超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)，是一种含金属蛋白质，具有铜、锌等活性中心[1]，别名肝蛋白，是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质[2]。人体不断地补充SOD，可以起到抗衰老的特殊效果[3]。SOD的表达及活性变化还与阿尔茨海默病(死亡率位居常见病第4位，又叫老年性痴呆)、帕金森病以及一些慢性炎症性疾病紧密相关[4]。铜锌SOD的突变可能导致家族性肌萎缩侧索硬化症[5]。目前，检测SOD的常用方法有分光光度法[6]、化学发光法[7]、电子自旋共振(ESR)光谱法[8]以及利用水溶性四唑盐检测SOD的新方法[9]，但是以上方法存在检测灵敏度较低、检测限较高、专一性不强等缺点[10]，因此提出一种检测SOD的新方法具有重要意义。
印迹聚合物(Imprinting Polymers，IPs)具有适应性强[11]、化学稳定性高[12]、对压力和温度极具耐受性等优点，近年来受到较大关注。分子印迹技术(Molecularly Imprinting Technology, MIT)是一种新型高效分离技术[13]，MIT是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术[14]。它通常采用以下方法实现：首先以具有适当功能基团的单体与模板分子结合形成单体-模板分子复合物[15]，然后再选择适当的交联剂使聚合物在空间排布和空间定向上固定下来[16]，最后用洗脱剂将模板分子洗脱，在高分子共聚物中留下一个与模板分子在空间结构上匹配，并含有与模板分子专一结合的功能基的三维空穴[17]，这个三维空穴可以选择性地重新与模板分子结合，即对模板分子具有专一性识别作用。IPs在临床分析[18]、医疗诊断[19-20]和模拟酶催化[21]等领域均具有广泛的应用[22-24]。
制备聚合物的方法有很多种，其中大部分属于自由基聚合[25]。“活性/可控”的原子转移自由基聚合(Atom Transfer Radical Polymerization，ATRP)能够对聚合物的端基、组成、结构和相对分子质量等进行很好的控制，是制备分子印迹聚合物(Molecularly-Imprinted Polymers，MIPs)的有效手段[26]。然而，常规ATRP方法用于蛋白质MIPs(PIPs)的制备有两个主要困难[27-28]：1)聚合所需低价态金属催化剂对空气等敏感，不易保存；2)催化剂对蛋白质等生物大分子具有一定的毒性，且常见脱除催化剂、配位剂等的后处理工艺比较复杂。因此，ATRP若想真正应用于PIPs的制备还需改进。当前，各种改进的ATRP方法被不断报道，尤其是2011年Science杂志报道的电化学调控的ATRP(Electrochemically-Mediated ATRP，eATRP)[29]。随着ATRP技术的发展，近年来蛋白质作为ATRP催化剂也有报道，例如，Silva等[30]在血红蛋白(hemoglobin，Hb)中加入抗坏血酸后，可以将Hb中Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)从而使Hb具有催化活性，成功进行了ATRP聚合。Fodor等[31]在漆酶中加入抗坏血酸钠作为还原剂将漆酶中Cu(Ⅱ)还原为Cu(Ⅰ)，成功地实现了漆酶催化的N-乙烯基咪唑的ATRP聚合。考虑到MIP、eATRP和蛋白质催化ATRP的优点，本课题组前期采用Hb既作为模板分子又作为催化剂，利用eATRP方法成功地制备了Hb印迹聚合物[32]，考虑到SOD具有与Hb类似的金属活性中心结构，本论文在前面工作的基础上，使用SOD既作为模板分子又作为催化剂进行eATRP反应制备蛋白质印迹聚合物(Protein-imprinted Polymers，PIPs)，该方法不需要过渡金属离子、具有制备简单、节约试剂、保护环境等优点。
CHI 660E型电化学工作站(上海辰华仪器公司)，Sartorius BS 210S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，KQ-50B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Smart-Q15型超纯水系统(上海和泰仪器有限公司)，PHS-3C型精密酸度计(上海雷磁分析仪器厂)，ESCALABTM 250Xi型X射线光电子能谱仪(XPS，ThermoFisher)。
L-半胱氨酸(L-cys)，分析纯，阿拉丁；铁氰化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、醋酸钠、冰醋酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；亚铁氰化钾、30%过氧化氢(H2O2)、N, N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司; 丙烯酰胺(AM)，分析纯，天津市光复精细化工研究所；氯金酸(HAuCl4)，分析纯，北京化工厂；2-溴异丁酰溴(BiBB, 98%)，分析纯，阿法埃莎(中国)化学有限公司；对羟基苯硫酚(4-HTP)，分析纯，Acros(日本)化学有限公司；溶菌酶(Lyz, MW=14.4×103)、血红蛋白(Hb, MW=65×103、肌红蛋白(Mb, MW=16.7×103)，分析纯，北京索莱宝科技有限公司；碳酸酐酶(CA, MW=29×103)、胃蛋白酶(PG, MW=35×103)，分析纯，源叶生物有限公司；超氧化物歧化酶(SOD, MW=34×103)，分析纯，西亚试剂；超纯水(电阻率＞18 MΩ·cm)。
以金盘电极(Φ=2 mm)或修饰电极作为工作电极，饱和甘汞电极(Saturated calomel electrode，SCE)和铂丝(Φ=0.5 mm×35 mm)分别作为参比电极和对电极，采用传统的三电极体系，在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl(0.1 mol/L pH=7.0磷酸盐缓冲溶液PBS)的溶液中进行循环伏安(CV)扫描，电势范围为-0.2~0.6 V(选择催化电极时电势范围为-0.4~0.6 V)，扫描速率为100 mV/s(选择催化电极时扫描速率为50 mV/s)，初始扫描方向为正扫；示差脉冲伏安法(DPV)电势范围为-0.2~0.6 V；计时电流法(i-t)初始电势为-0.9 V(聚合时电势为0.130 V)；XPS将IPs修饰在一定尺寸(约为1 cm×1 cm×0.1 cm)金片表面，进行XPS测试(MgKα射线为激发源，数据采用C1s结合能284.8 eV校正)。
将金盘电极依次以1.0、0.5和0.03 μm的Al2O3抛光粉打磨至表面平整光滑，于Piranha洗液(98%浓硫酸与30%过氧化氢体积比3：1。注意：该溶液氧化性和腐蚀性极强)中清洗20 min，以超纯水和无水乙醇各超声清洗15 min，在-0.1~1.2 V电势范围内对洁净金盘电极进行CV扫描活化25圈。
将抛光活化处理过的裸金电极在1 mmol/L的L-cys(由0.1 mol/L pH=7.0 PBS配制)溶液中浸泡24 h，取出电极并用超纯水冲洗电极表面5次左右以除去物理吸附的L-cys，得到Au/L-cys修饰电极，然后利用三电极系统，在5 mmol/L HAuCl4的溶液中，将Au/L-cys修饰电极在-0.9 V恒定电势下电沉积400 s，得到Au/L-cys/nanoAu修饰电极。
PIPs修饰金电极(Au/PIPs)的制备过程如图 1所示。首先将裸金电极浸泡在引发剂4-硫苯基-2-溴-2-甲基丙酸酯(4-mercaptophenyl 2-bromo-2-methylpropanoate, 4-HTP-Br)(引发剂浓度为1 mmol/L、溶剂为乙醇)溶液中24 h，以使引发剂自组装在金电极表面(引发剂的制备根据参考文献[33-34]，将0.5 g 4-HTP固体分散于15 mL二氯甲烷(CH2Cl2)中(用分子筛除水)，在冰浴下加入2.0 mL三乙胺，搅拌反应30 min后，逐滴加入0.5 mL BiBB，撤冰浴，在室温下反应24 h。将反应后的产物用超纯水清洗3次，最后将乙醚洗涤后得到的产品放在烘箱中50 ℃真空烘干过夜，制得4-HTP-Br引发剂)，作为双工作电极之一(基底电极，Au/4-HTP-Br)，Au/L-cys/nanoAu修饰电极作为另一工作电极(催化电极)，SCE为参比电极，铂丝为对电极，采用双工作电极系统，在以AM(0.1 mol/L)为功能单体(丙烯酰胺是蛋白质印迹聚合物常用功能单体[35-36])，MBA(0.1 mol/L)为交联剂，并含有4 g/L SOD的PBS(pH=7.0)溶液中，控制催化电极电势为0.13 V，利用催化电极将氧化型SOD(Cu(Ⅱ))还原为还原型SOD(Cu(Ⅰ))，催化AM、MBA在基底电极上进行eATRP聚合，得到包含模板分子SOD的聚合物修饰电极(Au/polymer)。最后，将Au/polymer浸泡在30%H2O2中2 h，除去聚合物中的SOD模板，然后用PBS溶液冲洗3次，制备SOD蛋白质印迹聚合物修饰的金电极(Au/PIPs)。
采用传统的ATRP方法，以过硫酸铵为引发剂制备非印迹聚合物修饰的金电极(Au/NIPs)。
利用DPV方法研究Au/PIPs电化学识别性能。在每次测试之前，在室温下将Au/PIPs电极在SOD溶液中孵育5 min，再用PBS溶液冲洗3次。采用三电极体系，在含有5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl的PBS溶液中Au/PIPs为工作电极，在-0.1~0.4 V的电势范围进行DPV扫描，将空白溶液(0.1 mol/L pH=7.0 PBS)峰电流与Au/PIPs峰电流差值与浓度作图测定SOD。
图 2为Au/PIPs制备过程中每一阶段修饰金电极在[Fe(CN)6]3-/4-探针溶液中的CV曲线，图 2曲线a是裸金电极CV曲线，在0.2 V附近有一对可逆的氧化还原峰; 图 2曲线b是引发剂修饰金电极(Au/4-HTP-Br)的CV曲线，其峰电流低于图 2曲线a，这是因为自组装引发剂阻碍探针离子到达电极表面。由图 2曲线c可知，当丙烯酰胺等在电极表面聚合后，聚合物修饰电极(Au/polymer)的峰值电流明显降低，表明电极表面聚合物膜厚度增加，阻碍探针离子到达电极表面，导致峰电流降低。由图 2曲线d可知，当SOD从聚合物修饰电极洗脱后，Au/PIPs氧化还原峰电流增加，这归因于SOD的洗脱后形成印迹空隙。
a.bare Au; b.Au/4-HTP-Br; c.Au/polymer; d.Au/PIPs
采用XPS研究了SOD洗脱前金电极表面修饰的聚合物化学组成，结果如图 3所示，图 3中Au4p3、O1s、N1s、Au4d3、Au4d5、C1s、Au4f和Br3d的特征峰分别在547、531.59、399.75、354、336、284.26、83.7和70.4 eV处，原子活性Br暴露在表面意味着成功实施ATRP，图 3的插图是在931.86和1033.65 eV下Cu2p和Zn2p的XPS[37]，由于Cu、Zn均来自SOD，因此Cu、Zn的光谱表明聚合物中存在SOD。
由CV和XPS的数据可知，SOD催化的eATRP在Au上成功合成了聚合物和PIPs。
eATRP方法的关键步骤是SOD中的Cu(Ⅱ)的还原。根据文献[38]，Au/L-cys/nanoAu修饰电极对SOD有良好的电化学还原活性。图 4为Au/L-cys/nanoAu修饰电极在空白溶液及其4 g/L SOD溶液中的CV曲线，由图 4中CV曲线对比可以看出，SOD在约0.130 V电势下出现一个明显的还原峰，说明Au/L-cys/nanoAu修饰电极对SOD有良好的电化学还原活性，因此，使用Au/L-cys/nanoAu修饰电极作为eATRP过程的催化电极。
通过CV和DPV法考察了聚合电势、聚合时间和SOD浓度对电极聚合过程的影响(图 5)。在含有4 mL 0.1 mol/L AM、6 mL 0.1 mol/L MBA和2 mL 4 g/L SOD混合溶液中进行eATRP聚合，选择5根引发剂修饰电极(Au/4-HTP-Br)作为基底电极，其聚合电势分别为0.170、0.150、0.130、0.110和0.090 V，恒电势聚合1.5 h，得到Au/polymer修饰电极。通过CV法测得的[Fe(CN)6]3-/4-探针溶液中聚合前(Au/4-HTP-Br电极)后(Au/polymer)峰电流的变化和聚合电势作图(图 5A)，可以看出，在0.130 V的聚合电势下峰电流变化最大，最后我们选择了0.130 V为最佳聚合电势。图 5B为Au/polymer修饰电极CV曲线的峰电流与聚合时间之间变化曲线。由图 5B可以看出，随着时间增加，峰值电流急剧下降，在1.5~2 h，峰值电流变化趋稳，因此选择最佳聚合时间为1.5 h。图 5C为上述优化条件下SOD质量浓度对聚合的影响。通过DPV测量Au/PIPs检测SOD的灵敏度(标准曲线的斜率)来选择聚合时SOD质量浓度。如图 5C所示，在电极表面eATRP聚合时，将SOD的质量浓度从1.0 g/L增加到8.0 g/L，Au/PIPs的灵敏度在SOD质量浓度为4 g/L时出现最大值。过多的SOD(4.0~8.0 g/L)导致其灵敏度下降，这可能是因为当蛋白质太多时，它们可能彼此接近或以聚集体形式存在，这将导致不理想的印迹腔体，PIPs捕获模板分子的效果显著降低。因此，我们选择最佳的SOD质量浓度为4 g/L。
Peak current difference of Au/polymer and Au/4-HTP-Br(A) and peak current of Au/polymer(B) measured by CV in [Fe(CN)6]3-/4- versus polymerization potential(A) and time(B), respectively. Sensitivity of DPV determination of SOD on Au/PIPs versus SOD mass concentration in polymerization
用Au/PIPs通过DPV来检测SOD。图 6A为Au/PIPs检测一系列不同质量浓度SOD的DPV曲线。由图 6A可以看出，DPV峰电流随着SOD质量浓度的增加而降低，这可能是由于SOD重新结合到印迹受体上，阻止了探针离子的穿透，导致峰电流的降低。随着SOD浓度逐渐升高，峰电流逐渐下降，峰电流下降(信号响应，ΔI，相对于空白溶液)与SOD质量浓度对数(标准曲线)的关系如图 6B所示。从图 6B中可以看出，Au/PIPs的线性范围为1.0×10-7~100 mg/L。线性回归方程为ΔI(μA)=0.6563lg ρ(mg/L)+35.386，相关系数为0.995。根据标准曲线可计算出SOD的检测限为6.8×10-8 mg/L(S/N=3)。将传感器与其他检测SOD的方法(见表 1)进行比较，可以看出本文中的SOD传感器具有更高的灵敏度和更低的检测限。
A.ρ(SOD)/(mg·L-1) for a~k:0, 1.0×10-7, 1.0×10-6, 1.0×10-5, 1.0×10-4, 1.0×10-3, 0.01, :0.1, 1.0, 10, 100
下载:
导出CSV
| Title | Method | Linear range/ (mg·L-1) |
Detection limit/ (mg·L-1) |
Ref. |
| Determination of Superoxide Dismutase and SOD-Mimetic Activities by a Chemical System:Co2/H2O2/Lucigenin | Chemiluminescence | 1.9~9.2 | 6.4×10-1 | [39] |
| Enzyme Immunoassay for Cuprozinc-Superoxide Dismutase in Whole Blood and Urine During Head down Bed Rest | Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay(ELISA) | 5.0×10-5~5.0×10-3 | 1.0×10-4 | [40] |
| Interaction with Copper-Zinc Superoxide Dismutase and Amine Small Molecules | spectrophotometry | 5.5×10-2~38.7 | 5.5×10-3 | [41] |
| Preparation of Molecularly Imprinted Polymers by SOD-catalyzed eATRP | differential pulse voltammetry(DPV) | 1.0×10-7~1.0×102 | 6.8×10-8 | This paper |
| a.For the sake of comparison, the data unit is a unified calculation. | ||||
为了评估印迹聚合物修饰电极的选择性，将CA、Hb、Lyz、PG和Mb作为本实验的干扰物。通过DPV测定在每种蛋白质(质量浓度均为1 g/L)中孵育后Au/PIPs和Au/NIPs上[FeCN)6]3-/4-的峰电流差值(图 7)，可以看出，Au/PIPs电极对SOD的ΔI值为39.9 μA，分别为CA、Hb、Lyz、PG和Mb的5.8、12.6、14.8、9.2和17.2倍。结果表明，本实验中Au/PIPs对靶蛋白SOD具有较好的选择性。电极选择性也可以通过印迹因子(β)来评估，用β=ΔI(MIP)/ΔI(NIP)计算β，其中ΔI(NIP)是Au/PIPs对干扰物的响应，ΔI(MIP)是Au/PIPs对SOD的响应。如图 7所示，计算SOD、CA、Hb、Lyz、PG和Mb的β值分别为6.1、1.8、2.2、1.9、2.3和2.3。以上结果表明，Au/PIPs对靶蛋白SOD具有良好的选择性。
为了更好的评估Au/PIPs的选择性，将竞争物CA、Hb、Lyz、PG和Mb与SOD溶液混合，采用DPV方法测定在混合溶液中孵育后Au/PIPs和Au/NIPs上[FeCN)6]3-/4-的峰电流(图 8)，可以看出，Au/PIPs电极对SOD的ΔI值为38.7 μA，是混合溶液的1.02倍，可以知道，竞争物影响不大。结果表明，在有竞争物存在时Au/PIPs修饰电极对靶蛋白SOD具有良好的选择性。由此可以得出，Au/PIPs修饰电极对SOD具有良好的选择性。
Mass concentration of CA, Hb, Lyz, PG, Mb and SOD is 1 g/L for each. Blank is 0.1 mol/L KCl pH=7.0 PBS
Au/PIPs的重复性通过用相同的电极反复测量5次SOD(100 mg/L)来检测。其电极的相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)为3.5%，表明Au/PIPs具有良好的重复性。在相同的条件下制备5根Au/PIPs并用于检测100 mg/L的SOD以确定其一致性，其RSD为3.3%，表明Au/PIPs具有良好的一致性。
本文检测的实际样品是SOD胶囊，本文选择了直接测定的方法，在实验中我们用分析天平准确称取SOD胶囊0.001 g，溶于100 mL PBS(pH=7.0 0.1 mol/L)中，然后逐级稀释得到原样质量浓度为1.00×10-4 mg/L的溶液，溶解后将其放入100 mL容量瓶中。取原样溶液10 mL，分别加入SOD标样(质量浓度为1.00×10-1 mg/L)10、20、50 μL，配成溶液，进行DPV检测。根据线性回归方程ΔI(μA)=0.6563lg ρ(mg/L)+35.386可以得出检测质量浓度和加标回收率以及相对标准偏差，具体数据见表 2。
下载:
导出CSV
| Analyte | 104Mass concentration/(mg·L-1) | 104Added/(mg·L-1) | 104Found/(mg·L-1) | Recovery/% | RSD/% |
| 1.00 | 1.97 | 97.1 | 3.09 | ||
| SOD | 1.00 | 2.00 | 2.95 | 95.1 | 3.13 |
| 5.00 | 6.04 | 104.5 | 3.71 |
为了考察制备电极的应用前景，我们利用所制备的聚合物修饰电极对实际样品SOD胶囊进行分析。采用加标回收法利用制备的印迹聚合物修饰电极对实际样品进行分析，相关结果列于表 2中。当加入SOD标准溶液10 μL时，其检测质量浓度为1.97×10-4 mg/L，回收率为97.1%，RSD为3.09%。当加入SOD标准溶液20 μL时，其检测质量浓度为2.95×10-4 mg/L，回收率为95.1%，RSD为3.13%。当加入SOD标准溶液50 μL时，其检测质量浓度为6.04×10-4 mg/L，回收率为104.5%，RSD为3.71%。从表 2中的数据可以得出，印迹聚合物修饰电极对样品检测的加标回收率在80%~120%之间，相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)小于5%，表明印迹聚合物修饰电极可以用于实际样品的检测。
超氧化物歧化酶(SOD)印迹聚合物(IPs)成功地通过在金电极表面SOD催化电化学诱导的原子转移自由基聚合(eATRP)制备。通过在L-半胱氨酸修饰的金电极上沉积金纳米颗粒来制备eATRP的催化电极，制备简单，生物相容好且无毒，SOD蛋白质印迹聚合物(PIPs)可用来检测SOD，其线性范围为1.0×10-7~1.0×102 mg/L，检出限为6.8×10-8 mg/L(S/N=3)，优于其他类似的传感器。总之，本论文的工作对制备PIPs，蛋白质催化的eATRP和含金属蛋白质的敏感检测具有重要意义。
Wang Q, Yuan Z, Wu H. Molecular Characterization of a Manganese Superoxide Dismutase and Copper/Zinc Superoxide Dismutase from the Mussel Mytilus galloprovincialis[J]. Fish Shellfish Immunol, 2013, 34(5): 1345-1351. doi: 10.1016/j.fsi.2013.01.011
Olson K R, Gao Y, Arif F. Metabolism of Hydrogen Sulfide(H2S) and Production of Reactive Sulfur Species(RSS) by Superoxide Dismutase[J]. Redox Biol, 2018, (15): 74-85.
Healy E F, Cervantes L. An in Silico Study of the Effect of SOD1 Electrostatic Loop Dynamics Amyloid-Like Filament Formation[J]. Eur Biophys J, 2016, 45(8): 1-7.
Zhang L, Er J C, Jiang H. A Highly Selective Fluorogenic Probe for the Detection and In vivo Imaging of Cu/Zn Superoxide Dismutase[J]. Chem Commun, 2016, 52(58): 9093-9096. doi: 10.1039/C6CC00095A
Perry J J, Shin D S, Getzoff E D. The Structural Biochemistry of the Superoxide Dismutases[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1804(2): 245-262. doi: 10.1016/j.bbapap.2009.11.004
Liu H, Liu L, Qin C. Mitochondrial Damage and Changes of Malondidehyde and Superoxide Dismutase in Acute Alcoholic Liver[J]. J Hubei Eng Univ, 2013, 33(3): 53-55.
Corbisier P, Houbion A, Remacle J. A New Technique for Highly Sensitive Detection of Superoxide Dismutase Activity by Chemiluminescence[J]. Anal Biochem, 1987, 164(1): 240-247.
Marcocci L, Mavelli I, Giulio AD. Room Temperature Electron Spin Resonance of Superoxide Dismutase-Loaded Liposomes and Erythrocytes. A Direct Approach to the Interaction of O2- with Cells[J]. Biochim Biophys Acta, 1989, 979(1): 99-104. doi: 10.1016/0005-2736(89)90528-2
Ukeda H, Kawana D, Maeda S. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-Soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase[J]. J Agric Chem Soc Jpn, 1999, 63(3): 485-488.
徐大光, 阴志刚, 侯晓强. 紫外-可见分光光度法在药物分析中的应用及进展[J]. 中国医学物理学杂志, 2006,23,(6): 432-433. doi: 10.3969/j.issn.1005-202X.2006.06.010XU Daguang, YIN Zhigang, HOU Xiaoqiang. Application and Progress of Ultraviolet-Visible Spectrophotometry in Drug Analysis[J]. Chinese J Med Phys, 2006, 23(6): 432-433. doi: 10.3969/j.issn.1005-202X.2006.06.010
Wang X, Dong S, Bai Q. Preparation of Lysozyme Molecularly Imprinted Polymers and Purification of Lysozyme from Egg White[J]. Biomed Chromatogr, 2014, 28(6): 907-912. doi: 10.1002/bmc.3207
Chen L, Wang X, Lu W. Molecular Imprinting:Perspectives and Applications[J]. Chem Soc Rev, 2016, 45(8): 2137-2211. doi: 10.1039/C6CS00061D
Yang L, Zhi L, Song C J. Evaluation the Separation Efficiency of Galangin Molecular Imprinted Polymers by HPLC[J]. J Chengde Med College, 2015, 132(3): 190-192.
Yang Y, Wang X, Fang G. Electrochemiluminescence Analysis Based on Molecular Imprinting Technique[J]. Prog Chem, 2016, 28(9): 1351-1362.
Dan R, Wang Y, Du L. The Synthesis of Molecular Imprinted Chitosan-Gels Copolymerized with Multiform Functional Monomers at Three Different Temperatures and the Recognition for the Template Ovalbumin[J]. Analyst, 2013, 138(12): 3433-3443. doi: 10.1039/c3an36930g
Erdogan-Haug B, Kavanagh M A, Aloshyna L M, et al. Crosslinkable Syrup Copolymers with Aminoalkyl (meth)Acryloyl Solvent Monomers: US, EP2556128.B1[P]. 2014-06-04.
姜吉刚. 分子印迹技术在药物分析中的研究与应用[J]. 山东师范大学, 2003. JIANG Jigang. Research and Application of Molecular Imprinting Technology in Drug Analysis[J]. Shandong Normal Univ, 2003, : .
Wu W T, Shen J, Li Y X. Specific Glucose-to-SPR Signal Transduction at Physiological pH by Molecularly Imprinted Responsive Hybrid Microgels[J]. Biomaterials, 2012, 33(29): 7115-7125. doi: 10.1016/j.biomaterials.2012.06.031
Turner N W, Liu X, Piletsky S A. Recognition of Conformational Changes in Lactoglobulin by Molecularly Imprinted Thin Films[J]. Biomacromolecules, 2007, 8(9): 2781-2787.
Li H, Wang L. Highly Selective Detection of Polycyclic Aromatic Hydrocarbonsusing Multifunctional Magnetic-Luminescent Molecularly Imprinted Polymers[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2013, 5(21): 10502-10509. doi: 10.1021/am4020605
Wulff G, Liu J Q. Design of Biomimetic Catalysts by Molecular Imprinting in Synthetic Polymers:The Role of Transition State Stabilization[J]. Acc Chem Res, 2012, 45(2): 239-247. doi: 10.1021/ar200146m
Panagiotopoulou M, Beyazit S, Nestora S. Initiator-Free Synthesis of Molecularly Imprinted Polymers by Polymerization of Self-initiated Monomers[J]. Polymer, 2015, 66: 43-51. doi: 10.1016/j.polymer.2015.04.012
Tan L, Kang C C, Xu S Y. Selective Room Temperature Phosphorescence Sensing of Target Protein Using Mn-Doped ZnS QDs-Embedded Molecularly Imprinted Polymer[J]. Biosens Bioelectron, 2013, 48(19): 216-223.
Zhang R, Xu S, Luo J. Molecularly Imprinted Photo-sensitive Polyglutamic Acid Nanoparticles for Electrochemical Sensing of Hemoglobin[J]. Microchim Acta, 2015, 182(1/2): 175-183.
毛程, 韦兆水, 杜俊涛. 丙烯酰胺聚合物自由基聚合引发体系研究进展[J]. 广东化工, 2013,40,(14): 126-127. doi: 10.3969/j.issn.1007-1865.2013.14.065MAO Cheng, WEI Zhaoshui, DU Juntao. Research Progress of Acrylamide Polymer Radical Polymerization Initiation System[J]. Guangdong Chem Ind, 2013, 40(14): 126-127. doi: 10.3969/j.issn.1007-1865.2013.14.065
Qiu X, Wu Y, Chen D. Fabrication of Novel Stir Bar Sorptive Extraction Coating Based on Magnetic Molecularly Imprinted Polymer Through Atom Transfer Radical Polymerization for Trace Analysis of Estrogens in Milk[J]. J Nanosci Nanotechnol, 2016, 16(12): 12374-12381. doi: 10.1166/jnn.2016.12968
Sigg S J, Seidi F, Renggli K. Horseradish Peroxidase as a Catalyst for Atom Transfer Radical Polymerization[J]. Macromol Rapid Commun, 2011, 32(21): 1710-1715. doi: 10.1002/marc.201100349
Shanmugam S, Boyer C. Polymer Synthesis:Organic Photocatalysts for Cleaner Polymer Synthesis[J]. Science, 2016, 352(6289): 1053-1054. doi: 10.1126/science.aaf7465
Magenau A J, Strandwitz N C, Gennaro A. Electrochemically Mediated Atom Transfer Radical Polymerization[J]. Science, 2011, 332(6025): 81-84. doi: 10.1126/science.1202357
Silva T B, Spulber M, Kocik M K. Hemoglobin and Red Blood Cells Catalyze Atom Transfer Radical Polymerization[J]. Biomacromol, 2013, 14(8): 2703-2712. doi: 10.1021/bm400556x
Fodor C, Gajewska B, Rifaie-Graham O. Laccase-catalyzed Controlled Radical Polymerization of N-Vinylimidazole[J]. Polym Chem, 2016, 7(43): 6617-6625.
孙越, 杜洪莹, 兰玉廷, 等.自催化ATRP制备血红蛋白印迹聚合物的方法: 中国, 201510410654.6[P]. 2015-11-04.SUN Yue, DU Hongying, LAN Yuting, et al. Preparation of Hemoglobin Imprinted Polymer by Autocatalytic ATRP: CN, 201510410654.6[P]. 2015-11-04(in Chinese).
Sun Y, Du H, Lan Y. Preparation of Hemoglobin(Hb) Imprinted Polymer by Hb Catalyzed eATRP and Its Application in Biosensor[J]. Biosens Bioelectron, 2016, 77: 894-900. doi: 10.1016/j.bios.2015.10.067
Sun Y, Du H Y, Deng Y. Preparation of Polyacrylamide via Surface-Initiated Electrochemical-Mediated Atom Transfer Radical Polymerization(SI-eATRP) for Pb2+ Sensing[J]. J Solid State Electrochem, 2016, 20(1): 105-113.
Wang C L, Fen M A, Zheng H Y. Synthesis of Salicylic Acid Molecularly Imprinted Polymer Using Acrylamide as a Functional Monomer[J]. Fine Chem, 2007, 24(8): 729-728.
Chen F F, Xie X Y, Shi Y P. Preparation of Magnetic Molecularly Imprinted Polymer for Selective Recognition of Resveratrol in Wine[J]. J Chromatogr A, 2013, 1300(14): 112-118.
刘芬, 赵志娟, 邱丽美. XPS光电子峰和俄歇电子峰峰位表[J]. 分析测试技术与仪器, 2009,15,(1): 1-17. doi: 10.3969/j.issn.1006-3757.2009.01.001LIU Fen, ZHAO Zhijuan, QIU Limei. XPS Photoelectron Peak and Auger Electron Peak Position Table[J]. Anal Test Technol Instrum, 2009, 15(1): 1-17. doi: 10.3969/j.issn.1006-3757.2009.01.001
何晓英, 魏胤, 宋桃. 超氧化物歧化酶在纳米金/L-半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为[J]. 化学研究与应用, 2012,24,(8): 1192-1196. doi: 10.3969/j.issn.1004-1656.2012.08.005HE Xiaoying, WEI Wei, SONG Tao. Electrochemical Behavior of Superoxide Dismutase on the Gold Nanoparticles/L-Cysteine/Au Modified Electrode[J]. Chem Res Appl, 2012, 24(8): 1192-1196. doi: 10.3969/j.issn.1004-1656.2012.08.005
Zhidkova T V, Proskurnina E V, Parfenov E A. Determination of Superoxide Dismutase and SOD-Mimetic Activities by a Chemical System:Co2/H2O2/Lucigenin[J]. Anal Bioanal Chem, 2011, 401(1): 381-386. doi: 10.1007/s00216-011-5070-8
杨唐斌, 刘振秀, 万玉民. 头低位-60卧床中血、尿中Cu, Zn-SOD的酶免疫法测定[J]. 航天医学与医学工程, 1998(3): 162-166. YANG Tangbin, LIU Zhenxiu, WAN Yumin. Enzyme Immunoassay for Cuprozinc-Superoxide Dismutase in Whole Blood and Urine During Head down Bed Rest[J]. Space Med Med Eng, 1998, (3): 162-166.
魏薇.光学探针与铜锌超氧化物歧化酶、胺类小分子相互作用的研究及应用[D].济南: 山东师范大学, 2007. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10445-2007144348.htmWEI Wei. Research and Application of Optical Probes Interaction with Copper-Zinc Superoxide Dismutase and Amine Small Molecules[D]. Ji'nan: Shandong Normal University, 2007(in Chinese). http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10445-2007144348.htm
图 1 超氧化物歧化酶催化-电化学调控的原子转移自由基聚合法制备蛋白质印迹聚合物修饰金电极流程图
Figure 1 Schematic diagram of preparing protein-imprinted polymer(PIP) modified Au electrode through superoxide dismutase(SOD)-catalyzed electrochemically-mediated atom transfer radical polymerization(eATRP)
图 2 各修饰电极在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl(pH=7.0 PBS)溶液中的CV曲线
Figure 2 CV curves of the stepwise modified electrodes in PBS(pH=7.0) containing 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4- and 0.1 mol/L KCl at scan rate of 100 mV/s
a.bare Au; b.Au/4-HTP-Br; c.Au/polymer; d.Au/PIPs
图 3 金表面聚合物的XPS谱图(插图为Zn2p和Cu2p谱图)
Figure 3 XPS spectrum of the polymer on Au(Insets: spectra of Zn2p and Cu2p)
图 4 金/L-半胱氨酸/纳米金修饰电极在PBS空白溶液(a)及其4 g/L SOD(b)溶液中的CV曲线
Figure 4 CV curves of gold/L-cysteine/nanoAu modified electrode in blank PBS solution(a) and its 4 g/L SOD solution (b) at scan rate of 50 mV/s, pH=7.0
图 5 在[Fe(CN)6]3-/4-中Au/polymer和Au/4-HTP-Br电极CV峰电流差对聚合电势(A)以及Au/polymer电极峰电流对聚合时间(B)曲线；Au/PIPs电极DPV检测SOD灵敏度对聚合时SOD质量浓度曲线(C)
Figure 5 Effect of polymerization potential(A), polymerization time(B) and SOD concentration(C) on polymerization
Peak current difference of Au/polymer and Au/4-HTP-Br(A) and peak current of Au/polymer(B) measured by CV in [Fe(CN)6]3-/4- versus polymerization potential(A) and time(B), respectively. Sensitivity of DPV determination of SOD on Au/PIPs versus SOD mass concentration in polymerization
图 6 印迹聚合物修饰电极检测SOD的DPV曲线(A)及印迹聚合物修饰电极检测SOD的工作曲线(B)
Figure 6 DPV curves of PIPs-modified electrode after rebinding with SOD(A) and the calibration plot of PIPs-modified electrode(B)
A.ρ(SOD)/(mg·L-1) for a~k:0, 1.0×10-7, 1.0×10-6, 1.0×10-5, 1.0×10-4, 1.0×10-3, 0.01, :0.1, 1.0, 10, 100
图 8 Au/PIPs(A, C)和Au/NIPs(B, D)电极在SOD(A, B)及其与CA、Hb、Lyz、PG和Mb混合溶液(C, D)中孵育后，在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl的PBS溶液中的DPV曲线
Figure 8 DPV curves of Au/PIPs(A, C) and Au/NIPs(B, D) electrodes in 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl+PBS after incubating in SOD(A, B) solution and the mixture of CA, Hb, Lyz, PG and Mb(C, D)
Mass concentration of CA, Hb, Lyz, PG, Mb and SOD is 1 g/L for each. Blank is 0.1 mol/L KCl pH=7.0 PBS
表 1 Au/PIPs修饰电极与其他报道方法检测SOD的线性响应范围和检测的比较a
Table 1. Comparison of the linear range and the detection limit between the proposed and previous reported Au/PIPs modified electrode for SODa
| Title | Method | Linear range/ (mg·L-1) |
Detection limit/ (mg·L-1) |
Ref. |
| Determination of Superoxide Dismutase and SOD-Mimetic Activities by a Chemical System:Co2/H2O2/Lucigenin | Chemiluminescence | 1.9~9.2 | 6.4×10-1 | [39] |
| Enzyme Immunoassay for Cuprozinc-Superoxide Dismutase in Whole Blood and Urine During Head down Bed Rest | Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay(ELISA) | 5.0×10-5~5.0×10-3 | 1.0×10-4 | [40] |
| Interaction with Copper-Zinc Superoxide Dismutase and Amine Small Molecules | spectrophotometry | 5.5×10-2~38.7 | 5.5×10-3 | [41] |
| Preparation of Molecularly Imprinted Polymers by SOD-catalyzed eATRP | differential pulse voltammetry(DPV) | 1.0×10-7~1.0×102 | 6.8×10-8 | This paper |
| a.For the sake of comparison, the data unit is a unified calculation. | ||||
下载: 导出CSV
表 2 SOD实际样品检测
Table 2. Determination of SOD in real samples(n=3)
| Analyte | 104Mass concentration/(mg·L-1) | 104Added/(mg·L-1) | 104Found/(mg·L-1) | Recovery/% | RSD/% |
| 1.00 | 1.97 | 97.1 | 3.09 | ||
| SOD | 1.00 | 2.00 | 2.95 | 95.1 | 3.13 |
| 5.00 | 6.04 | 104.5 | 3.71 |
下载: 导出CSV
扫一扫看文章
扫一扫关注我们
下载: