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• 生物巯基小分子是生命体内许多蛋白质的重要组成部分，且在生物体的许多生理活动中起着重要作用。细胞内巯基小分子的异常水平通常与人体的许多疾病有关，如白细胞缺失、银屑病、肝损伤、癌症和艾滋病。其中，半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)是人体内常见的巯基小分子。半胱氨酸的缺失会导致生长缓慢、头发褪色、水肿、嗜睡、肝脏损伤、肌肉和脂肪流失和皮肤损伤等疾病。过高浓度的高半胱氨酸则可能导致动脉粥样硬化、心血管疾病和阿尔茨海默病^[1-4]。因此，有必要发展一种简便方法用于高灵敏、高选择性检测Cys和Hcy的含量。

  相对传统检测方法，荧光探针法因具有操作简单、灵敏度高、选择性好及成本低等优点备受青睐。目前，巯基小分子荧光探针设计原理，主要有迈克尔加成反应，磺酰胺、磺酸酯、硫—硫键、硒—硒键及硒—氮键的亲核进攻断裂反应，加成环化反应和芳香取代重排反应等^[5-6]。这些探针多采用有机化合物^[7-8]，具有水溶性差或毒性高等缺点。最近，钌配合物由于其水溶性、低毒性、化学稳定性好，具有大的Stoke位移及良好的发光性能等优点受到人们重视，被用作小分子荧光探针^[9]。本文设计、合成了一种含醛基钌配合物用于半胱氨酸和高半胱氨酸的检测，并探讨了其识别机理。

  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  Varian Mercury plus 400M型核磁共振谱仪(NMR，美国瓦里安仪器公司); UV-2600型紫外分光光度计(UV-Vis，日本岛津公司)；Fluoromax-4型荧光光谱仪(法国HORIBA公司)；MALDI-TOF-MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MS，日本岛津公司)；PerkinElmer 2400型元素分析仪(XPS，美国PE公司)。

  5-醛基-1, 10-邻菲咯啉(5-CHO-phen)按文献[10]方法合成。氨基酸(Cys, Hcy, Arg, Phe, Pro, Tyr, Val, Ala, Gly, Lys, Leu, Glu, Ser)、水合三氯化钌、氯化钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、SP-葡聚糖凝胶C-25和Amberlite IRA-402强碱性阴离子交换树脂(氯型)购自阿拉丁试剂有限公司，试剂均为分析纯；牛血清蛋白(BSA)、谷胱甘肽(GSH)和小牛胸腺DNA(CT-DNA)购自上海生物工程有限公司，生物级。

  1.2   配合物合成及表征

  配合物的合成路线见Scheme 1所示。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis of the Ru(Ⅱ) complex [Ru(5-CHO-phen)₃]²⁺

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  配合物[Ru(5-CHO-phen)₃]](PF₆)₂的合成  将5-醛基-1, 10-邻菲咯啉(0.0832 g, 0.4 mmol)、水合三氯化钌(0.0207 g, 0.1 mmol)溶于20 mL EtOH/H₂O (体积比3: 1)混合溶剂中，Ar气保护下回流6h，得红色澄清溶液。冷却至室温，加入40mL水稀释，过滤。滤液过SP-葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱(20 cm×3)。用1.0 mol/L NaCl溶液-丙酮(体积比10: 1)洗脱，洗脱液加入固体KPF₆，生成红色沉淀，CH₂Cl₂(30 mL×2)萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥过夜。过滤，滤液旋干，真空干燥，得红色固体。产率61.3%。¹H NMR(400 MHz, CD₃CN-d₆), δ：10.53(s, 3H;CHO), 9.38(d, J=8.4 Hz, 3H;phen4), 8.92(s, 3H;phen6), 8.79(d, J=4.0 Hz, 3H;phen7), 7.93(dd, J₁=J₂=5.2 Hz, 3H;phen2), 7.65(dd, J₁=J₂=5.2 Hz, 3H;phen9), 7.65(t, J₁=J₂=8.4 Hz, 6H;phen3, 8)；MODI-TOF-MS(CH₃CN):m/z=726.251([M(2PF₆-H]⁺), 872.384([M(PF₆]⁺；分子式：C₃₉H₂₄N₆O₃F₁₂P₂Ru；计算值/%：C 46.12, H 2.38, N 8.27;实测值/%:C 45.98, H 2.48, N 8.53。

  2.   结果与讨论

  2.1   配合物对Cys/Hcy的荧光响应

  为了评估钌(Ⅱ)配合物荧光探针对Cys/Hcy的定量荧光检测能力，研究了钌配合物在HEPES缓冲溶液(50 mmol/L, pH=7.0)中与不同浓度Cys/Hcy的荧光响应。HEPES能有效控制pH值范围，具有较好的缓冲能力，因此选择HEPES作为本实验的缓冲溶液。结果如图 1所示，450 nm激发下，由于醛基吸电子基的存在，钌(Ⅱ)配合物表现了极弱的荧光。随着不同浓度的Cys(图 1A)和Hcy(图 1B)的加入，配合物的荧光逐渐增加。当Cys和Hcy的浓度达到70 μmol/L，荧光增强幅度分别为13.6倍和12.8倍。当Cys和Hcy的浓度在0~35 μmol/L时，配合物归一化荧光强度与浓度存在良好的线性关系。对于Cys，拟合线性方程为y=0.02827+0.0081x(R²=0.9863)，而对于Hcy，拟合线性方程为y=0.03854+0.0076x(R²=0.9944)。根据IUPAC推荐的方法^[11]，LOD=3σ/S，得到Cys和Hcy的检测限分别为0.60和0.78 μmol/L。实验结果表明，该配合物可作为半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光探针。

  图 1

  

  图 1.  钌配合物(10 μmol/L)在HEPES缓冲溶液中与不同浓度Cys(A)/Hcy(B)(0~70 μmol/L)的荧光滴定光谱图。插图为归一化的荧光强度对Cys/Hcy浓度的线性拟合图

  Figure 1.  Emission spectra(λ_ex=450 nm, λ_em=597 nm) of Ru complex(10 μmol/L) in the presence of different concentraions of Cys(A) and Hcy(B)(0~70 μmol/L, 5 μmol/L as intervals) at room temperature in HEPES buffer. The inset is the linear fitting of normalized luminescence intensity vs Cys/Hcy concentration

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  2.2   配合物对Cys/Hcy的选择性荧光响应

  选择性是评估荧光探针的重要指标之一。为了明确配合物对Cys和Hcy的荧光识别选择性，不同氨基酸(Cys, Hcy, Arg, Phe, Pro, Tyr, Val, Ala, Gly, Lys, Leu, Glu, Ser)，谷胱甘肽(GSH)和牛血清蛋白(BSA)被用来研究配合物对Cys和Hcy的选择性。结果如图 2所示。如前所述，70 μmol/L的Cys和Hcy加入导致配合物的荧光显著增加。而其它氨基酸(70 μmol/L)的加入没有引起明显的荧光增长。GSH、BSA和CT-DNA的加入则仅导致荧光微小的增加。这一结果说明配合物仅与Cys和Hcy发生反应，适合用于Cys和Hcy的检测。

  图 2

  

  图 2.  钌配合物在不同氨基酸、GSH、BSA和CT-DNA存在下的荧光响应

  Figure 2.  The luminescence responses of complex in HEPES buffer in the presence of varios amino acids, GSH, BSA and CT-DNA

  c(Ru complex)=10 μmol/L; c(Cys)=70 μmol/L; c(Hcy)=70 μmol/L; c(other analytes)=70 μmol/L

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  2.3   共存物质的干扰

  为了研究其它物质是否干扰Cys和Hcy的检测，在Cys和Hcy浓度为70 μmol/L时，考察了样品中其它氨基酸、GSH、BSA及CT-DNA(250 μmol/L)对Cys和Hcy的干扰情况，结果如图 3所示。除了BSA和CT-DNA，其它物质对Ru-Cys和Ru-Hcy体系的荧光没有明显的影响，几乎不存在干扰。而BSA和CT-DNA则仅引起荧光强度的轻微增加，这是因为配合物与BSA和CT-DNA之间存在相互作用。总的来说，上述干扰均非常微小，说明配合物探针对Cys和Hcy的检测具有良好的抗干扰能力。

  图 3

  

  图 3.  钌配合物在Cys(灰色)/Hcy(黑色)存在下对不同氨基酸、GSH、BSA和CT-DNA的荧光响应

  Figure 3.  Luminescence responses of complex to various analytes in the presence of Cys(grey)/Hcy(black)

  c(Cys)=70 μmol/L; c(Hcy)=70 μmol/L; c(various analytes)=250 μmol/L

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  2.4   配合物的紫外滴定

  紫外滴定被用来确定配合物与Cys和Hcy之间发生相互作用。该钌(Ⅱ)配合物在265和450 nm波长处有明显吸收峰，随着Cys和Hcy的加入，两吸收峰强度降低，产生明显的减色效应。这一结果说明，钌(Ⅱ)配合物与Cys和Hcy之间有明显的相互作用。

  图 4

  

  图 4.  在HEPES缓冲溶液中钌配合物随Cys(A)和Hcy(B)加入的吸收光谱

  Figure 4.  Absorption spectra of complex in HEPES buffer upon the addition of Cys(A) and Hcy(B)

  c(Ru)=10 μmol/L; c(Cys)=0~500 μmol/L; c(Hcy)=0~500 μmol/L

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  2.5   识别机理的确定

  MODI-TOF-MS被用来确定配合物检测Cys和Hcy的识别机理。配合物与Cys和Hcy在DMSO:H₂O(体积比1: 1)混合溶剂中反应1 h，测定其质谱信号。对于Cys，质谱信号(m/z=932.64和1034.719)应归属于[Ru(Cys-phen)₂)(5-CHO-phen)-H]⁺和[Ru(Cys-phen)₃)H]⁺；而对于Hcy，质谱信号(m/z=960.649)应归属于[Ru(Hcy-phen)₂(5-CHO-phen)-H]⁺。上述结果说明，配合物的醛基与Cys和Hcy发生了缩合反应(见Scheme 2)，配合物上的吸电子醛基转化为给电子的噻唑环和噻嗪环，导致配合物荧光也由弱变强，实现了对Cys和Hcy的选择性检测。

  Scheme 2

  

  Scheme 2.  Proposed recognition mechanism of synthesized complex toward Cys and Hcy

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  2.6   实际样品测定

  为了考察该探针测定半胱氨酸的可行性，测定了HEPES缓冲溶液和新生小牛血清中Cys的含量，并进行了加标回收实验。样品测定结果如表 1所示。Cys的加标回收率在97.0%~98.6%范围内，相对标准偏差在3.32%~4.27%范围内。实验结果表明，采用该方法测定半胱氨酸精密度及回收率结果良好。

  表 1

  

  表 1  在HEPES缓冲溶液和新生小牛血清溶液溶液中半胱氨酸浓度的测定

  Table 1.  Determination of the Cys Concentration in HEPES buffer and the newborn calf serum solution

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  Samples	Cys spiked/(μmol·L-1)	Cys recovered/(μmol·L-1)	Recovery/%	RSD/%
  HEPES buffer	0	not detected
  HEPES buffer	20	19.7	98.5	3.56
  HEPES buffer	35	34.5	98.6	4.21
  Serum	0	not detected
  Serum	20	19.4	97.0	3.32
  Serum	35	34.3	98.0	4.27

  3.   结论

  本文设计合成了一种含醛基的钌(Ⅱ)配合物用于半胱氨酸和高半胱氨酸的检测。该探针对半胱氨酸和高半胱氨酸有较好的选择性。其它氨基酸、GSH、BSA及CT-DNA的共存也不影响对半胱氨酸和高半胱氨酸的检测。在HEPES缓冲溶液中，此探针对半胱氨酸和高半胱氨酸显示出较好的的选择性。其检测限(LOD)分别为0.60和0.78 μmol/L。综上所述，此探针具有较好的选择性、灵敏性和抗干扰能力，因而具有较强的实用性。本研究结果为金属钌配合物作为生物小分子荧光探针提供了有意义的实验依据，且具有潜在的应用价值。

  
  
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  Scheme 1  Synthesis of the Ru(Ⅱ) complex [Ru(5-CHO-phen)₃]²⁺

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  图 1  钌配合物(10 μmol/L)在HEPES缓冲溶液中与不同浓度Cys(A)/Hcy(B)(0~70 μmol/L)的荧光滴定光谱图。插图为归一化的荧光强度对Cys/Hcy浓度的线性拟合图

  Figure 1  Emission spectra(λ_ex=450 nm, λ_em=597 nm) of Ru complex(10 μmol/L) in the presence of different concentraions of Cys(A) and Hcy(B)(0~70 μmol/L, 5 μmol/L as intervals) at room temperature in HEPES buffer. The inset is the linear fitting of normalized luminescence intensity vs Cys/Hcy concentration

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  图 2  钌配合物在不同氨基酸、GSH、BSA和CT-DNA存在下的荧光响应

  Figure 2  The luminescence responses of complex in HEPES buffer in the presence of varios amino acids, GSH, BSA and CT-DNA

  c(Ru complex)=10 μmol/L; c(Cys)=70 μmol/L; c(Hcy)=70 μmol/L; c(other analytes)=70 μmol/L

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  图 3  钌配合物在Cys(灰色)/Hcy(黑色)存在下对不同氨基酸、GSH、BSA和CT-DNA的荧光响应

  Figure 3  Luminescence responses of complex to various analytes in the presence of Cys(grey)/Hcy(black)

  c(Cys)=70 μmol/L; c(Hcy)=70 μmol/L; c(various analytes)=250 μmol/L

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  图 4  在HEPES缓冲溶液中钌配合物随Cys(A)和Hcy(B)加入的吸收光谱

  Figure 4  Absorption spectra of complex in HEPES buffer upon the addition of Cys(A) and Hcy(B)

  c(Ru)=10 μmol/L; c(Cys)=0~500 μmol/L; c(Hcy)=0~500 μmol/L

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  Scheme 2  Proposed recognition mechanism of synthesized complex toward Cys and Hcy

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  表 1  在HEPES缓冲溶液和新生小牛血清溶液溶液中半胱氨酸浓度的测定

  Table 1.  Determination of the Cys Concentration in HEPES buffer and the newborn calf serum solution

  Samples	Cys spiked/(μmol·L-1)	Cys recovered/(μmol·L-1)	Recovery/%	RSD/%
  HEPES buffer	0	not detected
  HEPES buffer	20	19.7	98.5	3.56
  HEPES buffer	35	34.5	98.6	4.21
  Serum	0	not detected
  Serum	20	19.4	97.0	3.32
  Serum	35	34.3	98.0	4.27

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