所有肿瘤中大约有2.5%发生在口腔中。据报道，在美国，每年发现28900例新的口腔癌病例，其中死亡率约为7400例。口腔癌和咽癌组合在一起，是世界上第六大常见癌症[1]。近年来，全世界口腔癌的发生率一直在上升，世界上每年新确诊病例超过500000例[2]。在美国口腔癌每小时造成1人死亡[3]。在中国，一项来自全国72个肿瘤登记处的流行病学调查结果显示口腔癌及咽喉癌的发病率为3.28/100000，死亡率为1.37/100000[2]。口腔鳞状细胞癌(OSCC)复发率高，转移率高，对治疗不敏感，严重危害人类健康；口腔鳞状细胞癌患者的总体5年生存率是主要癌症中最低的，并且在过去20年中没有变化。尽管在过去几十年中肿瘤学在治疗和诊断方面取得了进展，但口腔鳞状细胞癌的预后仍然很差[4]。
石墨烯(Graphene，GR)是以sp2形式杂化的碳原子组成的二维原子晶体[5]。石墨烯及其衍生物具有一些独特的物理化学性质：大表面积、良好的生物官能性、易溶解性、高载药能力及易于细胞膜渗透的能力等[6]，在纳米科学技术领域和生物医学领域中有其独特的优势。石墨烯及其衍生物在细胞培养，细胞生长和组织工程领域也显示出其优势，可以用作组织工程的基质[7]，也可以为干细胞疗法提供有前途的生物相容性支架[8]。石墨烯的表面官能化修饰和高蛋白质吸附作用，可以增强细胞粘附，促进细胞与细胞相互作用，迁移和增殖[9]。其它碳纳米材料，如碳纳米管(CNTs)对许多生命系统造成急性和慢性不利影响[10]，富勒烯在制备过程中残留的有机溶剂容易引起生物毒性[11]，石墨烯的水溶性更好，毒性更低，更适合应用于生物医学领域。
随着纳米材料的日益广泛应用，纳米材料的健康风险大大增加，迫切需要对其生物安全性进行研究[12]。以纳米技术为基础的药物递送作为一种药物武器，给药物递送于肿瘤细胞提供了机会[13]。在几乎所有实体肿瘤中经常观察到缺氧和酸性微环境，并且癌细胞适应和利用这种环境得以存活并不断侵袭机体。缺氧和酸性微环境还可导致基因突变的多样性和不稳定性[14]。发现或设计新的生物医学功能，或预测纳米粒子在体内的毒理学后果，首先需要了解纳米粒子与靶细胞的相互作用过程[15]。由于与石墨烯相关材料的制造和使用过程中存在相关的潜在危险因素，在过去的十年中，这些化合物的纳米毒理学研究的数量迅速增加[16]。顺铂(CDDP)作为治疗头颈部鳞癌的常用药物，结合功能化修饰的氧化石墨烯预计会对鳞癌产生较好的治疗和杀伤效果。
本文利用化学氧化还原法制备纳米氧化石墨烯(NGO)，并对其进行聚乙二醇(PEG)的功能化修饰，研究修饰后的NGO通过羧基(—COOH)和CDDP的氨基以共价键结合，用扫描电子显微镜(SEM)、紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)进行表征，并采用MTT法检测了石墨烯纳米载药体系对口腔鳞癌(KB)细胞的杀伤效应。
TDL-80-2B型离心机(上海安亭科学仪器厂)；HN96-Ⅱ型超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；ZTJ2DF-101S型恒温磁力搅拌器(北京中慧天诚科技有限公司)；GZX-9070型电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；UVmini-2550型紫外分光光度计(UV-Vis, 日本岛津公司)；Nicolet6700型傅里叶红外光谱仪(FTIR, 美国赛默飞世尔科技有限公司)；SU8010型扫描电子显微镜(SEM，长沙科美分析仪器有限公司)；Alpha 1-4LD plus型冷冻干燥机(德国Christ公司)；ELX800型酶标仪(美国BioTek公司)。
天然鳞片石墨(吉林亚泰药业有限公司)、顺铂注射液(6 mL：30 mg，江苏豪森药业股份有限公司)、聚乙二醇Mw=5000，纯度≥99.8%(上海阿拉丁试剂有限公司)、N-羟基琥珀酰亚胺，纯度≥99.8%(上海麦克林生化科技有限公司)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，纯度≥99.8%(上海麦克林生化科技有限公司)、氯乙酸钠，纯度≥99.8%(上海麦克林生化科技有限公司)、RPMI1640培养基(Gibco)、胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，纯度≥98%(上海生工生物工程有限公司)、二甲基亚砜(DMSO)，纯度≥99.8%(上海麦克林生化科技有限公司)、胰蛋白酶，纯度≥99.8%(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。口腔鳞癌KB细胞由吉林省肿瘤医院提供。实验所用其它试剂均为分析纯，购自上海麦克林生化科技有限公司。
称取1 g鳞片石墨，0.75 g NaNO3和4.5 g KMnO4放入烧杯中，烧杯置于冰水浴中。然后向烧杯中缓慢加入100 mL浓H2SO4溶液，进行搅拌，保持反应溶液温度不高于15 ℃，持续搅拌1 h。升温至60 ℃，搅拌10 h后，升温至95 ℃，向烧杯中缓慢滴加100 mL蒸馏水，继续搅拌1 h。然后，降温至50 ℃后，倒入9 mL的溶质质量分数为5%的H2O2，趁热过滤，最后用5%的盐酸充分洗涤滤饼，直至滤液中无SO42-(用BaCl2检测)，制得氧化石墨烯(GO)，干燥后得固体。取1 g/L的GO水溶液100 mL，570 W超声共计10 h，每间隔1 h取产物，12000 r/min离心5 min，去除较大的沉淀，并将上清液继续超声至10 h，使GO破碎为NGO，经冷冻干燥得固体。
NGO-COOH的制备 取1.2 g的NaOH和1.2 g的氯乙酸钠加入到20 mL的1 g/L的NGO分散液中。在500 W功率下超声3 h，离心去上清液后，加入去离子水分散，调pH值至中性。然后将分散液置于去离子水中透析48 h，去除其他杂质离子。
NGO-PEG的制备 取10 mg的EDC和8 mg的NHS加入到10 mL NGO-COOH分散液中。调pH=5.6，并将混合物超声5 min，加入100 mg的PEG，并持续搅拌反应24 h。终产物置于去离子水中透析48 h以去除过量的反应物。
CDDP标准曲线的绘制 UV-Vis测试不同浓度CDDP在301 nm处的吸收峰的大小绘制标准曲线。
NGO-PEG-CDDP的制备 取1 g/L的NGO-PEG和5 g/L的CDDP各5 mL，于37 ℃的避光条件下在磁力搅拌器中持续搅拌反应24 h，离心，沉淀即为NGO-PEG-CDDP。
NGO-PEG对CDDP的负载 取离心后一定体积上层清液，测其吸光度，利用事先绘制好的顺铂浓度-吸光度标准曲线，读出离心清液中药物的浓度，根据公式求出NGO-PEG对CDDP的装载率。
|
$ w_{1} / \%=\frac{\rho_{0} V_{0}-\rho_{1} V_{1}}{\rho_{0} V_{0}} \times 100 $ |
(1) |
式中，w1为载药率，ρ0为初始加入CDDP的质量浓度(g/L)，V0为初始加入CDDP的体积(mL)，ρ1为载药后经离心所得的上清液中药物的质量浓度(g/L)，V1为载药后经离心所得上清液的体积(mL)。
取对数生长期细胞，用胰酶消化成单细胞悬液，离心弃上清，加入RPMI1640培养基，调整细胞浓度至5×104/mL，以100 μL/孔的密度接种于96孔板。置37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h使细胞贴壁，弃去原培养液，分别加入1、5、10、20、40、50、80、100、150和200 mg/L的NGO/ NGO-PEG和1、2、4、5、8、10、15和20 mg/L的CDDP/NGO-PEG-CDDP。其中每个浓度设3个复孔。设置3个阴性对照和3个空白对照组。加药后分别继续培养24、48和72 h后每孔加入5 g/L MTT 10 μL。继续培养4 h后小心弃去上清，加入150 μL DMSO，在培养箱培养10 min使蓝紫色结晶充分溶解，酶标仪测定490 nm下的吸光度值，计算细胞相对增殖率(Relative Growth Rate，RGR):
|
$ {\rm{RGR/\% = }}\frac{{{\rm{实验组OD均值}} - {\rm{空白组OD均值}}}}{{{\rm{阴性对照组OD均值}} - {\rm{空白组OD均值}}}} \times 100 $ |
(2) |
OD值(Optical Density)，表示被检测物吸收掉的光密度。式中，实验组：用NGO、NGO-PEG、CDDP和NGO-PEG-CDDP培养细胞；阴性对照组：用RPMI1640培养基培养细胞；空白组：只加入RPMI1640培养基。
本文采用化学氧化还原法制备了NGO，通过SEM对所制备的NGO进行表征，如图 1所示。
A.no ultrasound; B.ultrasonic 2 h; C.ultrasonic 10 h; D, E, F.corresponding particle size distribution map
用250倍的SEM观察，制得的氧化石墨烯平均长径约为320 μm(图 1A)，进行了粒径分布计算(图 1D)。超声2 h后，在600倍数下观察，氧化石墨烯为单层，平均长径约为39.52 μm，且厚度变薄(图 1B)，其粒径分布计算如图 1E所示。在80000倍数下观察，经过10 h的超声破碎，氧化石墨烯绝大部分已经剥离为单层纳米级氧化石墨烯，平均长径约为100 nm(图 1C)，进行了粒径分布计算(图 1F)。
为了增加生物相容性，制备的氧化石墨烯用聚乙二醇进行了修饰，通过NGO的羧基(—COOH)和CDDP的氨基以共价键结合[17]，通过UV-Vis对NGO、NGO-PEG、CDDP及载药成功的NGO-PEG-CDDP复合物进行分析(如图 2所示)。
由图 2可见，NGO在230 nm处有最大吸收峰，NGO经过PEG修饰后在260 nm处有最大吸收峰，这是由于—COOH化NGO的过程中它被逐步还原，吸收峰红移至260 nm处。CDDP在301 nm处有明显的吸收峰，而在230 nm处无明显的吸收峰。NGO-PEG-CDDP在301和230 nm处均具有明显的吸收峰，据此可以判断CDDP已经成功和NGO结合。
载药实验测得NGO-PEG-CDDP纳米载药体系溶液的上清液在301 nm处的吸光度为1.574，依据浓度-吸光度标准曲线(y=0.4649x+0.0858，R2=0.9988)可知，此吸光度对应的药物质量浓度为3.20 g/L，由公式算出载药率为42.4%。
为了进一步分析NGO-PEG-CDDP载药复合物的化学组成和结构，利用FTIR光谱对其进行表征分析(如图 3所示)。FTIR光谱可以揭示NGO、NGO-PEG和NGO-PEG-CDDP之间的微观结构变化。如图 3所示，NGO在3400 cm-1处有一个较宽的吸收峰，是由于羟基(—OH)的伸缩振动。NGO在1700 cm-1处的吸收峰表示羰基的C＝O伸缩振动，并且在1100 cm-1处的谱带与C—O带相关联。在NGO-PEG的FTIR光谱中，在3400 cm-1处的吸收峰为羟基(—OH)的伸缩振动，1650和2920 cm-1处的吸收峰分别来自于—CO—NH—键和—NH—键的伸缩振动峰，在1085 cm-1的吸收峰是由于—C—O—C—键的拉伸，可归因于PEG链的共轭[17]。在NGO-PEG-CDDP的FTIR光谱中，可观察到在1650 cm-1处来自于—CO—NH—键的伸缩振动，在2915 cm-1处来自于—NH—键的伸缩振动，在1085 cm-1的吸收峰是由于—C—O—C—键的拉伸，此外，可观察到典型但弱化的CDDP模式吸收峰(800、1304和538 cm-1)，表明CDDP与NGO-PEG连接成功。
为了验证NGO-PEG-CDDP载药体系的体外细胞杀伤效果，我们选用口腔鳞癌KB细胞进行MTT检测实验。
实验结果表明，NGO不同的浓度梯度作用于KB细胞24、48和72 h，随着质量浓度、时间的增加，KB细胞的死亡率呈梯度增加，NGO作用于KB细胞24、48和72 h的IC50值分别为：64.8897、37.7572和6.0674 mg/L(图 4A)。
A.NGO; B.NGO-PEG; C.CDDP; D.NGO-PEG-CDDP
NGO-PEG作用于KB细胞24、48和72 h，随着质量浓度、时间的增加，KB细胞的死亡率呈梯度增加。NGO-PEG作用于KB细胞48 h，与24 h后的细胞存活率无明显差别，这可能是由于加入聚乙二醇对细胞增殖的促进作用[18]。NGO-PEG作用于KB细胞24、48和72 h的IC50值：122.3207、105.7791和24.8302 mg/L(图 4B)。
CDDP不同的浓度梯度作用于KB细胞24、48和72 h，随着质量浓度、时间的增加，KB细胞的死亡率呈梯度增加，作用KB细胞24、48和72 h的IC50值：6.0578、3.2124和1.4166 mg/L(图 4C)。
NGO-PEG-CDDP作用于KB细胞24、48和72 h，随着质量浓度、时间的增加，KB细胞的死亡率呈梯度增加。在相同剂量浓度情况下，NGO-PEG-CDDP对KB细胞的毒性均高于CDDP对KB细胞的毒性。NGO-PEG-CDDP作用于KB细胞24、48和72 h的IC50值：5.1133、2.1275和1.1290 mg/L。实验表明，NGO-PEG-CDDP对KB细胞的杀伤作用明显，与浓度和时间呈正比(图 4D)。
本文运用化学氧化还原法制备出了氧化石墨烯(GO)，经超声破碎、剥离得到了单层的纳米GO(NGO)，NGO扫描电子显微镜(SEM)表征的实验结果观察到超声10 h的GO的纳米大小均匀。对NGO进行了PEG功能化修饰，聚乙二醇(PEG)修饰的NGO具有良好的生物相容性和生理稳定性。
NGO具有的羧酸(—COOH)和CDDP的氨基以共价键结合，制备NGO负载抗癌药物CDDP的纳米载药体系，具有双重的抗癌效果。NGO-PEG-CDDP的紫外可见光谱(UV-Vis)以及傅里叶红外(FTIR)光谱表征的结果进一步表明，CDDP已成功负载在NGO纳米片上。通过计算NGO-PEG对CDDP的负载率，测得42.4%CDDP和NGO-PEG结合。
MTT实验检测NGO-PEG-CDDP作用于KB细胞的杀伤效果，证实NGO-PEG-CDDP的杀伤作用要比NGO-PEG和CDDP单独作用的效果强，经过PEG修饰后的NGO具有生物相容性、稳定性，增加了NGO-PEG-CDDP杀伤KB细胞的效果，随着作用时间和质量浓度的增加效果更加明显，为NGO在肿瘤治疗的临床应用提供了理论依据。
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图 1 氧化石墨烯的扫描电子显微镜照片及粒径分布
Figure 1 Scanning electron micrograph and particle size distribution of GO
A.no ultrasound; B.ultrasonic 2 h; C.ultrasonic 10 h; D, E, F.corresponding particle size distribution map
图 2 NGO(a)、NGO-PEG(b)、CDDP(c)和NGO-PEG-CDDP(d)的紫外可见吸收光谱图
Figure 2 UV-Vis absorption spectra of NGO(a), NGO-PEG(b), CDDP(c) and NGO-PEG-CDDP(d)
图 3 NGO(a)、NGO-PEG(b)及NGO-PEG-CDDP(c)的傅里叶红外光谱图
Figure 3 Fourier-infrared spectra of NGO(a), NGO-PEG(b) and NGO-PEG-CDDP(c)
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