English

• 扩散系数是描述扩散过程的重要物理参数，其测定值能提供物质本身扩散特性的信息^[1]。在液态体系中测定离子扩散系数的代表性方法有膜池法、激光全息技术、核磁共振(NMR)法、分散法、分子动力学方法、计时电流法等^[2]。对于稳态扩散，膜池法是一种较早研究出的测量扩散系数的经典方法，该方法是测试流过微孔膜的溶液在膜两边溶液浓度的变化，以稳态扩散处理，利用菲克第一定律求得扩散系数^[3]。膜池法的操作较为简单，在普通实验室即可实现，其测量数据比较准确但操作时间较长，影响实验周期。对于非稳态扩散，测量扩散系数的方法有较多的文献提及。例如激光全息干涉法，是将全息摄影技术应用在干涉中，利用不同浓度的溶液折射率不同而得到干涉条纹，在全息干板上记录两个不同时刻的干涉条纹，通过对比不同时间的干涉条纹，结合菲克第一、第二定律得到扩散系数^[4]。NMR测量扩散系数的方法，是利用在扩散过程中溶液浓度的变化对磁感应强度衰减的影响，从而测得其扩散系数^[5]。激光全息干涉法和NMR方法都需要较为昂贵的仪器，而且只适用于特定的物质。在大多数NMR扩散实验中，需要设计复杂的模型系统，才能定量地了解影响物质扩散的因素。Taylor分散法，主要操作是将一种溶质(或浓溶液)注入到呈滞流流动的溶剂(或稀溶液)中去，依据溶质浓度分布计算出相互扩散系数^[6]。Taylor分散法的缺点是需要使用若干米长且呈螺旋状的微毛细管。

  考虑到实验周期和细胞中成分复杂、难以给出准确模型等因素，上述测量方法不适用于原位实时地测量生物体系中离子的扩散系数，因此需要探索新的测量方法。离子选择性微电极是一类利用膜测定溶液中离子活度的电化学传感器(膜电势与待测离子活度之间满足能斯特定律)。其核心是电极尖端的敏感膜，它对离子具有选择性响应，只允许特定离子通过，因此抗干扰能力较强。离子选择性微电极还具有较高的空间分辨率，其尖端直径可以小到约2 μm，因此可对溶液中的离子活度进行定点测量。并且微电极是用微型化针式尖端直接对准样品测定，操作简便，不同于其它化学测定需取样品，所以能实时连续测定和自动监测，具有广阔的应用前景^[7-12]。

  我们课题组在使用离子选择性微电极原位监测芦荟原生质体在低渗液中的破裂过程时，发现了Ca²⁺浓度随时间的变化形成的脉冲信号^[13]。通过对此脉冲信号进行分析，建立了原生质体破裂过程中离子扩散的点源扩散模型，并通过理论推导，得到离子浓度随时间变化的理论公式，并进一步给出了利用此公式对实验曲线进行拟合，得到离子扩散系数的方法。利用此方法对芦荟细胞破裂时Ca²⁺、Na⁺、K⁺的扩散过程进行了研究，得到了这3种离子在细胞培养液中的扩散系数。

  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  XS205DU型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，精度：0.01 mg)；CL-2型磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)；DT5-6型离心机(北京现代北利离心机有限公司)；ZWYR-240型恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司)；微WD-2型电极拉制仪(成都仪器厂)；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)；PTW-4型三维微操纵仪(成都仪器厂)；SWF-1D型高阻微电极放大器(成都仪器厂)；RM6240型多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)；CPX41型倒置显微镜(日本Olympus)；B150-110-10型硼硅酸盐玻璃玻璃管(外径1.5 mm，内径1.10 mm，长度10 cm，美国Scutter Instrument)；样品池(10 mL无菌培养皿，赛默飞世尔科技中国有限公司)。

  甘露醇(纯度≥80.5%，中国惠世生化试剂有限公司)；磷酸二氢钾(纯度≥99.5%，北京化工)；二水合氯化钙(纯度≥98%，西陇化工有限公司)；果胶酶(1.18 U/mg，Sigma Aldrich)；纤维素酶(U/g＞15000，国药集团化学试剂有限公司)；离子选择性液体交换剂(LIX，北京旭月科技有限公司)。

  1.2   芦荟细胞原生质体的制备

  取芦荟鲜嫩叶片，用自来水冲洗叶片表面，70%乙醇消毒，再用去离子水冲洗干净，放滤纸上吸去水分。用已消毒的解剖刀将叶片切分成3~5 cm小段，去除叶片表面薄膜和中间透明胶质后，再切成约5 mm小条。

  使用分析天平称取2.186 g甘露醇、0.040 g磷酸二氢钾、0.222 g二水合氯化钙、0.280 g果胶酶、0.400 g纤维素酶放入烧杯中，放入搅拌子，加入20 mL去离子水，用封口膜封住烧杯后，放入磁力搅拌器搅拌。待溶液搅拌均匀后，用离心机进行离心，转速2000 r/min，时间8 min。取上清液倒入新烧杯，制得酶解液。

  取芦荟叶片小条约2 g置于酶解液中，烧杯用封口膜封好，放入恒温培养振荡器中，温度25 ℃，转速60 r/min，于黑暗条件下进行酶解，时间4 h左右。为促进酶解，每隔1 h摇瓶一次。

  用75 μm筛网过滤酶解液，得到初步纯化的原生质体悬浮液，静止放置沉淀。为排除酶解液中离子对后续测试的影响，须使用浓度为109.3 mg/L的甘露醇溶液作为无钙无钾培养基并清洗原生质体。滴管吸取上层酶解液弃之，再加入无钙无钾培养基20 mL，静置10 min。重复清洗操作3次以上，即得较为纯净的芦荟细胞原生质体。

  取一滴原生质体提取液在载玻片上，加入相同体积的1%臧红溶液进行染色，2 min后显微镜观察，并计算原生质体活力。原生质体活力=活的原生质体/原生质体总数×100%^[13]。染色结果表明，所制备的芦荟原生质体活力为95%。

  1.3   离子选择性微电极的制备与性能检测

  1.3.1   离子选择性微电极的制备

  已清洁好的硼硅酸盐玻璃玻璃管经干燥后放在洁净的容器中备用。微电极拉制仪加热指数设为300，取一只玻璃管置于拉制仪中，经加热电阻圈软化、重锤下拉制成微电极管，其尖端直径约为2 μm。将微电极管置于电热恒温鼓风干燥箱中，180 ℃加热烘干1 h，再对电极尖端进行硅烷化处理。硅烷化试剂是二甲基二氯硅烷的四氯化碳溶液(体积分数5%)。在通风橱中，使用1 mL玻璃注射器吸取少量硅烷化试剂从电极管尾端注入约1 mm长度于电极管中，后以300 ℃恒温加热1.5 h，使硅烷化试剂蒸汽附着在微电极管尖端内表面，形成亲脂疏水层。然后在电极管中分别灌注0.1 mol/L的NaCl、KCl、CaCl₂溶液，并分别在相应的电极管尖端吸入Ca²⁺、Na⁺、K⁺离子选择性液体交换剂(LIX)。最后在电极管中插入Ag/AgCl丝，使Ag/AgCl丝浸没于溶液中且保持与电极尖端有一定距离，固定后作为内参比电极。至此Ca²⁺、Na⁺、K⁺离子选择性微电极制备完成。

  图 1

  

  图 1.  离子选择性微电极

  Figure 1.  Ion selective microelectrode

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  1.3.2   离子选择性微电极工作原理

  将离子选择性微电极、参比电极(甘汞电极)共同与待测溶液接触，当被测离子的浓度在待测溶液和微电极电解液之间存在差异时，LIX两侧便会形成电势差^[13]，待测离子的活度与LIX两侧的电势差满足能斯特(Nernst)方程(1)：

  $ E = {E_0} \pm \frac{{RT}}{{nF}}\ln \;a $

  (1)

  式中，E表示测试电极的电势；E₀为参比电极电势(mV)；R是普适气体常数，数值为9.6487×10⁴ C/mol；T是热力学温度(K)；F是法拉第常数，数值为8.314 J/(K ·mol)；n是待测离子化合价；a为待测离子活度^[14](mol/L)。

  1.3.3   离子选择性微电极性能检测

  每一根离子选择性微电极在使用之前均要对其进行性能检测，分别从响应时间、检测下限、线性范围和稳定性4个方面来判断微电极是否符合实验要求。本文按照IUPAC规定来确定微电极检测下限和响应时间^[15-16]。

  由图 2A可知，Ca²⁺、Na⁺、K⁺选择性微电极在标定液浓度1.0×10^-1~1.0×10^-6 mol/L范围内均有良好的线性，经校正离子活度系数，线性回归系数均能达到0.99以上，分别为0.999、0.997、0.994。图 2B中M表示检测下限，由图 2B可知，Ca²⁺、Na⁺、K⁺选择性微电极检测下限均优于1.0×10^-6 mol/L，分别为1.73×10^-6、1.55×10^-6和1.58×10^-6 mol/L。图 2C是微电极在浓度为1.0×10^-3 mol/L标定液中连续检测3 h的电势值。图 2D是Ca²⁺、Na⁺、K⁺选择性微电极在1.0×10^-1~1.0×10^-5 mol/L浓度标定液中的响应时间，响应时间均小于1 s，响应性能良好。

  图 2

  

  图 2.  钙、钠、钾离子选择性微电极的工作曲线(A)、检测下限(B)、稳定性(C)及响应时间(D)

  Figure 2.  The working curve(A), detection limit(B), stability(C) and response time(D) of calcium, sodium and potassium ion selective microeletrodes

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  1.4   离子扩散脉冲信号检测

  将Ca²⁺、Na⁺或K⁺选择性微电极和甘汞电极分别固定在三维微操纵仪上，并与高阻微电极放大器的前级相连。离子选择性微电极的输出信号经微电极放大器放大后，由多道生理信号采集处理系统采集，由电脑记录并显示。为降低外界环境中可能存在的震动和电磁辐射对测量信号的干扰，实验需在防震台上的金属屏蔽网中进行。

  将样品池放在倒置显微镜的操作台上，将甘汞电极移到距样品池底部约0.5 cm处，缓慢将离子选择性微电极靠近样品池底部并固定操纵杆。将倒置显微镜调至4X物镜，调节三维操纵仪使得选择性微电极尖端在视野中央。再将物镜切换到10X，细调三维微操纵仪使微电极下降至样品池底部。最后用移液枪吸取50 μL的待测原生质体，滴入装有8 mL低渗液(浓度为0.0273 mg/L的甘露醇溶液)的培养管中，轻轻摇晃均匀后缓慢倒入样品池中。保证甘汞电极和选择性微电极同时浸没在溶液中。通过显微镜在视野中找到一个原生质体作为待测目标，并且视野中应没有其它原生质体存在。利用微操作仪移动离子微电极靠近目标原生质体，并使其尖端距离目标原生质体约0.5 mm处固定。关闭屏蔽网，生理信号采集系统开始记录并将信号显示在显示器上。观测到原生质体破裂的脉冲信号后，再等待电势恢复平稳后停止记录，保存并导出数据。

  1.5   离子扩散的点源扩散模型

  考虑到芦荟原生质体的典型尺寸为50 μm左右，与微电极尖端到细胞的距离相比是很小的，同时考虑到细胞位于培养皿底部，故可将原生质体视为可向上半空间释放离子的一个点源。当原生质体破裂时，点源中的离子不断向周围空间扩散^[17]。根据扩散理论，离子在溶液中的扩散满足扩散方程(2)：

  $ \frac{{\partial C}}{{\partial t}} = D\left( {\frac{{{\partial ^2}C}}{{\partial {x^2}}} + \frac{{{\partial ^2}C}}{{\partial {y^2}}} + \frac{{{\partial ^2}C}}{{\partial {z^2}}}} \right)\;\;\;\;t > 0, - \infty < x, y, z < + \infty $

  (2)

  此扩散方程在全空间的解析解^[18]为

  $ C\left( {x,y,z,t} \right) = \frac{Q}{{{{\left( {4\pi Dt} \right)}^{\frac{3}{2}}}}}\exp \left( { - \frac{{{x^2} + {y^2} + {z^2}}}{{4Dt}}} \right) $

  (3)

  式中，D为离子扩散系数(cm²/s)；r=x²+y²+z²为测量点(微电极尖端所在位置)到点源(原生质体)的距离(mm)；t为时间(s)；C(x, y, z, t)为t时刻测量点的离子浓度(mol/L)；Q为点源释放的离子总量。

  由于原生质体位于培养皿底部，离子扩散范围仅限于上半空间，将式(3)修正为

  $ C(x, y, z, t) = \frac{{2Q}}{{{{(4\pi Dt)}^{\frac{3}{2}}}}}\exp \left( { - \frac{{{x^2} + {y^2} + {z^2}}}{{4Dt}}} \right) $

  (4)

  式(4)即为离子脉冲信号的定量表达式，利用此式对实验测得的Ca²⁺、Na⁺、K⁺脉冲信号进行拟合可得对应的离子在溶液中的扩散系数。为此对式(4)两边同时取对数进行改写，以便于拟合：

  $ \ln \;C = \ln 2Q - \frac{3}{2}\ln (4\pi D) - \frac{3}{2}\ln \;t - \frac{{{r^2}}}{{4Dt}} $

  (5)

  实际测量的是离子选择性微电极与参比电极之间的电势差，将能斯特方程带入式(5)，可得

  $ E - {E_0} = - \frac{3}{2}S{\rm{ln}}\left( {t - {t_0}} \right) - \frac{{S{r^2}}}{{4D\left( {t - {t_0}} \right)}} + S{\rm{ln}}2S - \frac{3}{2}S{\rm{ln}}\left( {4\pi D} \right) $

  (6)

  式中，E-E₀为实验测得的电势差(mV)；S=RT/nF为能斯特斜率(mV/dec)；D为扩散系数(cm²/s)。由于原生质体在低渗液中破裂的准确时刻未知，故引入参数t₀来表示(s)。

  2.   结果与讨论

  2.1   原生质体低渗液中破裂时Ca²⁺、Na⁺、K⁺的脉冲信号

  从图 3A可知，Ca²⁺信号在原生质体破裂前电势相对平稳，其值对应背景离子浓度。当原生质体开始破裂时，其周围的Ca²⁺浓度明显上升，直至离子浓度达到一个峰值。之后随着Ca²⁺慢慢向周围扩散，离子浓度慢慢开始下降至趋于平稳，恢复到背景浓度。整个过程结束后形成了一个向上的脉冲信号。由图 3B、3C可见，Na⁺、K⁺浓度脉冲信号与Ca²⁺类似。

  图 3

  

  图 3.  芦荟原生质体低渗处理破裂时形成的Ca²⁺(A)、Na⁺(B)和K⁺(C)脉冲信号

  Figure 3.  Ca²⁺(A), Na⁺(B) and K⁺(C) pulse signals formed by aloe protoplasts during hypotonic treatment

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  2.2   拟合脉冲信号

  在Origin程序中自定义式(6)的函数模型：

  $ y = A{\rm{ln}}\left( {x - B} \right) - \frac{C}{{\ln \left( {x - B} \right)}} + D $

  (7)

  式中，A、B、C、D对应上文中式(6)中各项：$A = - \frac{3}{2}S,B = {t_0},C = \frac{{S{r^2}}}{{4{D_{\rm{i}}}}},D = \mathit{S}{\rm{ln}}2Q - \frac{3}{2}\mathit{S}{\rm{ln}}\left( {4\pi {D_{\rm{i}}}} \right) $。n D_i为扩散系数(cm²/s)。

  将Ca²⁺、Na⁺、K⁺脉冲信号进行拟合，即得原生质体低渗处理时3种离子的扩散系数。图 4-图 6分别为对Ca²⁺、Na⁺、K⁺ 3种离子的脉冲信号进行拟合得到的结果。利用拟合数据计算出3种离子的扩散系数分别为(6.51±0.12)×10^-6、(2.93±0.15)×10^-5和(3.03±0.35)×10^-5 cm²/s。

  图 4

  

  图 4.  Ca²⁺脉冲信号拟合图

  Figure 4.  Ca²⁺ pulse signal fitting diagram

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  图 5

  

  图 5.  Na⁺脉冲信号拟合图

  Figure 5.  Na⁺ pulse signal fitting diagram

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  图 6

  

  图 6.  K⁺脉冲信号拟合图

  Figure 6.  K⁺ pulse signal fitting diagram

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  2.3   不同测量方法的对比分析

  由于缺乏生物体系中原位测量扩散系数的数据，于是同纯水中的离子扩散系数进行对比分析。放射性或荧光示踪法是测量扩散系数的经典方法，是通过在实验样品中加入目标离子的放射性同位素或荧光示踪剂，利用这些外源性物质的迁移来测得目标离子的扩散系数。Brian S. Donahue等利用放射性同位素示踪法即通过标记⁴⁵Ca的迁移来测得室温下Ca²⁺在水溶液中扩散系数的典型值为5.3×10^-6 cm²/s^[19]。但Ian C. Bourg等研究说明液体中金属阳离子的扩散系数具有同位素质量依赖性^[20]，且该方法需要引入外源性物质，若用于生物体系，这涉及侵入性程序，故不适用于生物体系中扩散系数的测量。

  分子模拟方法中的分子动力学(MD)模拟也是计算自扩散系数的常用方法，可用于模拟电解质系统，MD中的控制方程是基于经典牛顿力学建立的，可借助于这些控制方程计算每个时间步长中的粒子位置。在MD中，系统以全原子或粗粒模型进行模拟。对于全原子模型，分子中的每个原子被认为是相互作用位点，而对于粗粒模型，不同的原子被分组在称为“伪原子”的单个相互作用位点中。因此粗粒模型的模拟速度高于全原子模拟速度^[21]。Ali Ghaffari等使用分子动力学(MD)模拟测得室温下Na⁺在水溶液中的扩散系数为2.27×10^-5 cm²/s^[22]，Mohammad Amin Esmaeilbeig等也使用MD模拟测出室温下K⁺在水溶液中的扩散系数为2.371×10^-5 cm²/s^[23]。MD模拟需要设置合适参数并保证参数与力场的产生相一致，结果才有较高的准确度。实际细胞培养液与水中不同，细胞中成分复杂，MD模拟难以给出准确模型，故在生物真实环境中MD模拟受到限制。

  离子选择性微电极属于非损伤性技术，与放射性示踪法不同，不需要引入外源性物质，对样品无污染，适用于生物体系在真实环境中或模拟真实环境(细胞培养液)中的测量。离子选择性微电极用于单细胞检测时，不会像MD模拟中需要建立复杂的模型系统。加之微电极的敏感膜对离子具有选择性响应，只允许特定离子通过，故抗干扰能力较强。而且离子选择性微电极具有响应迅速、高灵敏度、高时间分辨率、高空间分辨率等特点，因此离子选择性微电极原位测定离子扩散系数的方法具有独特的优势，能够突破其他扩散系数测量方法在生物体系中应用的局限性。

  有趣的是，与前面提到的文献[19, 22-23]中给出的室温下水溶液中Ca²⁺、Na⁺、K⁺的扩散系数5.3×10^-6、2.27×10^-5、2.371×10^-5 cm²/s对比，本文得到的Ca²⁺、Na⁺、K⁺扩散系数分别为(6.51±0.12)×10^-6、(2.93±0.15)×10^-5、(3.03±0.35)×10^-5 cm²/s，均略高于文献中的数值。这说明在原生质体破裂时有某种机制加速了离子的扩散。考虑到原生质体在低渗液中会因吸水而膨胀，这导致细胞内的压力升高，细胞膜内外产生压力差。该压力差会加速破裂瞬间离子的扩散，这可能是导致测得的扩散系数偏大的原因。原生质体细胞膜强度越大，其能承受的压力差也越大，对离子扩散的加速作用就越显著，测得的扩散系数也就越大。反之，细胞膜在损伤情况下，对离子扩散的加速效果就会变弱，测得的离子扩散系数会变小。

  因此本文提出的使用离子选择性微电极原位测定离子扩散系数的方法也可应用于评估细胞膜强度或是细胞状态。比如在各类胁迫下，植物细胞的细胞膜可能会受到损伤，胁迫因素不同，以及胁迫的强弱程度不同，致使细胞膜损伤的程度也不同，则测得的离子扩散系数也将会产生相应的变化。

  3.   结论

  基于离子选择性微电极具有响应迅速、操作简单、高灵敏度、高时间分辨率和空间分辨率，对样品无污染，能够在相对真实的生理环境状态下实时、动态监测离子浓度等独特优势，本文提出了一种用离子选择性微电极原位测定离子扩散系数的新方法，并将其应用于室温下芦荟细胞培养液中Ca²⁺、Na⁺、K⁺扩散系数的测定。实验所用的Ca²⁺、Na⁺和K⁺离子选择性微电极检测下限分别为1.73×10^-6、1.55×10^-6和1.58×10^-6 mol/L，响应时间均小于1 s，转换效率均大于90%，48 h内稳定性良好。通过对芦荟细胞原生质体破裂时Ca²⁺、Na⁺、K⁺脉冲信号的分析，得到了Ca²⁺、Na⁺和K⁺的扩散系数分别为6.51×10^-6、2.93×10^-5和2.27×10^-5 cm²/s。对比发现，拟合得到的Ca²⁺、Na⁺、K⁺扩散系数均略高于文献中报道的数值(水中)，这一现象的产生可能是因为原生质体是在低渗液中吸水膨胀，细胞膜内外产生压力差，该压力差会加速细胞破裂瞬间离子的扩散。该方法不仅可以用于原位测定细胞培养液中离子的扩散系数，也可用于在单细胞水平上对细胞膜的强度的变化进行评估，因此在诸如纳米材料的生物效应等领域具有潜在的应用价值。

  
  
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  图 1  离子选择性微电极

  Figure 1  Ion selective microelectrode

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  图 2  钙、钠、钾离子选择性微电极的工作曲线(A)、检测下限(B)、稳定性(C)及响应时间(D)

  Figure 2  The working curve(A), detection limit(B), stability(C) and response time(D) of calcium, sodium and potassium ion selective microeletrodes

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  图 3  芦荟原生质体低渗处理破裂时形成的Ca²⁺(A)、Na⁺(B)和K⁺(C)脉冲信号

  Figure 3  Ca²⁺(A), Na⁺(B) and K⁺(C) pulse signals formed by aloe protoplasts during hypotonic treatment

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  图 4  Ca²⁺脉冲信号拟合图

  Figure 4  Ca²⁺ pulse signal fitting diagram

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  图 5  Na⁺脉冲信号拟合图

  Figure 5  Na⁺ pulse signal fitting diagram

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  图 6  K⁺脉冲信号拟合图

  Figure 6  K⁺ pulse signal fitting diagram

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