/A(标准)]; 葡萄糖消耗量(mmol•L^-1)=培养液中葡萄糖含量-细胞上清液中葡萄糖含量; 细胞活性=实验组(A₅₇₀)/对照组(A₅₇₀); 葡萄糖相对消耗量(mmol•L^-1)=细胞葡萄糖消耗量/细胞活性.

  4.5.3    细胞传代

  细胞长满后,弃去原培养液,PBS洗涤一次,加1 mL胰蛋白酶消化液,轻轻拍打使细胞培养皿底部使细胞从培养皿底部散落后加入3.5 mL高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)终止消化,转入灭菌离心管中,800 r/min离心5 min. 弃上清液,加入1 mL高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)吹匀,移至中皿中并补加9 mL全培,混匀后置于细胞培养箱内培养.

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  图 1  PTP1B表面电势图

  Figure 1  The electrostatic surface of PTP1B

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  图 2  (a) GST融合标签的PTP1B蛋白、(b) HIS融合标签的PTP1B蛋白及(c) PTP1B蛋白晶体图和衍射图其中图(a) 1,2,3道为去掉GST-tag后的PTP1B蛋白,图(b) 1,2,3道为没有切掉His-tag的PTP1B蛋白

  Figure 2  (a) 12% SDS-PAGE analysis of purified PTP1B with GST-tag,(b) 12% SDS-PAGE analysis of purified PTP1B with His-tag and (c) the crystal and diffraction pattern of PTP1B

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  图 3  小分子片段与PTP1B相互作用三维结构图

  Figure 3  Cartoon representation of interactions between small fragments and active sites on the surface of PTP1B

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  图 4  (a) 14种与B位点结合的PTP1B抑制剂和(b)化合物20的设计思路示意图

  Figure 4  (a) 14 kinds of PTP1B inhibitors binding with B site and (b) the design of compound 20

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  图 5  (a)化合物20与PTP1B三维结合模式图和(b)化合物20在PTP1B蛋白表面结合图

  Figure 5  (a) The binding mode of compound 20 wtih PTP1B and (b) surface representation of PTP1B with compound 20. Carbon is in green for 20 and in purple for key active site residues

  其中绿色棍状物为化合物20,紫色棍状物为PTP1B蛋白与化合物20相互作用的关键氨基酸残基

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  图式1  侧链的合成路线

  Scheme 1  The synthetic route of compound 24

  Reagents and conditions: (a) methyl-2,6-dihydroxybenzoate,PPh₃,DIAD,THF,0 ^oC to r.t.,65%; (b) benzyl bromide,K₂CO₃,DMF,r.t.,99%; (c) 2 mol•L^-1 HCl in dioxane,r.t.,92%.

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  图式2  苯丙氨酸类似物片段的合成路线

  Scheme 2  The synthetic route of compound 27

  Reagents and conditions: (a) N-(tert-butoxycarbonyl)-L-iodoalanine methyl ester,I₂,Zn,P(o-Tol)₃,Pd(OAc)₂,DMF,50 ℃,70%; (b) NaOH,MeOH/dioxane/H₂O (V:V:V = 1:1:1),0 ℃,81%.

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  图式3  目标化合物的合成路线

  Scheme 3  The synthetic route of target compound

  Reagents and conditons: (a) 27,TBTU,Et₃N,HOBt,DMF,r.t.,91%; (b) (S)-tert-butanesulfinamide,titanium tetraisopropanolate,toluene,60 ℃,97%; (c) tert-butoxycarbonyloxyacetic acid methyl ester,LiHMDS,N₂,THF,-78 ℃，66%; (d) 4 mol•L^-1 HCl,MeOH,dioxane,H₂O,r.t.,47%; (e) phenylacetyl chloride,DIEA,THF,r.t.,60%; (f) 6 mol•L^-1 HCl,MeOH,r.t.,81%; (g) Boc₂O,Et₃N,CH₂Cl₂,r.t.,55%; (h) Dess-Martin periodinane,CH₂Cl₂,r.t.,70%.

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  图 6  化合物20 (a)及阳性对照药(b)的量效曲线图

  Figure 6  Drug effect graph of 20 (a) and sodium vanadate (b) against PTP1B

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  图 7  化合物20对HepG2细胞及胰岛素抵抗(IR)的HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响柱状图

  Figure 7  Effect of compound 20 on glucose consumption in insulin resistance (IR) of HepG2 and HepG2 cell

  与空白组(control)比较,ΔΔP＜0.01; 与模型组(IR)比较,** P＜0.01,PIOG为匹格列酮正对照组

  ΔΔP＜0.01 vs control group; **P＜0.01 vs model (IR) group,PIOG: Pioglitazone positive control group

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  图 8  化合物20斑马鱼初步急性毒性测试结果

  Figure 8  Preliminary zebrafish acute toxicity test results of compound 20

  (a) 给药浓度为50 μmol/L的斑马鱼形态; (b) 给药浓度为500 μmol•L^-1的斑马鱼形态; (c) 未给药物的斑马鱼状态; (d) 三组斑马鱼心跳数据直方图

  (a) The morphology of zebrafish treated with compound 20 at the concentration of 50 μmol•L^-1,(b) the morphology of zebrafish treated with compound 20 at the concentration of 500 μmol/L,(c) the morphology of control group and (d) heartbeat data comparison chart of three zebrafish groups

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