辣椒疫霉侵染引起的辣椒疫病是辣椒生产上毁灭性土传病害，其主要特征是发病周期短，流行速度快，发病面积大。病原菌通过孢子囊萌发产生的游动孢子侵入植物的根、茎、叶、花和果实，该病害在辣椒全生育期均可发生，以成株期危害最大，轻者减产20%~30%, 重者毁种或绝收[1-2]。烟草黑胫病是世界范围内烟草上的一种毁灭性病害，发病后烟草茎基部出现黑斑，叶片自下而上逐渐萎蔫变黄，最终导致整株枯死[3]。禾谷镰刀菌引起的赤霉病能够广泛侵染小麦，造成严重的产量损失，其产生的真菌毒素能够降低小麦质量，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性最大，有较强的细胞毒性、免疫毒性和胚胎毒性，严重威胁畜类健康和粮食安全[4]。传统的方法是大量地使用化学杀菌剂，如三唑酮、嘧菌酯、多菌灵等，目前市场上抗真菌药物存在着种类缺乏、选择性小和毒副作用大的缺点，且化学杀菌剂的长期和过量使用常常会导致严重的环境污染及真菌的耐药性[5-7]。因此，开发新型、高效、绿色、环保、低毒、广谱的抗真菌药物迫在眉睫。
壳寡糖属低相对分子质量的壳聚糖，是由自然界大量存在的N-乙酰基氨基葡萄糖的聚合物甲壳素脱乙酰化并降解而制得的一种天然生物活性物质，因其无毒无害、生物相容性好，且具有较好的抗癌[8]、抗氧化[9]和抗菌[10]等活性而备受研究者的关注。与化学杀菌剂相比较，壳寡糖的抗菌活性较低限制了它的广泛应用，目前国内外的研究工作集中在通过化学方法对壳寡糖的结构进行修饰[11-15]，以丰富其结构，提高抗菌活性，拓展其应用范围。
缩氨基硫脲类化合物是一类具有广谱生物活性的化合物, 可以抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗癌及抗寄生虫等[16-17]。缩氨基硫脲类化合物中含有S、N等配位原子，可以和许多金属离子配位，从而生成生物活性更强的缩氨基硫脲金属配合物，如缩氨基硫脲Ni(Ⅱ)配合物对人乳腺癌细胞系MCF-7和人卵巢癌细胞系SKOV-3的细胞毒活性明显优于其配体[18]；缩氨基硫脲钴、镍、铜和锌对大肠杆菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌的体外抗菌活性也比配体高很多[19]。铜缩氨基硫脲配合物由于具有优异的抗菌活性吸引了众多研究者的兴趣[20]。
本研究拟将氨基硫脲通过共价键锚锭法引入到壳寡糖上，生成壳寡糖缩氨基硫脲配体后再与铜离子进行配位，合成新型壳寡糖缩氨基硫脲铜配合物(合成路线如Scheme 1所示)，并考察所合成化合物的抗辣椒疫霉菌、烟草黑胫菌、禾谷镰刀菌等植物病原真菌活性，以期提高壳寡糖衍生物的抗真菌活性, 使其在农业生产中得到更广泛的应用。
a.chitosan oligosaccharide；b.chitosan oligosaccharide aminothiourea；c.chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base；d.chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base Cu complex
壳寡糖(山东奥康生物科技有限公司)，脱乙酰度大于90%，粘均相对分子质量＜3000;吡啶甲醛，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 氯化铜, 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 二硫化碳, 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯乙酸钠，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；80%水合肼, 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余试剂均为市售分析纯。辣椒疫霉菌(P.capsici)、烟草黑胫菌(P.nicotianae)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)由河南农业大学植物保护学院提供。
Nicolet IS-10型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，KBr压片；TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计(UV-Vis，北京普析通用仪器有限责任公司)；SDT Q600型综合热分析仪(TG-DTA，美国TA仪器公司)，以Al2O3为参比，升温速率10 ℃/min；DPX-400型超导核磁共振仪(NMR, 德国Bruker公司)；OptiMass9500/NMR-213型电感耦合等离子体飞行时间质谱仪(ICP-MS，澳大利亚GBC科学仪器公司)。
将4.0 g壳寡糖(a)和5 mL氨水加入圆底烧瓶中，室温下搅拌30 min，缓慢滴加2 mL二硫化碳，搅拌2 h后加入3.0 g氯乙酸钠，再反应30 min，滴加3 mL 80%的水合肼，最后反应2 h，加入50 mL甲醇使产品析出，待沉淀完全, 用布氏漏斗抽滤，滤饼用少量无水乙醇充分洗涤2-3次，40 ℃下真空干燥至恒重，得壳寡糖氨基硫脲(b)。
将壳寡糖氨基硫脲2.49 g，吡啶-2-甲醛1 mL，100 mL甲醇，0.5 mL冰乙酸，加入圆底烧瓶中，70 ℃左右加热10 h。室温下静置10~20 h，待沉淀完全，用布氏漏斗抽滤，滤饼用甲醇洗涤2-3次，60 ℃真空干燥，得壳寡糖氨基硫脲席夫碱(c)。
1.7 g壳寡糖氨基硫脲席夫碱，50 mL体积分数1%醋酸溶液，加入圆底烧瓶中，搅拌使席夫碱溶解完全，然后加入1.0 g氯化铜水溶液，在室温下搅拌反应12 h。静置后，将混合物加入约4倍体积的无水乙醇中，析出沉淀，抽滤，滤饼用无水乙醇反复洗2-3次，40 ℃真空干燥，得壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜(d), ICP测得铜质量分数为15.77%。
采用菌丝生长速率法测定了本文合成的化合物对辣椒疫霉菌、烟草黑胫菌、禾谷镰刀菌的抑制作用。首先将壳寡糖及其衍生物溶于0.5%醋酸溶液制成10 g/L原液，然后将原液加入到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中，使最终药液的质量浓度分别为0.1、0.5和1.0 g/L(注：不加药液的为空白对照)。待上述混合物凝固后，将菌丝转移到测试培养皿的正中央，然后放入30 ℃生化培养箱中培养2~3 d。
抑菌率由式(1)计算：
|
$抑菌率/\% = \left(1-\frac{D_{\mathrm{a}}}{D_{\mathrm{b}}}\right) \times 100$ |
(1) |
式中，Da为测试盘中菌丝生长圈的直径(cm)；Db为空白对照盘中菌丝生长圈的直径(cm)。
壳寡糖、壳寡糖氨基硫脲、壳寡糖氨基硫脲席夫碱和壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物的红外谱图如图 1所示。在壳寡糖中，在3439 cm-1的吸收峰为O—H与N—H的伸缩振动吸收峰，1662 cm-1为C＝O的伸缩振动吸收峰, 1609 cm-1为N—H的弯曲振动吸收峰。与壳寡糖相比，壳寡糖氨基硫脲在1657 cm-1处出现一个新峰为壳寡糖氨基硫脲的—NH—NH2伸缩振动吸收峰，1152 cm-1为C＝S的伸缩振动吸收峰[21]。与壳寡糖氨基硫脲相比，壳寡糖氨基硫脲席夫碱在1652 cm-1处出现一个新峰为壳寡糖氨基硫脲席夫碱的C＝N伸缩振动吸收峰, 说明席夫碱配体的成功形成。与壳寡糖氨基硫脲席夫碱相比，在壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物中，C＝N伸缩振动吸收峰由1652 cm-1移动到1490 cm-1。N—H伸缩振动吸收峰由3420 cm-1移动到3048 cm-1，这些变化是由于铜与壳寡糖氨基硫脲席夫碱中的N原子发生了配位所导致的, 表明成功合成了壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物。
壳寡糖、壳寡糖氨基硫脲、壳寡糖氨基硫脲席夫碱及壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物的紫外光谱图如图 2所示。由图 2可以看出，壳寡糖在223.2 nm处有1个强而窄的吸收峰。与壳寡糖相比，壳寡糖氨基硫脲出现了两个明显的新峰，在239.4 nm处出现的强吸收峰为C＝S π→π*跃迁吸收峰，在294.9 nm处出现的弱吸收峰为C＝S的n→π*跃迁产生的吸收。与壳寡糖氨基硫脲相比，壳寡糖氨基硫脲席夫碱在258.4 nm处出现了一个强而窄的吸收峰，归属为C＝N π→π*跃迁吸收，在327.6 nm处出现的弱而宽的吸收峰归属为C＝N n→π*跃迁吸收。在壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物中，C＝N π→π*跃迁吸收峰红移到了260.9 nm, 表明C＝N中的N原子参与了配位，形成了铜配合物。
核磁是糖衍生物研究中非常重要的表征手段，是活性官能团是否连接到糖上的有力证据。图 3是壳寡糖、壳寡糖氨基硫脲和壳寡糖氨基硫脲席夫碱的氢和碳核磁谱图。与壳寡糖相比较，壳寡糖氨基硫脲的碳核磁图在176处出现的新峰为C＝S键的信号峰，在核磁氢谱图中的2.8处出现了硫脲中氨基的氢信号峰，说明壳寡糖氨基硫脲被合成[22]。与壳寡糖氨基硫脲相比较，壳寡糖氨基硫脲希夫碱的碳核磁图在130~160之间出现了吡啶的碳信号峰，氢核磁图上在8.0~9.5范围出现了很强的吡啶氢信号峰[23]，均说明吡啶环被引入到壳寡糖的骨架上。
壳寡糖、壳寡糖氨基硫脲、壳寡糖氨基硫脲席夫碱及壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物的热重谱图如图 4所示。壳寡糖在81.7 ℃失去水分子[24]，在210 ℃有一强放热峰, 失重40%左右，主要是壳寡糖的降解所致。壳寡糖氨基硫脲、壳寡糖氨基硫脲席夫碱、壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物的失水温度与壳寡糖相似，在100 ℃以下, 但开始降解温度分别在312、280和180 ℃。与壳寡糖相比较，改性后的壳寡糖衍生物稳定性出现了先增加后降低的趋势，这是由于氨基硫脲的引入增加了壳寡糖的分子内氢键的形成，从而增加了稳定性，随后席夫碱的生成使部分氢键的结合被破坏，导致其稳定性降低，最后由于壳寡糖硫脲席夫碱与铜配位，分子内的氢键结合进一步被破坏，结晶度发生改变，热稳定性大幅减小。由图 4还可以看出，与壳寡糖相比较，壳寡糖衍生物的吸热峰面积有所增加但吸热峰值不断下降，表明由于壳寡糖衍生物的形成改变了壳寡糖的部分晶体结构[21]。
壳寡糖、壳寡糖氨基硫脲、壳寡糖氨基硫脲席夫碱及壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物的抗辣椒疫霉菌的活性如图 5所示。由图 5可以看出，4种化合物对辣椒疫霉的抑菌率均随着其质量浓度的增加而增加。在质量浓度1.0 g/L时，4种化合物对辣椒疫霉的抑菌率分别是53.9%、82.5%、70.4%和74.19%。壳寡糖的3种衍生物对辣椒疫霉菌的抑制作用均优于壳寡糖，相对而言，壳寡糖氨基硫脲的抑菌活性最高，壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物次之。
壳寡糖、壳寡糖氨基硫脲、壳寡糖氨基硫脲席夫碱和壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物的抗烟草黑胫菌的活性如图 6所示。由图 6可以看出，4种化合物对烟草黑胫菌的抑菌率在1.0 g/L质量浓度时，分别是50.4%、40.6%、48.5%和56.6%。壳寡糖氨基硫脲、壳寡糖氨基硫脲席夫碱对烟草黑胫菌的抑制作用均低于壳寡糖，壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物的抑菌活性稍稍高于壳寡糖。
壳寡糖、壳寡糖氨基硫脲、壳寡糖氨基硫脲席夫碱和壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物的抗禾谷镰刀菌的活性如图 7所示。由图 7可以看出，4种化合物对禾谷镰刀菌的抑菌率在1.0 g/L质量浓度时，分别是47.9%、60.7%、59.1%和66.6%。壳寡糖的3种衍生物对禾谷镰刀菌的抑制作用均优于壳寡糖，壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物的抑菌活性最高。
总体来说，所合成的壳寡糖衍生物对辣椒疫霉和禾谷镰刀的抗菌活性优于烟草黑胫菌；在抗辣椒疫霉实验中，壳寡糖氨基硫脲表现出较好的抗真菌的活性。可能是由于氨基硫脲基团的引入，使壳寡糖在溶液中含有更多的正离子，有利于吸附在辣椒疫霉真菌带负电的细胞膜上。使辣椒疫霉真菌的正常活动受到限制，细胞膜更易破裂引起内容物泄露而死亡。在抗禾谷镰刀菌的实验中，壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物显示出较好的抗菌活性，可能是由于配合物中的铜离子容易与氧结合，能够储存、转移、甚至进入禾谷镰刀真菌内部，影响其蛋白质、氨基酸、及辅酶的合成，使蛋白质或酶变性，从而抑制禾谷镰刀真菌的生长。
本文以壳寡糖为原料，合成壳寡糖氨基硫脲、壳寡糖氨基硫脲和壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物3种壳寡糖衍生物。通过对比系列壳寡糖及其衍生物的抗辣椒疫霉菌、抗烟草黑胫菌、抗禾谷镰刀菌的活性，可以得出如下结论:1)与壳寡糖相比，所合成的3种壳寡糖衍生物对辣椒疫霉和禾谷镰刀菌的活性明显提高；2)所合成的壳寡糖衍生物对辣椒疫霉和禾谷镰刀的抗菌活性优于抗烟草黑胫菌的活性；3)壳寡糖氨基硫脲对辣椒疫霉菌有较好的活性；4)壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物对禾谷镰刀菌的抑制作用较强。关于所合成的化合物对其它植物病害的抑制作用目前正在进一步筛选中。
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Scheme 1 Synthesis of chitosan oligosaccharide thiosemicarbazone Cu(Ⅱ) complex
a.chitosan oligosaccharide；b.chitosan oligosaccharide aminothiourea；c.chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base；d.chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base Cu complex
图 1 壳寡糖a、壳寡糖氨基硫脲b、壳寡糖氨基硫脲席夫碱c及壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物d的红外光谱图
Figure 1 FT IR spectra of chitosan oligosaccharide a, chitosan oligosaccharide aminothiourea b, chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base c and chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base Cu complex d
图 2 壳寡糖a、壳寡糖氨基硫脲b、壳寡糖氨基硫脲席夫碱c及壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物d的紫外可见光谱图
Figure 2 UV-Vis spectra of chitosan oligosaccharide a, chitosan oligosaccharide aminothiourea b, chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base c and chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base Cu complex d
图 3 壳寡糖a、壳寡糖氨基硫脲b、壳寡糖氨基硫脲席夫碱c的核磁氢谱(A)和核磁碳谱(B)
Figure 3 1H NMR spectra(A) and 13C NMR spectra(B) of chitosan oligosaccharide a, chitosan oligosaccharide aminothiourea b, chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base c
图 4 壳寡糖(A)、壳寡糖氨基硫脲(B)、壳寡糖氨基硫脲席夫碱(C)、壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物(D)的热重谱图
Figure 4 TG curves of chitosan oligosaccharide(A), chitosan oligosaccharide aminothiourea(B), chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base(C) and chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base Cu complex(D)
图 5 壳寡糖a(A)、壳寡糖氨基硫脲b(B)、壳寡糖氨基硫脲席夫碱c (C)、壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物d(D)的抗辣椒疫霉菌的抑菌效果，水为空白对照(E)及它们的抑菌率(F)
Figure 5 The inhibitory effects against P.capsici of chitosan oligosaccharide a(A), chitosan oligosaccharide aminothiourea b(B), chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base c(C), chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base Cu complex d(D), water as a blank control(E) and histogram of their inhibitory index(F)
图 6 壳寡糖a(A)、壳寡糖氨基硫脲b(B)、壳寡糖氨基硫脲席夫碱c(C)、壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物d(D)的抗烟草黑胫菌的活性，水为空白对照(E)及它们的抑菌率(F)
Figure 6 The avtivity against P. nicotianae of chitosan oligosaccharide a(A), chitosan oligosaccharide aminothiourea b(B), chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base c(C), chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base Cu complex d(D), water as a blank control(E) and histogram of their inhibitory index(F)
图 7 壳寡糖a(A)、壳寡糖氨基硫脲b(B)、壳寡糖氨基硫脲席夫碱c(C)、壳寡糖氨基硫脲席夫碱铜配合物d(D)的抗禾谷镰刀菌的活性，水为空白对照(E)及它们的抑菌率(F)
Figure 7 The avtivity against F.graminearum of chitosan oligosaccharide a(A), chitosan oligosaccharide aminothiourea b(B), chitosan oligosaccharide aminothiourea Shiff base c(C), chitosan oligosaccharide aminothiourea shiff base Cu complex d(D), water as a blank control(E) and histogram of their inhibitory index(F)
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