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• 常用的美白化妆品主要是以抑制酪氨酸酶的活性进而抑制黑色素的生成以达到美白的功效，而其中绝大多数美白产品是酚类化合物，如熊果苷等。酪氨酸酶是一种广泛分布于生物界的铜酶，在黑色素生成中起着重要作用^[1]。虽然可以通过多种机制降低皮肤色素沉着，但酪氨酸酶是黑色素生成的限速酶，是抑制剂的重要靶点。目前，有许多美白产品通过抑制酪氨酸酶的表达来减少黑色素生成^[2-4]。市场对安全有效的美白产品的需求非常迫切^[5]，特别是酚类化合物结构修饰一直是化妆品行业研究的热门课题。

  酚类化合物是拥有一个或多个酚羟基的芳香环，一般分为酚酸类、黄酮类、香豆素类和单宁类^[6]，具有美白^[7]、抗氧化^[8]、抗癌、抗炎和抗过敏^[9-10]等活性，代表物质有：熊果苷、茶多酚^[11]和槲皮素^[12]等。此类化合物酚羟基的数量、位置及所连侧链的不同，均会使其生物活性发生改变。酚及酚类化合物不仅在植物生理活动中起着重要作用，对人体健康也有重要作用，广泛用于减少过量活性氧的产生及自由基的清除，有很高的开发应用价值^[13-14]。一些含氮化合物具有特殊的生物活性，在药物合成中备受青睐，如哌嗪环本身属于碱性基团，是很多药物的活性片段，易形成氢键，将其和药效团偶联，能有效地改善水溶性和生物利用度。吗啉作为哌嗪的生物电子等排体同样存在于很多药物的结构中，其与亲脂性化合物的结合可增加后者的水溶性，从而提高生物利用度^[15]。

  本论文以4-羟基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛和3, 4-二羟基苯甲醛与吗啉和N-甲基哌嗪进行偶联，及4-羟基苯乙醇和3-(4-羟基苯基)-l-丙醇与氨基酸偶联，合成了多种酚类衍生物，并对所合成的酚类含氮衍生物进行了抑制酪氨酸酶活性的测试和抗氧化活性的测试，以期得到具有更好酪氨酸酶抑制活性和抗氧化活性的化合物。具体的合成路线如Scheme 1所示。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis of a series of phenolic derivatives

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  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  WGH-30型双光束红外分光光度计(天津市港东科技发展有限公司)；VARIAN MRTCURY PLUS 400型核磁共振仪(NMR，美国Varian公司)；BRUKER-500 MHz型核磁共振仪(NMR，瑞士Bruker公司)；SHMADZU LCMS-2010EV型质谱仪(MS，日本岛津公司)；X-5型显微熔点测定仪(控温型，北京泰克仪器有限公司)，温度未经校正；Multiskan Ascent型酶标仪(美国Therno Fisher Scientific公司)。

  对羟基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、3, 4-二羟基苯甲醛、4-羟基苯乙醇、3-(4-羟基苯基)-l-丙醇、吗啉、N-甲基哌嗪、甲烷磺酰氯、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、乙酸酐(Ac₂O)、Boc-丙氨酸-OH、Boc-脯氨酸-OH和硼氢化钠购自国药集团化学试剂有限公司)；三乙胺(TEA)、四氢呋喃(THF)和无水硫酸镁购自天津市福晨化学试剂厂；二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚和氢氧化钠购自天津市永大化学试剂有限公司。以上试剂纯度均为分析纯。

  1.2   实验方法

  将对羟基苯甲醛(2.0 g, 16.38 mmol)和DMAP(50.0 mg, 0.41 mmol)溶于THF(10.0 mL)中, 室温下搅拌30 min后再向混合物中加入乙酸酐(5.6 mL, 49.13 mmol)，搅拌2 h后减压蒸馏除去THF，加入水(100.0 mL)，用乙酸乙酯(20.0 mL×3)萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在减压蒸馏下得粗产物，选择乙酸乙酯/石油醚(体积比，1:5)作为洗脱剂进行柱层析得白色固体HB-1：乙酸4-甲酰苯基酯，产率96.7%；mp 164.1~165.2 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 500 MHz), δ:9.99(s, 1H, —CHO), 7.28(d, J=8.5 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 7.21(d, J=8.5 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 2.34(s, 3H, —COCH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 125 MHz), δ:190.99, 171.09, 168.82, 134.01, 131.88, 121.78, 21.17;IR(KBr), σ/cm^-1:3076, 1769, 1591, 1184, 853;ESI-MS计算值C₉H₈O₃[M+Na]⁺187.05, 实测值186.86。

  将HB-1(1.0 g, 6.09 mmol)和NaBH₄(276.4 mg, 7.31 mmol)用THF(10.0 mL)溶解，常温反应3 h，反应后向烧瓶中加入1 mol/L HCl直到无气泡产生为止(pH值近中性)，反应完毕减压蒸馏除去溶剂，加入水(50.0 mL)，用乙酸乙酯(20.0 mL×3)进行萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在减压蒸馏下得粗产物，选择乙酸乙酯/石油醚(体积比，1:3)作为洗脱剂进行柱层析得无色液体HB-2：乙酸4-羟甲基苯基酯，产率89.1%;¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz), δ:7.36(d, J=8.2 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 7.06(d, J=8.2 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 4.65(d, J=4.7 Hz, 2H, Ph—CH₂—), 2.29(s, 3H, —COCH₃); ¹³C NMR(100 MHz, CDCl₃), δ:169.35, 149.59, 138.22, 127.68, 121.25, 64.20, 20.77;IR(KBr), σ/cm^-1:3358, 3057, 2928, 1749, 1514, 1194, 854;ESI-MS计算值C₁₀H₁₀O₃[M+Na]⁺ 189.06, 实测值188.87。

  将HB-2(100.0 mg, 0.41 mmol)溶解在CH₂Cl₂(10.0 mL)和TEA(0.6 mL, 4.10 mmol)中，冰水浴下向此混合液中缓慢滴加甲磺酰氯(2.0 mL, 1.48 mmol)，滴加完毕后，常温反应3 h，反应完毕减压蒸馏除去溶剂，由于中间体的不稳定性紧接着将中间体在冰浴下缓慢滴加吗啉(0.4 mL, 4.10 mmol)和三乙胺(0.6 mL, 4.10 mmol)，充分搅拌，加热至75 ℃，回流7 h。反应结束后冷却至室温，加入水(200.0 mL)，用乙酸乙酯(20.0 mL×3)进行萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在减压蒸馏下得粗产物，选择乙酸乙酯/石油醚(体积比，1:1)作为洗脱剂进行柱层析得白色固体HB-3a：4-(吗啉-4-基甲基)-苯酚，产率72.9%;mp 113.8~114.7 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.14(d, J=6.6 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 6.68(d, J=6.6 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 3.72(s, 4H, morpholine-H₂×2 & morpholine-H₆×2), 3.44(s, 2H, Ph—CH₂—), 2.48(s, 4H, morpholine-H₃×2 & morpholine-H₅×2);¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:155.58, 131.13, 131.06, 115.56, 66.97, 63.09, 53.60;IR(KBr), σ/cm^-1:3435, 2963, 1610, 1512, 1254, 886;ESI-MS计算值C₁₁H₁₅NO₂[M+H]⁺ 194.11, 实测值194.04。

  4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯酚(HB-3b)   白色固体，产率57.2%;mp 90.3~90.7 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 500 MHz), δ:7.06(d, J=8.2 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 6.62(d, J=8.2 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 3.49(s, 2H, Ph—CH₂—), 2.56(s, 8H, piperazine-H×8), 2.32 (s, 3H, —CH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 125 MHz), δ:155.07, 129.99, 126.28, 114.54, 61.65, 53.60, 50.93, 44.61;IR(KBr), σ/cm^-1:3466, 2953, 2804, 1603, 1510, 1452, 1265, 852;ESI-MS计算值C₁₂H₁₈N₂O [M+H]⁺ 207.14, 实测值207.08。

  乙酸4-甲酰-2-甲氧基苯基酯(HMB-1)   白色固体，产率93.8%;mp 78.5~79.4 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:9.94(s, 1H, —CHO), 7.50~7.21(m, 3H, Ph—H), 3.90(s, 3H, —OCH₃), 2.34(s, 3H, —COCH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:190.00, 167.30, 150.98, 143.96, 134.23, 123.69, 122.41, 109.87, 55.08, 17.60;IR(KBr), σ/cm^-1:3458, 1755, 1205, 900, 825;ESI-MS计算值C₁₀H₁₀O₄[M+Na]⁺ 217.06, 实测值216.97。

  乙酸4-羟甲基-2-甲氧基苯基酯(HMB-2)   无色液体，产率83.3%;¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:7.02~6.90(m, 3H, Ph—H), 4.67(d, J=5.7 Hz, 2H, Ph—CH₂—), 3.84(s, 3H, —OCH₃), 2.31(s, 3H, —COCH₃), 1.80(t, J=5.6 Hz, 1H, —OH); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:168.99, 151.07, 139.77, 138.99, 122.61, 118.84, 110.92, 64.95, 55.97, 20.53;IR(KBr), σ/cm^-1:3460, 2939, 2870, 1761, 1610, 1514, 907, 822;ESI-MS计算值C₁₀H₁₂O₄[M+Na]⁺ 219.07, 实测值218.95。

  2-甲氧基-4-(吗啉-4-基甲基)苯酚(HMB-3a)   无色液体，产率70.0%;¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:6.87~6.79(m, 3H, Ph—H), 3.88(s, 3H, —OCH₃), 3.71(t, J=4.6 Hz, 4H, morpholine-H₂×2 & morpholine-H₆×2), 3.41(s, 2H, Ph—CH₂—), 2.43(d, J=4.1 Hz, 4H, morpholine-H₃×2 & morpholine-H₅×2);¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:146.54, 144.84, 129.53, 122.18, 113.97, 111.64, 66.98, 63.35, 55.92, 53.56;IR(KBr), σ/cm^-1:3408, 2943, 2839, 1620, 1524, 1119, 866, 806;ESI-MS计算值C₁₂H₁₇NO₃[M+H]⁺ 224.12, 实测值224.06。

  2-甲氧基-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)苯酚(HMB-3b)   白色固体，产率65.6%；mp 131.2~132.1 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:6.86~6.76(m, 3H, Ph—H), 3.87(s, 3H, —OCH₃), 3.44(s, 2H, Ph—CH₂—), 2.48(s, 8H, piperazine-H×8), 2.30(s, 3H, —CH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:146.58, 144.86, 129.76, 122.16, 114.05, 111.73, 62.85, 55.93, 55.02, 52.85, 45.93;IR(KBr), σ/cm^-1:3437, 2945, 1607, 1510, 1452, 862, 797;ESI-MS计算值C₁₃H₂₀N₂O₂[M+H]⁺ 237.15, 实测值237.10。

  乙酸2-乙酰氧基-4-甲酰苯基酯(DHB-1)   无色液体，产率97.0%;¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:9.97(s, 1H, —CHO), 7.81~7.39(m, 3H, Ph—H), 2.33(s, 6H, —COCH₃×2);¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:189.63, 167.50, 167.15, 146.59, 142.40, 134.36, 127.83, 123.97, 123.85, 20.27, 20.17;IR(KBr), σ/cm^-1:2951, 2843, 1780, 1704, 1502, 897, 777;ESI-MS计算值C₁₁H₁₀O₅[M+H]⁺ 223.05, 实测值224.06。

  乙酸2-乙酰氧基-4-羟甲基苯基酯(DHB-2)   无色液体，产率86.1%;¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:7.20~7.13(m, 3H, Ph—H), 4.62(s, 2H, Ph—CH₂—), 2.28(s, 6H, —COCH₃×2);¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:168.12, 141.60, 140.75, 139.71, 124.44, 122.96, 121.35, 63.64, 20.25;IR(KBr), σ/cm^-1:3522, 2943, 1763, 1508, 903, 837;ESI-MS计算值C₁₁H₁₂O₅[M+Na]⁺ 247.07, 实测值246.99。

  4-(吗啉-4-基甲基)邻苯二酚(DHB-3a)   白色固体，产率60.2%;mp 141.0~142.1 ℃; ¹H NMR(DMSO-d₆, 400 MHz), δ:8.75(d, J=25.0Hz, 2H, Ph—OH×2), 6.67~6.48(m, 3H, Ph—H), 3.53(t, J=4.2 Hz, 4H, morpholine-H₂×2 & morpholine-H₆×2), 3.24(s, 2H, Ph—CH₂—), 2.28(s, 4H, morpholine-H₃×2 & morpholine-H₅×2);¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz), δ:144.75, 144.07, 119.73, 116.15, 114.92, 109.94, 65.97, 62.09, 52.88;IR (KBr), σ/cm^-1:3303, 2940, 2866, 1508, 1275, 878, 798;ESI-MS计算值C₁₁H₁₅NO₃[M+H]⁺ 210.11, 计算值210.04。

  4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)邻苯二酚(DHB-3b)   白色固体，产率55.1%;mp 86.5~86.3 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:6.64~6.57(m, 3H, Ph—H), 6.20(s, 2H, Ph—OH×2), 3.39(s, 2H, Ph—CH₂—), 2.50(s, 8H, piperazine-H×8), 2.27(s, 3H, —CH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:144.96, 144.72, 128.23, 121.85, 117.08, 115.27, 62.68, 54.57, 52.16, 45.76;IR(KBr), σ/cm^-1:3433, 2954, 2806, 1522, 1458, 1281, 878, 803;ESI-MS计算值C₁₂H₁₈N₂O₂[M+H]⁺ 223.14, 实测值223.08。

  将HPE-1(500.0 mg, 2.19 mmol)、Boc-Pro-OH(568.5 mg, 2.63 mmol)和DMAP(535.1 mg, 4.38 mmol)用CH₂Cl₂(5.0 mL)溶解，冷却到0 ℃，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(839.6 mg, 4.38 mmol)溶于CH₂Cl₂(5.0 mL)中逐滴加入，滴加完毕在0 ℃下搅拌5 min，然后在室温下搅拌3 h，反应完毕减压蒸馏除去溶剂，加入水(200.0 mL)，用乙酸乙酯(20.0 mL×3)进行萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在减压蒸馏下得粗产物，选择乙酸乙酯/石油醚(体积比1:5)作为洗脱剂进行柱层析，得到白色固体HPE-2a：N-叔丁氧基羰基脯氨酸2-(4-苄氧基苯基)乙酯，产率80.0%;mp 53.7~54.9 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:7.46~7.32(m, 5H, Ph—CH₂—O—), 7.15(d, J=8.5 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 6.94(d, J=8.5 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 5.07(s, 2H, Ph—CH₂—O), 4.39~4.20(m, 3H, Ph—CH₂—CH₂—O—& pyrrolidine-H_α×1), 3.56~3.39(m, 2H, pyrrolidine-H_α×2), 2.91(t, J=7.1 Hz, 2H, Ph—CH₂—), 2.20~1.80(m, 4H, pyrrolidine-H_β×4), 1.45(d, J=30.0 Hz, 9H, —C(CH₃)₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:169.44, 169.22, 160.85, 143.19, 130.12, 128.69, 128.04, 127.81, 125.68, 115.03, 79.58, 79.25, 78.92, 69.63, 59.14, 34.06, 28.53, 28.34;IR(KBr), σ/cm^-1:3450, 2970, 1703, 1387, 1207, 831, 744;ESI-MS计算值C₂₅H₃₁NO₅[M+Na]⁺ 448.22, 实测值448.20。

  N-叔丁氧基羰基丙氨酸2-(4-苄氧基苯基)乙酯(HPE-2b)   白色固体，产率88.0%；mp 79.0~79.7 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:7.45~7.38(m, 5H, Ph—CH₂—O—), 7.14(d, J=6.8 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 6.94(d, J=6.8 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 5.07(s, 2H, Ph—CH₂—O—& —NH—), 4.37~4.28(m, 3H, Ph—CH₂—CH₂—O—& —COCHN—), 2.91(t, J=5.6 Hz, 2H, Ph—CH₂—), 2.68(d, J=5.7Hz, 3H, —CH₃), 1.47(s, 9H, —C(CH₃)₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:173.28, 157.61, 155.10, 137.05, 129.92, 129.76, 128.58, 127.95, 127.47, 114.94, 79.80, 70.04, 65.87, 49.22, 34.18, 28.34, 18.73;IR(KBr), σ/cm^-1:3394, 2976, 1738, 1525, 1321, 1161, 822, 741;ESI-MS计算值C₂₃H₂₉NO₅[M+Na]⁺ 422.20, 实测值422.20。

  N-叔丁氧基羰基脯氨酸2-(4-羟基苯基)乙酯(HPE-3a)   白色固体，产率70.0 %; mp 114.3~115.1 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:7.09~6.78(m, 4H, Ph—H), 6.00(brs, 1H, —OH), 4.35~4.17(m, 3H, Ph—CH₂—CH₂—O—& pyrrolidine-H_α×1), 3.58~3.36(m, 2H, pyrrolidine-H_α×2), 2.90~2.85(m, 2H, Ph—CH₂—), 2.20~1.80(m, 4H, pyrrolidine-H_β×4), 1.45(d, J=30.2 Hz, 9H, —C(CH₃)₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:172.99, 172.63, 156.37, 153.29, 130.12, 115.56, 65.60, 59.08, 46.51, 34.09, 30.73, 28.53, 24.24, 23.50;IR(KBr), σ/cm^-1:3260, 2974, 2871, 1746, 1661, 1437, 1165, 835;ESI-MS计算值C₁₈H₂₅NO₅[M+Na]⁺ 358.17, 实测值358.06。

  N-叔丁氧基羰基丙氨酸2-(4-羟基苯基)乙酯(HPE-3b)   白色固体，产率76.0%;mp 69.4~70.2 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:7.05(d, J=6.5 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 6.79(d, J=6.6 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 5.09(brs, 1H, —OH), 4.34~4.27(m, 3H, Ph—CH₂—CH₂—O—& —COCHN—), 2.87(t, J=5.6 Hz, 2H, Ph—CH₂—), 1.46(s, 9H, —C(CH₃)₃), 1.33(d, J=5.7 Hz, 3H, —CH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:173.33, 155.22, 154.57, 130.02, 129.32, 115.41, 80.01, 65.95, 49.25, 34.14, 28.33, 18.66;IR(KBr), σ/cm^-1:3385, 2995, 1684, 1518, 1173, 843;ESI-MS计算值C₁₆H₂₃NO₅ [M+Na]⁺ 332.16, 实测值332.06。

  将HPE-3a(100.0 mg, 0.30 mmol)溶于CH₂Cl₂(5.0 mL)中，冷却到0 ℃后加入TFA(0.7 mL, 9.00 mmol)，再将温度升至室温搅拌2 h，反应结束后在冰水浴中用氨水中和至微碱性，加入水(50.0 mL)，用乙酸乙酯(20.0 mL×3)进行萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在减压蒸馏下得粗产物，选择乙酸乙酯/石油醚(体积比，2:1)作为洗脱剂进行柱层析，得到透明液体HPE-4a：脯氨酸2-(4-羟基苯基)乙酯，产率：64.1%;¹H NMR(DMSO-d₆, 400 MHz), δ:9.21(brs, 1H, —OH), 7.02~6.62(m, 4H, Ph—H), 4.19~4.11(m, 2H, Ph—CH₂—CH₂—), 3.59~3.55(m, 1H, pyrrolidine-H_α×1), 2.84~2.69(m, 4H, Ph—CH₂—CH₂—& pyrrolidine-H_α×2), 1.91~1.55(m, 4H, pyrrolidine-H_β×4); ¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz), δ:175.36, 156.54, 156.14, 130.30, 128.47, 115.80, 115.61, 65.55, 63.27, 38.95, 34.24, 30.26, 25.88, 25.79;IR(KBr), σ/cm^-1:3440, 2950, 1735, 1517, 1218, 833;ESI-MS计算值C₁₃H₁₇NO₃ [M+H]⁺ 236.12, 实测值236.06。

  丙氨酸2-(4-羟基苯基)乙酯(HPE-4b)   白色固体，产率65.0%;mp 89.3~90.2 ℃; ¹H NMR(DMSO-d₆, 400 MHz), δ:9.21(brs, 1H, —OH), 7.01(d, J=8.4 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 6.66(d, J=8.4 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 4.20~4.08(m, 2H, Ph—CH₂—CH₂—O—), 3.51~3.48(m, 1H, —CHNH₂), 2.74(t, J=6.9 Hz, 2H, Ph—CH₂—), 1.09(d, J=7.0 Hz, 3H, —CH₃); ¹³C NMR(DMSO-d₆, 100 MHz), δ:173.69, 156.53, 130.43, 130.31, 115.69, 115.60, 65.83, 63.27, 49.28, 39.60, 17.55;IR(KBr), σ/cm^-1:3423, 3344, 2922, 1728, 1510, 1182, 1094, 835;ESI-MS计算值C₁₁H₁₅NO₃ [M+Na]⁺ 232.11, 实测值232.03。

  N-叔丁氧基羰基脯氨酸3-(4-苄氧基苯基)丙酯(HPP-2a)   白色固体，产率89.2%; mp 42.3~42.9 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 500 MHz), δ:7.44~7.32(m, 5H, Ph—CH₂—O—), 7.09~6.90(m, 4H, Ph—H), 5.04(s, 2H, Ph—CH₂—O—), 4.35~4.09(m, 3H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—O—& pyrrolidine-H_α×1), 3.57~3.39(m, 2H, pyrrolidine-H_α×2), 2.69(t, J=7.5 Hz, 2H, Ph—CH₂—CH₂—), 1.96~1.86(m, 4H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—& —COCHCH₂), 1.58(s, 2H, —COCHCH₂CH₂—), 1.44(d, J=27.6 Hz, 9H, —C(CH₃)₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 125 MHz), δ:173.26, 157.22, 137.15, 129.39, 129.30, 128.57, 127.92, 127.46, 114.89, 114.83, 79.86, 70.08, 64.17, 59.21, 46.34, 28.47, 28.36, 24.34, 23.63;IR(KBr), σ/cm^-1:2970, 2887, 1703, 1518, 1400, 1177, 847;ESI-MS计算值C₂₆H₃₃NO₅[M+Na]⁺ 462.24, 实测值462.12。

  N-叔丁氧基羰基丙氨酸3-(4-苄氧基苯基)丙酯(HPP-2b)   白色固体，产率92.0%;mp 81.6~82.5 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 500 MHz), δ:7.44~7.38(m, 5H, Ph—CH₂—O—), 7.09(d, J=8.5 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 6.90(d, J=8.6 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 5.04(s, 2H, Ph—CH₂—O—), 4.33~4.30(m, 1H, —CHNH—), 4.16~4.11(m, 2H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—), 2.63(t, J=7.8 Hz, 2H, Ph—CH₂—CH₂—), 1.97~1.91(m, 2H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—), 1.45(s, 9H, —C(CH₃)₃), 1.38(d, J=7.1 Hz, 3H, —CH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 125 MHz), δ:173.41, 157.21, 155.13, 137.17, 133.33, 129.34, 128.57, 127.91, 127.41, 114.88, 79.82, 70.08, 64.57, 49.27, 31.12, 30.32, 28.35, 18.77;IR(KBr), σ/cm^-1:3373, 2970, 1684, 1512, 1174, 866;ESI-MS计算值C₂₄H₃₁NO₅[M+Na]⁺ 436.22, 实测值436.12。

  N-叔丁氧基羰基脯氨酸3-(4-羟基苯基)丙酯(HPP-3a):白色固体，产率96.5%;mp 94.2~95.4 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 500 MHz), δ:7.02~6.75(m, 4H, Ph—H), 5.93(brs, 1H, —OH), 4.26~4.08(m, 3H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—& pyrrolidine-H_α×1), 3.59~3.39(m, 2H, pyrrolidine-H_α×2), 2.62~2.56(m, 2H, Ph—CH₂—), 2.28~1.85(m, 6H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—& pyrrolidine-H_β×4), 1.44(d, J=25.1 Hz, 9H, —C(CH₃)₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 125 MHz), δ:173.31, 173.14, 154.62, 154.36, 154.07, 132.82, 132.29, 129.42, 129.37, 115.36, 155.26, 80.21, 80.06, 64.39, 64.34, 59.31, 58.91, 46.63, 46.38, 28.47, 28.36, 24.29, 23.63;IR(KBr), σ/cm^-1:3375, 2962, 1751, 1668, 1522, 1420, 1181, 841;ESI-MS计算值C₁₉H₂₇NO₅[M+Na]⁺ 372.19, 实测值372.06。

  N-叔丁氧基羰基丙氨酸3-(4-羟基苯基)丙酯(HPP-3b):白色固体，产率97.0%;mp 87.3~88.0 ℃; ¹H NMR(CDCl₃, 500 MHz), δ:7.01(d, J=8.3 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 6.76(d, J=8.4 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 5.93(brs, 1H, —OH), 4.32~4.29(m, 1H, —CHNH—), 4.13(t, J=6.5 Hz, 2H, Ph—CH₂ CH₂CH₂—), 2.60(t, J=7.7 Hz, 2H, Ph—CH₂CH₂CH₂—), 1.94~1.89(m, 2H, Ph—CH₂CH₂CH₂—), 1.45(s, 9H, —C(CH₃)₃), 1.38(d, J=7.0 Hz, 3H, —CH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 125 MHz), δ:173.52, 155.53, 154.29, 132.71, 129.41, 115.37, 80.11, 64.73, 49.28, 31.13, 30.32, 28.34, 18.68;IR(KBr), σ/cm^-1:3400, 2966, 1684, 1531, 1163, 833;ESI-MS计算值C₁₇H₂₅NO₅[M+Na]⁺ 346.17, 实测值346.19。

  脯氨酸3-(4-羟基苯基)丙酯(HPP-4a)   无色液体，产率47.0%;¹H NMR(CDCl₃, 500 MHz), δ:7.05~6.73(m, 4H, Ph—H), 4.19~4.04(m, 2H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—), 3.76~3.65(m, 3H, pyrrolidine-H_α×3), 2.64~2.58(m, 2H, Ph—CH₂—), 2.19~1.70(m, 6H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—& pyrrolidine-H_β×4);¹³C NMR(CDCl₃, 125 MHz), δ:175.06, 154.56, 129.45, 129.40, 115.44, 115.31, 64.57, 2.26, 46.86, 34.41, 25.52, 23.34;IR(KBr), σ/cm^-1:3323, 2949, 1736, 1512, 1227, 1096, 831;ESI-MS计算值C₁₄H₁₉NO₃[M+Na]⁺ 250.14, 实测值250.07。

  丙氨酸3-(4-羟基苯基)丙酯(HPP-4b)   无色液体，产率81.3%;¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz), δ:7.04(d, J=8.4 Hz, 2H, Ph—H_α×2), 6.76(d, J=8.4 Hz, 2H, Ph—H_β×2), 4.15(t, J=6.5 Hz, 2H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—), 3.58(q, J=7.0 Hz, 1H, —CHNH₂), 2.96(s, 3H, —OH & —NH₂), 2.63(t, J=7.4 Hz, 2H, Ph—CH₂—), 1.99~1.92(m, 2H, Ph—CH₂—CH₂—CH₂—), 1.38(d, J=7.0 Hz, 3H, —CH₃); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz), δ:176.43, 154.12, 132.98, 129.46, 115.37, 64.37, 50.01, 31.27, 30.36, 20.64;IR(KBr), σ/cm^-1:3452, 3346, 2920, 1732, 1519, 1265, 820;ESI-MS计算值C₁₂H₁₇NO₃[M+H]⁺ 224.12, 实测值224.06。

  1.3   酚类衍生物美白活性研究实验方法

  具体测试方法参照文献^[16]。

  1.4   酚类衍生物抗氧化活性研究实验方法

  配制2, 2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)工作液：根据待测定样品的数量(含标准曲线)配制适量的ABTS工作液，首先使用等体积ABTS溶液和氧化剂溶液配制ABTS工作母液。ABTS工作母液配制后，室温避光存放12~16 h后方可使用。配制好的ABTS工作母液室温避光存放，在2~3 d内稳定。在使用前，将ABTS工作母液用80%乙醇稀释成ABTS工作液，要求ABTS工作液的吸光度减去相应的80%乙醇空白对照后，A405为1.4±0.05。当待检测样品为非水溶性样品时，用80%乙醇稀释，此时ABTS工作母液的稀释倍数约为35~55倍。

  首先用100%DMSO溶解待测化合物，配制成100 mmol/L贮备液。测定时再根据需要进行稀释。用样品配制溶液DMSO稀释标准品。将10 mmol/L的Trolox标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L。在96孔板的每个检测孔中加入200 μL ABTS工作液。在空白对照孔中加入10 μL DMSO；标准曲线检测孔内加入10 μL各种浓度的Trolox标准溶液；样品检测孔内加入10 μL各种样品，轻轻混匀，室温孵育2~6 min后测定A405。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。如果样品测定出来的吸光度在标准曲线范围以外，需把样品适当稀释后再进行测定。

  2.   结果与讨论

  2.1   酚类衍生物酪氨酸酶抑制活性

  从表 1可以看出，HB-1、HB-3a、HB-3b、HMB-3a、HMB-3b、HPE-2b、HPE-3b和HPE-4b对酪氨酸酶有抑制作用，其中HPE-2b(4.207±0.562)和HPE-3b(5.579±0.203)对酪氨酸酶的抑制作用略低于阳性对照物α-熊果苷(3.60±0.029)、HB-1(0.229±0.026)、HB-3a(0.829±0.135)、HB-3b(0.446±0.047)、HMB-3a(1.747±0.215)、HMB-3b(1.307±0.058)和HPE-4b(2.501±0.261)对酪氨酸酶的抑制作用均明显优于阳性对照物α-熊果苷(3.60±0.029)。

  表 1

  

  表 1  酚类衍生物对酪氨酸酶的半数抑制浓度对照

  Table 1.  The IC₅₀ of phenolic derivatives on tyrosinase

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  Sample	Solubility	IC50/(mmol·L-1)
  α-Arbutin	Soluble	3.60±0.029
  HB-1	Partly Soluble	0.229±0.026
  HB-2	Soluble	-
  HB-3a	Partly Soluble	0.829±0.135
  HB-3b	Partly Soluble	0.446±0.047
  HMB-1	Partly Soluble	-
  HMB-2	Soluble	-
  HMB-3a	Soluble	1.747±0.215
  HMB-3b	Partly Soluble	1.307±0.058
  DHB-1	Soluble	-
  DHB-2	Soluble	-
  DHB-3a	Soluble	-
  DHB-3b	Soluble	-
  HPE-2a	Insoluble	-
  HPE-3a	Insoluble	-
  HPE-4a	Soluble	-
  HPE-2b	Insoluble	4.207±0.562
  HPE-3b	Partly Soluble	5.579±0.203
  HPE-4b	Partly Soluble	2.501±0.261
  HPP-2a	Insoluble	-
  HPP-3a	Insoluble	-
  HPP-4a	Soluble	-
  HPP-2b	Insoluble	-
  HPP-3b	Insoluble	-
  HPP-4b	Partly Soluble	-
  Note:1.Solvent:5% DMSO; 2.“-” indicates that the sample has no inhibitory effect on tyrosinase in the range of measured concentration.

  对具有美白活性的化合物进行构效关系分析，初步得到以下结论：1)酚类含氮衍生物中含一个酚羟基的化合物对酪氨酸酶的抑制作用优于含两个酚羟基的化合物；2)含有一个酚羟基且含有一个甲氧基的化合物对酪氨酸酶的抑制作用优于只含有一个酚羟基的化合物；3)含吗啉和N-甲基哌嗪片段的化合物均对酪氨酸酶有抑制作用，含N-甲基哌嗪的化合物抑制活性更高；4)酪醇氨基酸衍生物对酪氨酸酶的抑制作用明显优于其同系物3-(4-羟基苯基)-l-丙醇氨基酸衍生物；5)酪醇的丙氨酸衍生物对酪氨酸酶的抑制作用优于酪醇的脯氨酸衍生物；6)苯环连有酚羟基的丙氨酸衍生物抑制作用优于酚羟基被苄基保护的衍生物，脱除氨基上的Boc保护基时抑制作用更强；7)从溶解度来看，不溶的化合物普遍没有美白活性，提高在5% DMSO中的溶解度是提高美白活性的关键。

  2.2   酚类衍生物抗氧化活性

  对显示出美白活性的8种化合物进行了抗氧化活性测试，实验结果显示，其中7种化合物：HB-3a、HB-3b、HMB-3a、HMB-3b、HPE-2b、HPE-3b和HPE-4b具有抗氧化能力，其中HB-3b和HMB-3a抗氧化能力与槲皮素(Quercetin)和番茄红素(Lycopene)相当。

  表 2

  

  表 2  酚类衍生物的抗氧化活性

  Table 2.  The anti-oxidant activities of phenolic derivatives

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  Sample	TEAC value/(mmol·L-1)
  Vitamin E analogues(Trolox)	1.0
  Vitamin C	1.0
  Vitamin E	1.0
  Glutathione(GSH)	1.3
  Uric acid	1.0
  β-Carotene	2.6
  Lycopene	3.1
  Quercetin	3.0
  Orange juice	2.2
  HB-1	0
  HB-3a	0.270
  HB-3b	3.26
  HMB-3a	3.018
  HPE-2b	0.004
  HPE-3b	0.227
  HPE-4b	3.78
  Note:TEAC(trolox-equivalent antioxidant capacity).

  对其进行结构与活性关系的分析，得出与抑制酪氨酸酶活性大体一致的结论：1)酚类含氮衍生物中含一个酚羟基的抗氧化活性优于含两个酚羟基的化合物；2)含有一个酚羟基且含有一个甲氧基的酚类化合物抗氧化活性优于只含有一个酚羟基的化合物；3)在分析中可知含吗啉和N-甲基哌嗪片段的化合物均具有抗氧化活性；4)唯一不同的是含有两个酚羟基的化合物未显示出抗氧化活性。

  3.   结论

  本文将酚类化合物分别与吗啉、N-甲基哌嗪及氨基酸进行偶联，对所合成的24个目标化合物进行美白活性测试初筛，8种化合物显示出美白活性，其中6种化合物美白活性明显优于阳性对照物α-熊果苷，可作为潜在的美白剂应用于化妆品市场。对显示出美白活性的化合物进行抗氧化活性测试，最终得到7种具有较好美白及抗氧化活性的化合物，该类化合物在美白、抗氧化市场具有潜在的应用前景，以上结果为以后酚类化合物的结构修饰与改造提供了参考。

  
  
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  Scheme 1  Synthesis of a series of phenolic derivatives

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  表 1  酚类衍生物对酪氨酸酶的半数抑制浓度对照

  Table 1.  The IC₅₀ of phenolic derivatives on tyrosinase

  Sample	Solubility	IC50/(mmol·L-1)
  α-Arbutin	Soluble	3.60±0.029
  HB-1	Partly Soluble	0.229±0.026
  HB-2	Soluble	-
  HB-3a	Partly Soluble	0.829±0.135
  HB-3b	Partly Soluble	0.446±0.047
  HMB-1	Partly Soluble	-
  HMB-2	Soluble	-
  HMB-3a	Soluble	1.747±0.215
  HMB-3b	Partly Soluble	1.307±0.058
  DHB-1	Soluble	-
  DHB-2	Soluble	-
  DHB-3a	Soluble	-
  DHB-3b	Soluble	-
  HPE-2a	Insoluble	-
  HPE-3a	Insoluble	-
  HPE-4a	Soluble	-
  HPE-2b	Insoluble	4.207±0.562
  HPE-3b	Partly Soluble	5.579±0.203
  HPE-4b	Partly Soluble	2.501±0.261
  HPP-2a	Insoluble	-
  HPP-3a	Insoluble	-
  HPP-4a	Soluble	-
  HPP-2b	Insoluble	-
  HPP-3b	Insoluble	-
  HPP-4b	Partly Soluble	-
  Note:1.Solvent:5% DMSO; 2.“-” indicates that the sample has no inhibitory effect on tyrosinase in the range of measured concentration.

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  表 2  酚类衍生物的抗氧化活性

  Table 2.  The anti-oxidant activities of phenolic derivatives

  Sample	TEAC value/(mmol·L-1)
  Vitamin E analogues(Trolox)	1.0
  Vitamin C	1.0
  Vitamin E	1.0
  Glutathione(GSH)	1.3
  Uric acid	1.0
  β-Carotene	2.6
  Lycopene	3.1
  Quercetin	3.0
  Orange juice	2.2
  HB-1	0
  HB-3a	0.270
  HB-3b	3.26
  HMB-3a	3.018
  HPE-2b	0.004
  HPE-3b	0.227
  HPE-4b	3.78
  Note:TEAC(trolox-equivalent antioxidant capacity).

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