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• 阿莫西林是一种最常用的广谱β-内酰胺类抗生素，属于半合成青霉素类，其在酸性条件下稳定，故在胃肠道吸收率高达90%，其化学结构式如图 1所示。阿莫西林杀菌作用强且易穿透细胞膜，口服后其分子中内酰胺基团发生水解并生成肽键，可与菌体内的转肽酶发生作用使之失去活性，从而切断了菌体依靠转肽酶合成糖肽用来构筑细胞壁的唯一路径，最终细菌因细胞壁被损坏，水份不断渗透而胀裂死亡。阿莫西林对大多数革兰氏阴性和阳性细菌感染引起的疾病有很好的疗效，用以治疗伤寒、其他沙门菌感染及伤寒带菌者可达到满意疗效^[1-3]。

  图 1

  

  图 1.  阿莫西林的化学结构

  Figure 1.  Chemical structure of amoxicillin

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  虽然阿莫西林是非常有效的广谱抗菌药物，但过度使用对人体(如过敏、毒性和双重感染)和环境都是有害的，而过度使用抗生素，甚至会导致耐药菌的出现和传播^[4-5]。目前已有很多方法检测阿莫西林，例如高效液相色谱法、质谱和电化学技术等方法，但这些技术有很多缺点，包括测定的检出限不理想，仪器昂贵以及检测过程繁琐等等。因此，有必要开发一种快速有效的分析方法来灵敏和选择性地检测微量阿莫西林的存在。

  碳点(CDs)是一种具有球形或准球形的发光碳纳米材料，其拥有易制备、发光稳定、低毒性和水溶性好等众多优点，目前应用于很多领域，包括催化、生物成像、传感及载送药物等等。尤其在传感领域表现尤为出众，目前文献报道可检测一些金属离子、阴离子和一些小分子化合物(例如透明质酸，谷胱甘肽和四环素等等)，检测主要通过荧光猝灭的方法测定^[6-11]。本文使用一种绿色天然物质石斛为原料，一步水热法合成了高荧光量子产率的氮掺杂的CDs(NCDs)，合成的NCDs具有优良的光学性质，最重要的是可以灵敏检测阿莫西林，检出限低至0.15 μmol/L。

  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  石斛(市售，安徽霍山)；AgNO₃、KCl、NaCl、CaCl₂、CoCl₂、CdCl₂、FeCl₂、CuCl₂、NiCl₂、Hg(NO₃)₂、MnCl₂、MgCl₂、ZnCl₂、PbCl₂、AlCl₃、CrCl₃、FeCl₃、NaH₂PO₄和Na₂HPO₄均为分析纯试剂，购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氟苯尼考、阿莫西林、罗红霉素、甲硝唑、氯霉素和红霉素均为分析纯试剂，购自于北京索莱宝科技有限公司。实验用水均为二次蒸馏水。

  TECNAI G2 F20型透射电子显微镜(TEM，美国FEI公司)；EscaLab-250xi型X射线光电子能谱(XPS，美国Thermo公司)；Varian 640型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR，美国Varian公司)；UV-6100型紫外可见分光光度计(UV-Vis，上海美谱达仪器有限公司)；Cary Eclipse型荧光分光光谱仪(PL，美国Varian公司)；pHSJ-3F型实验室pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

  1.2   NCDs的合成

  称取干石斛0.5 g于250 mL烧杯中，加水超声10 min后，倒入聚四氟乙烯的内衬中，放入反应釜中，置于烘箱中200 ℃反应3 h，待冷却后得到深棕色的液体。对上述深棕色液体在10000 r/min转速下离心15 min后，再使用0.22 μm的过滤膜过滤，然后在500~1000 D的透析袋中透析24 h后得到棕色液体，然后冷冻干燥得到黄色固体，即为NCDs粉末。

  1.3   NCDs的表征

  合成的NCDs溶液滴加于超薄碳膜上，然后在空气中自然干燥后进行测试。TEM的测定条件为电压200 kV。统计TEM图上100~200个NCDs，测量其直径，然后分析其粒径分布并作图。

  将NCDs粉末与溴化钾按质量比1: 100充分混合，研磨后进行压片，在红外光谱仪上测试其红外吸收光谱，设置波长范围为4000~500 cm^-1。

  XPS谱图的测定是将合成的NCDs粉末置于样品带上，使用300 W AlKα射线照射测定，对得到的谱图进行拟合。

  配置NCDs溶液(0.5 mg/mL)进行光学性质测定，UV-Vis光谱测定以水为空白对照，测试范围是200~800 nm NCDs溶液的吸收；荧光光谱是以激发波长分别为300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420和430 nm为测定条件，激发和发射狭缝均为5 nm。

  1.4   荧光量子产率的测定

  使用硫酸奎宁为标准物质测定合成的NCDs的荧光量子产率，硫酸奎宁的量子产率为54%。为了减小溶液的再吸收现象，所有对光的吸收度保持在0.1之下(测试波长为360 nm处的吸收值)。合成NCDs的荧光量子产率按照式(1)测定：

  $ Q=Q_{\mathrm{R}} \times \frac{I}{I_{\mathrm{R}}} \times \frac{A_{\mathrm{R}}}{A} \times \frac{n^{2}}{n_{\mathrm{R}}^{2}} $

  (1)

  式中，Q代表物质的荧光量子产率，I是在360 nm激发下待测溶液荧光发射面积的积分，A为溶液的吸收值，n是溶液的折射率(水溶液的折射率为1)，下标R表示标准物质硫酸奎宁。

  1.5   阿莫西林的检测

  使用PBS缓冲溶液分别配置23份NCDs溶液(0.3 mg/mL)，然后加入等浓度不同金属离子和等浓度不同药物(200 μmol/L)后，静置3 min后测定其荧光，测定条件是：荧光激发波长为360 nm，测定发射光谱范围为350~600 nm，激发和发射狭缝均为5 nm。

  使用PBS缓冲溶液配置NCDs溶液(0.3 mg/mL)，然后加入不同浓度(0~300 μmol/L)的阿莫西林后，静置3 min后测定其荧光，测试条件是：荧光激发波长为360 nm，测定发射光谱范围为350~600 nm，激发和发射狭缝均为5 nm。

  2.   结果与讨论

  2.1   NCDs形貌的表征

  图 2是NCDs的透射电子显微镜照片，图 2A上显示其呈现球形或准球形，粒径小于10 nm且均匀分散，从TEM上选取150个NCDs图像进行粒径分析，得出NCDs的粒径分布范围在1~5 nm，平均粒径为2.63 nm。

  图 2

  

  图 2.  NCDs的TEM照片(A)和粒径分布图(B)

  Figure 2.  TEM image(A) and diameter distribution(B) of NCDs

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  2.2   NCDs官能团的表征

  图 3为NCDs的红外光谱图。由图 3可知，NCDs在3450 cm^-1处有强的宽吸收峰，说明其含有羟基(—OH和—NH₂)。在2920与2845 cm^-1处的峰位可归属为C—H的伸缩振动；在1636 cm^-1的吸收峰位可归属为C═O的伸缩振动；在1376 cm^-1处的吸收峰位可归属为C—O—C的特征吸收峰；在1246 cm^-1的吸收峰位可归属为C—N—C的特征峰；在1100 cm^-1处的吸收峰为C—O的弯曲振动。

  图 3

  

  图 3.  NCDs的红外光谱

  Figure 3.  FT-IR spectrum of NCDs

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  图 4是NCDs的XPS图谱，图 4A显示NCDs在285.1、401.2和531.8 eV处有3个强的峰位，分别为C1s、N1s和O1s的XPS特征峰。图 4B是对C1s的XPS峰位进行放大拟合的曲线，在结合能量284.7、285.9和288.1 eV处有拟合峰位，分别归属为C═C、C—OH/C—N和C═O的峰位；图 4C是对N1s的XPS峰位进行放大拟合的曲线，结合能量在398.6、400.1和407.1 eV处有拟合峰位，分别归属为C—N—C，N—(C)₃和N—H的峰位；图 4D是对O1s的XPS峰位进行放大拟合的曲线，结合能量在531.1和532.1 eV处有拟合峰位，分别归属为C═O和C—OH/C—O—C的峰位。XPS的表征结果与FTIR的结果基本一致，合成的NCDs表面上主要含有COOH、OH和NH₂。

  图 4

  

  图 4.  NCDs的XPS图谱总谱(A)；C1s(B)、N1s(C)和O1s(D)的XPS放大图谱

  Figure 4.  XPS spectrum of NCDs(A) and relative high-resolution peaks of C1s(B), N1s(C) and O1s(D)

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  2.3   NCDs的光学性质研究

  图 5A曲线a为NCDs的紫外-可见光吸收图谱，在282 nm处有强的吸收峰，可归属C═O基电子n-π^*的跃迁^[12-13]。图 5A曲线b和c为NCDs的最佳激发谱和在最佳激发波长下的最佳发射谱，图上显示最佳激发波长为350 nm，而最佳发射波长为435 nm。图 5B是合成NCDs溶液在不同激发波长下的发射波谱，图上显示随着激发波长的红移，NCDs的荧光发射波长也在向长波长移动，即合成的NCDs荧光发射具有激发波长依赖性，这可能与NCDs尺寸效应及表面缺陷有关^[14]。

  图 5

  

  图 5.  NCDs的紫外-可见光吸收图谱和最佳激发谱、最佳发射谱(A)；NCDs溶液在不同激发下的荧光发射谱图(B)

  Figure 5.  UV-Vis absorbance, excitation and emission spectra of the NCDs(A), PL excitation-independent emission spectra of the NCDs(B)

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  通过与标准物质硫酸奎宁(Q=54%)的比较，见图 6，得出合成的NCDs的荧光量子产率为29.19%，与一些文献^[15-19]报道的以天然物质合成NCDs的Q相比较，NCDs的Q有明显提高。

  图 6

  

  图 6.  硫酸奎宁与NCDs的荧光量子产率比对图

  Figure 6.  Plots of integrated PL intensity against the absorbance of quinine sulfate and NCDs

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  2.4   NCDs的光学稳定性

  图 7是不同条件下NCDs的光学稳定性测试结果，图 7A是测试NCDs在不同浓度的NaCl溶液中的荧光变化图，发现即使NaCl浓度高达3.0 mol/L时，NCDs溶液的荧光强度下降甚小，表明NCDs在不同的盐浓度下具有良好的光学稳定性。图 7B是NCDs在不同pH溶液中的荧光强度变化图，显示NCDs荧光在酸性条件下会受到较大影响，但在中性和碱性条件下荧光强度基本不受影响。图 7C和7D是NCDs溶液在储存不同时间后测定其荧光变化，即使储存时间达到90 d后测定其荧光也没未发生明显变化。终上所述，NCDs具有良好的光学稳定性，为后期的应用奠定了坚实基础。

  图 7

  

  图 7.  NCDs溶液在不同浓度NaCl溶液存在下的荧光强度图(A)；NCDs溶液在不同pH溶液中的荧光强度图(B)；NCDs溶液在不同储存时间后的荧光强度图(C和D)

  Figure 7.  The relative fluorescence intensity of NCDs in various concentrations of KCl solutions(A), dependence of the relative PL intensity of G-CDs on the pH values from 1.98 to 11.92(B) and photostability of NCDs as a function of the storage time(C and D)

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  2.5   阿莫西林的检测

  2.5.1   选择性

  图 8为在pH=7.4的缓冲溶液中不同物质对NCDs的荧光影响柱状图，首先研究了NCDs对各种金属离子(200 μmol/L的Ag⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺-Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺和Fe³⁺)的选择性，可见这些金属离子对NCDs的荧光强度无明显影响；随后研究了不同药物(300 μmol/L氟苯尼考，阿莫西林，罗红霉素，甲硝唑，氯霉素，红霉素)对NCDs荧光的影响，发现只有阿莫西林能够对NCDs荧光进行猝灭，相同条件下NCDs的荧光强度下降了80 %，说明合成的NCDs可以选择性地识别阿莫西林。

  图 8

  

  图 8.  不同金属离子和小分子药物对NCDs荧光强度的影响柱状图

  Figure 8.  Effect of various metal ions and small molecule drugs on F/F₀ of NCDs solution in PBS buffer solution

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  2.5.2   灵敏度

  图 9A是合成的NCDs与不同浓度的阿莫西林作用后的荧光光谱图，随着阿莫西林浓度逐渐增大，NCDs的荧光在逐渐的下降，说明合成NCDs对阿莫西林浓度是比较敏感的。图 9B所示，根据Stern-Volmer方程：

  图 9

  

  图 9.  NCDs与不同浓度阿莫西林存在下的荧光光谱图(A)；阿莫西林对NCDs荧光猝灭的Stern-Volmer曲线(B)

  Figure 9.  Fluorescence spectra of NCDs solution in the presence of different concentrations of amoxicillin in PBS buffer solution(A), Plot of F₀/F versus different concentrations amoxicillin(B)

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  $ F_{0} / F=+K_{\mathrm{sv}}[\mathrm{Q}], $

  (2)

  式中，F是加入阿莫西林后的NCDs在435 nm处的荧光强度，F₀是未加入阿莫西林时NCDs在435 nm处的荧光强度，以F₀/F为纵坐标，[Q]为横坐标作图，由图 9B可得在阿莫西林浓度0~30 μmol/L时，NCDs的荧光比值F₀/F与阿莫西林浓度呈现良好的线性相关(线性相关系数R=0.9958)，说明NCDs可对阿莫西林实现灵敏检测。根据检出限公式LOD=3σ/K(σ为空白溶液荧光测定10次的标准偏差，K为拟合直线的斜率)，经计算，NCDs对阿莫西林的检测范围为2.6~30 μmol/L，检出限为0.15 μmol/L。

  2.5.3   检测机理

  对阿莫西林的检测机理初步推断是NCDs表面含有大量NH₂和OH基团，而阿莫西林结构中也存在OH、COOH和NH₂，当两者混合后可能通过氢键结合，当阿莫西林靠近NCDs表面时会影响其表面电子的重新排列，从而猝灭了NCDs的荧光。另外分别测试了阿莫西林的紫外吸收与NCDs的最佳荧光激发谱图，如图 10所示，发现阿莫西林在360 nm左右有较强的吸收(图 10曲线a)，而NCDs最佳的激发波长也在350 nm左右(图 10曲线b)，当二者同时存在时，由于发生内滤效应会引起NCDs的荧光猝灭。

  图 10

  

  图 10.  阿莫西林的紫外-可见光吸收曲线(a)与NCDs的最佳荧光激发谱(b)

  Figure 10.  UV-visible absorption spectra(a) and the optimal FL excitation spectra of the NCDs(b)

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  3.   结论

  本文使用天然物质石斛为原料一步水热法合成了高量子荧光产率(Q)的氮掺杂碳点(NCDs，Q=29.19%)，通过表征其粒径在1~5 nm，表面主要存在大量的OH、COOH和NH₂水溶性基团，且具有良好的发光稳定性。合成的NCDs通过荧光猝灭可对小分子药物阿莫西林进行灵敏检测，线性检测范围为2.6~30 μmol/L，检出限为0.15 μmol/L。

  
  
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  图 1  阿莫西林的化学结构

  Figure 1  Chemical structure of amoxicillin

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  图 2  NCDs的TEM照片(A)和粒径分布图(B)

  Figure 2  TEM image(A) and diameter distribution(B) of NCDs

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  图 3  NCDs的红外光谱

  Figure 3  FT-IR spectrum of NCDs

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  图 4  NCDs的XPS图谱总谱(A)；C1s(B)、N1s(C)和O1s(D)的XPS放大图谱

  Figure 4  XPS spectrum of NCDs(A) and relative high-resolution peaks of C1s(B), N1s(C) and O1s(D)

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  图 5  NCDs的紫外-可见光吸收图谱和最佳激发谱、最佳发射谱(A)；NCDs溶液在不同激发下的荧光发射谱图(B)

  Figure 5  UV-Vis absorbance, excitation and emission spectra of the NCDs(A), PL excitation-independent emission spectra of the NCDs(B)

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  图 6  硫酸奎宁与NCDs的荧光量子产率比对图

  Figure 6  Plots of integrated PL intensity against the absorbance of quinine sulfate and NCDs

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  图 7  NCDs溶液在不同浓度NaCl溶液存在下的荧光强度图(A)；NCDs溶液在不同pH溶液中的荧光强度图(B)；NCDs溶液在不同储存时间后的荧光强度图(C和D)

  Figure 7  The relative fluorescence intensity of NCDs in various concentrations of KCl solutions(A), dependence of the relative PL intensity of G-CDs on the pH values from 1.98 to 11.92(B) and photostability of NCDs as a function of the storage time(C and D)

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  图 8  不同金属离子和小分子药物对NCDs荧光强度的影响柱状图

  Figure 8  Effect of various metal ions and small molecule drugs on F/F₀ of NCDs solution in PBS buffer solution

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  图 9  NCDs与不同浓度阿莫西林存在下的荧光光谱图(A)；阿莫西林对NCDs荧光猝灭的Stern-Volmer曲线(B)

  Figure 9  Fluorescence spectra of NCDs solution in the presence of different concentrations of amoxicillin in PBS buffer solution(A), Plot of F₀/F versus different concentrations amoxicillin(B)

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  图 10  阿莫西林的紫外-可见光吸收曲线(a)与NCDs的最佳荧光激发谱(b)

  Figure 10  UV-visible absorption spectra(a) and the optimal FL excitation spectra of the NCDs(b)

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