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电化学发光传感器在农业传感领域中的研究进展

张家一 ,  罗莉君 ,  刘晓红 ,  李丽波 ,  成亮 ,  曹大威 ,  由天艳

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引用本文: 张家一, 罗莉君, 刘晓红, 李丽波, 成亮, 曹大威, 由天艳. 电化学发光传感器在农业传感领域中的研究进展[J]. 应用化学, 2019, 36(4): 379-391. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2019.04.180417 shu
Citation:  ZHANG Jiayi, LUO Lijun, LIU Xiaohong, LI Libo, CHENG Liang, CAO Dawei, YOU Tianyan. Research Progress of Electrochemiluminescence Sensors in the Field of Agricultural Sensing[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 2019, 36(4): 379-391. doi: 10.11944/j.issn.1000-0518.2019.04.180417 shu

电化学发光传感器在农业传感领域中的研究进展

  • a.

    江苏大学农业装备工程学院, 现代农业装备与技术教育部重点实验室 江苏 镇江 212013

  • b.

    江苏大学环境与安全工程学院 江苏 镇江 212013

  • c.

    江苏大学理学院 江苏 镇江 212013

    • 通讯作者: 李丽波, 讲师, Tel:0511-88982992, E-mail:lbli@ujs.edu.cn, 研究方向:电化学/电化学发光分析技术在农业传感中的应用; 由天艳, 教授, Tel/Fax:0511-88982992, E-mail:youty@ujs.edu.cn, 研究方向:电化学/电化学发光分析技术在农业传感中的应用
  • 基金项目:

    国家自然科学基金（21675065）、青年基金（61801195）和中国博士后科学基金（2018M632238）项目资助

摘要: 基于电化学发光（ECL）分析法构建的电化学发光传感器具有灵敏度高、背景信号低、操作简单的优点，因此，它在农业、工业、环境、临床和食品等领域具有广泛的应用前景。本文主要综述了电化学发光传感器检测农药残留和真菌毒素的应用及其相应的检测性能，分析了电化学发光传感器在农业传感领域的研究现状，并阐述了未来电化学发光传感器的发展趋势。

English

  • 农业是提供人类所需食物的基础产业，农业生产问题也一直深受世界各国关注。中国不仅是一个农业大国，也是一个粮食进口大国。我国人口众多，粮食品种发展不均衡，有些品种供不应求且生产成本较高[1]，所以提高农作物产量并确保其质量，对我国农业及经济的发展具有重要意义。目前，我国农业生产过程中存在的污染问题主要包括两个方面：1)农药的不合理使用：虽然农药可以提高农作物的产量[2]，但不合理使用会破坏土壤的结构、污染水资源、破坏生态环境，甚至导致农作物产量减少、质量下降[3]；同时长期接触含有农药残留的农产品会导致人内分泌紊乱[4]、损害中枢神经系统[5]，甚至中毒死亡。虽然国家已经制定了相应的规章制度对农药的使用进行限制，但是因残留农药中毒的事件依然屡有发生。2)农作物自身产生的真菌毒素：农作物在存储、加工和贮运等过程中均极易产生一些真菌毒素，这些毒素具有致癌和致畸等毒性[6]，且毒性持久，一旦进入食物和饲料中，很难去除[7]。真菌毒素进入水体会导致水资源受到污染；真菌毒素残留在食物中，经食物链进入人体后，会严重危害人类健康。农业污染问题，不仅危害到中国的生态安全和农产品质量安全，同时它还制约农业的可持续发展，造成巨大的经济损失[8]。及时、准确地对土壤、水和农产品进行安全检测是保障中国农业安全的重要环节。

    目前，对农药残留和真菌毒素的检测方法有很多，主要有气相色谱-质谱法[9-10]、液相色谱-质谱法等[11-13]。这些方法灵敏、精确，但是操作要求高、仪器价格昂贵和检测成本较高[14-17]。相对而言，电化学、电化学发光(ECL)、比色等方法操作简单，成本低[18-20]。其中ECL因其背景干扰低、灵敏度高和检测范围宽等特点引起人们广泛的关注[21-26]，在农业、工业、环境和食品等领域具有良好的应用前景。

    本文主要综述了近年来ECL在农业生产中农药残留检测和农作物及农产品中真菌毒素检测方面的应用，并对其发展前景进行了展望。

    1.   电化学发光法(ECL)

    ECL是一种将电能转化为辐射能的方法，其发光机理主要是前驱体在电极表面反应产生中间体，这些中间体在一定条件下形成激发态，激发态物质返回到基态的过程，伴随着光的产生[27]。

    1.1   ECL的主要体系

    根据反应的类型，ECL体系可以分为3类：离子湮灭ECL[28]、共反应物ECL[29]和阴极ECL[30]。

    根据发光试剂的种类，ECL体系主要分为3类[21]：无机化合物ECL体系、有机化合物ECL体系和半导体纳米粒子ECL体系。无机化合物ECL体系的发光体主要为金属配合物，典型的发光体代表是吡啶钌配合物[29]；有机物化合物ECL体系的发光体包含多环芳香烃类、叮酯类和鲁米诺为代表的酰肼类等[31-33]；新发展起来的半导体纳米粒子ECL体系主要是指以量子点为发光分子的体系[34]。本文主要涉及的ECL体系有吡啶钌配合物、鲁米诺和量子点等，下面简单介绍一下相关机理。

    吡啶钌配合物ECL体系中，三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)是一种典型的ECL发光材料[29, 35-36]，具有可循环利用、发光效率高等特点[37]。我们以研究和应用较广的三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)-三丙胺(TPA)体系为例，反应机理如式(1)~(4)[36]所示：

    ${\rm{Ru}}\left( {{\rm{bpy}}} \right)_3^{2 + } - {{\rm{e}}^ - } \to {\rm{Ru}}\left( {{\rm{bpy}}} \right)_3^{3 + }$

    		(1)

    ${\rm{TPA}} - {{\rm{e}}^ - } \to {\rm{TP}}{{\rm{A}}^{ \cdot + }} \to {\rm{TP}}{{\rm{A}}^ \cdot } + {{\rm{H}}^ + }$

    		(2)

    ${\rm{Ru}}\left( {{\rm{bpy}}} \right)_3^{3 + } + {\rm{TP}}{{\rm{A}}^\cdot} \to {\rm{Ru}}\left( {{\rm{bpy}}} \right)_3^{2 + *} + {\rm{products}}$

    		(3)

    ${\rm{Ru}}\left( {{\rm{bpy}}} \right)_3^{2 + *} \to {\rm{Ru}}\left( {{\rm{bpy}}} \right)_3^{2 + } + hv$

    		(4)

    Ru(bpy)32+在电极表面氧化成Ru(bpy)33+(反应(1))，同时，TPA在电极表面发生氧化反应后脱质子形成TPA中间态(反应(2))，然后Ru(bpy)33+与TPA的中间态发生电子转移，形成激发态的Ru(bpy)32+*(反应(3))，激发态跃迁回基态过程中伴随着光信号的产生(反应(4))。

    鲁米诺发光体具有无毒、成本低、氧化电势低和发光效率高等特性[38]，过氧化氢(H2O2)是鲁米诺常用的共反应物，其反应机理如Scheme 1所示[33]。

    Scheme 1

    Scheme 1.  ECL mechanism of luminol reaction with H2O2[33]
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    鲁米诺在碱性溶液中脱质子形成阴离子，可进行电化学氧化生成中间体，中间体在共反应物H2O2存在下进一步电氧化，产生激发态3-氨基邻苯二甲酸酯，3-氨基邻苯二甲酸酯在425 nm处产生特征性的“鲁米诺”发光[27]。

    量子点因其独特的ECL性能、低毒性和良好的生物相容性成为较为新型的ECL体系之一。硫化锌量子点-过硫酸钾(ZnS QDs-K2S2O8)这一典型体系的反应机理如式(5)~(8)[39]所示：

    ${\rm{ZnS}}\;{\rm{QDs}} + {{\rm{e}}^ - } \to {\rm{ZnS}}\;{\rm{QD}}{{\rm{s}}^{\cdot - }}$

    		(5)

    ${{\rm{S}}_2}{\rm{O}}_8^{2 - } + {{\rm{e}}^ - } \to {\rm{SO}}_4^{2 - } + {\rm{SO}}_4^{\cdot - }$

    		(6)

    ${\rm{ZnS}}\;{\rm{QD}}{{\rm{s}}^{\cdot - }} + {\rm{SO}}_4^{\cdot - } \to {\rm{ZnS}}\;{\rm{QD}}{{\rm{s}}^*} + {\rm{SO}}_4^{2 - }$

    		(7)

    ${\rm{ZnS}}\;{\rm{QD}}{{\rm{s}}^*} \to {\rm{ZnS}}\;{\rm{QDs}} + h\nu $

    		(8)

    ZnS QDs在电极表面被还原生成ZnS QDs·-(反应(5))，S4O82-被还原成具有强氧化性的SO4·-(反应(6))，ZnS QDs·-与SO4·-反应生成激发态的ZnS QDs*(反应(7))，激发态回到基态过程中，产生发光信号(反应(8))。

    2.   ECL传感器在农业传感领域中的应用

    由于ECL自身的优点，基于ECL构建的传感器在实现农作物、农产品和水中的农药以及真菌毒素检测方面得到了广泛的应用，为农作物和农产品的质量安全提供数据支撑。

    2.1   ECL在农药残留检测方面的应用

    迄今为止，已发展了多种检测农药残留的ECL方法。以下主要对有机磷农药、氨基甲酸酯类农药和有机氯农药的ECL检测进行介绍。

    2.1.1   有机磷农药的ECL检测

    有机磷农药(OPs)是一种含磷元素的广谱杀虫剂，常用的有马拉硫磷、敌敌畏和草甘膦等。有机磷农药在农业生产中的使用是比较广泛的，它会在农作物或农产品中产生不同程度的残留。剂量大或反复接触之后，会出现中毒症状，严重者会出现呼吸麻痹，甚至死亡[40]。

    近年来，引入生物酶敏感识别元件的ECL酶生物传感器因其选择性好、特异性强等优势，已经成为OPs残留分析的一种有效工具。它的主要原理是基于有机磷农药对酶活性的抑制作用，影响共反应物参与的酶反应效率，进而影响ECL信号的强度。目前，ECL酶生物传感器对OPs的检测可以分为两类：单酶ECL生物传感器和双酶ECL生物传感器。单酶ECL生物传感器针对不同的酶，传感器的构建机理不同。乙酰胆碱酯酶的催化反应产物会与发光体争夺共反应物O2，导致发光体-共反应物体系ECL信号降低；而OPs会抑制乙酰胆碱酯酶的活性，进一步抑制这些反应，体系的ECL信号增强。辣根过氧化物酶(HRP)可以促进发光体ZnS QDs的产生，增强体系ECL信号；而OPs会抑制酶的活性，进一步影响发光体的产生，体系的ECL信号降低。双酶ECL生物传感器是在单酶—乙酰胆碱酯酶的基础上引入另一种酶—胆碱氧化酶，通过两种酶的参与反应产生共反应物双氧水(H2O2)增强体系的ECL信号，当OPs出现后，通过抑制酶的活性来减少H2O2的产生，体系的ECL信号降低。典型的ECL酶生物传感器对OPs的检测性能如表 1所示。

    表 1

    表 1  ECL酶生物传感器对有机磷农药的检测性能[5, 39-42]
    Table 1.  Detection performance of ECL enzyme biosensor for organophosphorus pesticides[5, 39-42]
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    Target Illuminant Coreactants Enzyme LODa/(mol·L-1)) Linear range/(mol·L-1) Ref.
    MPb CdTe QDsc O2 Acetylcholinesterase 2.80×10-10 7.60×10-10~3.80×10-8
    7.60×10-8~5.70×10-7    		 [40]
    OPs C-g-C3N4-PEId K2S2O8e Acetylcholinesterase 3.00×10-13 1.00×10-12~5.00×10-6 [41]
    Glyphosate ZnS QDsf K2S2O8 Horseradish peroxidase -g 1.00×10-10~1.00×10-2 [39]
    OPs Luminol H2O2h acetylcholinesterase
    and choline oxidase    		 8.00×10-11 1.00×10-10~5.00×10-8 [5]
    EPi Anode:PFO dotsj
    Cathode: CdTe QDs    		 Anode: O2
    Cathode: H2O2    		 acetylcholinesterase
    and choline oxidase    		 1.25×10-13 5.00×10-13~1.00×10-8 [42]
    a.Limit of detection; b.Methyl parathion; c.CdTe quantum dots; d.Carboxylated graphitic carbon nitride-poly(ethylenimine); e.Potassium persulfate; f.ZnS quantum dots; g.Not mentioned in the original literature; h.Hydrogen peroxide; i.Ethyl paraoxon; j.Polymer poly(9, 9-dioctylfluorene) dots.

    农作物或农产品中OPs残留的ECL检测方法的主要体系包括量子点ECL体系和鲁米诺ECL体系。

    Liang等[40]首次以石墨烯纳米片(GNS)负载碲化镉量子点(CdTe QDs)复合物为ECL发光体，以乙酰胆碱酯酶为识别元件，建立ECL生物传感器对有机磷农药进行检测。乙酰胆碱酯酶的催化反应产物可以与共反应物O2反应，导致体系ECL信号较低。当加入甲基对硫磷后，乙酰胆碱酯酶的活性受到抑制，酶反应效率降低，O2的消耗减少，体系ECL信号增强。基于以上原理构建了检测甲基对硫磷的ECL生物传感器。该传感器成功应用于农产品卷心菜中甲基对硫磷的检测，检测限低至2.80×10-10 mol/L。然而，CdTe QDs的合成过程虽然比较简单，但是后期需要进行纯化、定量等过程，耗时较长。电极表面原位生成ZnS QDs无需后期处理，可直接进行实验。对此，Zhang等[39]提出在电极表面上酶辅助原位生成ZnS QDs，以K2S2O8为共反应物，并引入HRP促进发光体ZnS QDs的产生，增强体系的ECL信号，而有机磷农药草甘膦可以通过抑制HRP的活性，进而影响ZnS QDs的产生，ECL信号随着ZnS QDs的减少而降低，根据上述原理实现了对草甘膦的灵敏检测。

    鲁米诺因其氧化电势低、发光效率高等优点成为应用较为广泛的ECL发光试剂之一，而H2O2能够有效地提高鲁米诺的ECL信号，所以，鲁米诺-H2O2体系是比较常用的ECL体系。为了构建鲁米诺-H2O2 ECL酶生物传感器，研究人员在乙酰胆碱酯酶的基础上引入胆碱氧化酶构建双酶ECL生物传感器。当采用双酶法组装生物传感器时，乙酰胆碱酯酶反应的产物胆碱会通过胆碱氧化酶反应产生共反应物H2O2，发光体鲁米诺ECL信号随着H2O2的增加而增强，提高传感器的灵敏度。Miao等[5]采用了双重信号放大的方法构建双酶ECL生物传感器检测OPs。首先在玻碳电极上修饰多壁碳纳米管，之后通过电沉积铂-金纳米粒子来增加电极的表面积和鲁米诺的ECL信号；再将乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶固定到电极上，两种酶通过连续反应产生大量的H2O2，增强了鲁米诺的ECL信号。该传感器通过OPs对乙酰胆碱酯酶活性的抑制来控制胆碱氧化酶的反应，减少H2O2的产生，进一步影响ECL信号的强度，实现对OPs的灵敏分析(如图 1所示)。

    图 1

    图 1.  双酶鲁米诺ECL生物传感器检测OPs的示意图[5]
    Figure 1.  Diagram for the detection of OPs by double enzyme luminol ECL biosensor[5]
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    对于上述分析，无论单酶ECL生物传感器还是双酶ECL生物传感器都是利用单信号对目标物进行检测，容易受环境或仪器等外界因素的影响而导致误差。为了进一步提高传感器的重现性和稳定性，利用两个信号的比值检测目标物的比率ECL传感器被研究者们所关注。Yuan等[42]基于Miao课题组的研究，设计了一种双电位比率ECL传感器检测OPs(如图 2所示)。阴极以还原氧化石墨烯-CdTe QDs复合物为发光体，溶解氧为共反应物；阳极以聚合物聚(9, 9-二辛基荧光)点为发光体，H2O2为共反应物。胆碱氧化酶的反应会消耗氧气并产生H2O2，抑制阴极ECL信号的同时增强阳极的ECL信号。OPs的加入，通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性来控制胆碱氧化酶的反应效率，导致氧气消耗减少，H2O2的产生也会减少。此时阴极的ECL信号增强，阳极的ECL信号减弱，利用阳极ECL信号强度与阴极ECL信号强度的比值，提高结果的准确性和可靠性，从而实现对蔬菜中OPs对硫磷(EP)的检测，检测限低至1.25×10-13 mol/L。相比于其他检测EP的酶生物传感器，该传感器的检测限是比较低的(如表 2)。

    图 2

    图 2.  比率ECL生物传感器检测蔬菜中EP的示意图[42]
    Figure 2.  Diagram for the detection of EP in vegetables by ratiometric luminol ECL biosensor[42]
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    表 2

    表 2  不同传感器对EP的检测性能[42-46]
    Table 2.  Comparison of different modified electrode for the determination of EP[42-46]
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    ]Electrode materials Determine method LOD/(mol·L-1) Linear range/(mol·L-1) Ref.
    AChE-ChOx/Au-Pt NPs/3-APTES/GCE Amperometry - 1.50×10-7~2.00×10-7 [43]
    AChE/Au-PPy-rGO/GCE Amperometry 5.00×10-10 1.00×10-9~5.00×10-6 [44]
    AChE/sol gel-TCNQ-MWCNT/SPE Amperometry 3.00×10-11 1.00×10-10~5.00×10-7 [45]
    AChE/g-C3N4-CD-Fc-COOH/GCE ECL 3.00×10-13 1.00×10-12~5.00×10-7 [46]
    AChE-ChOx/PFO-RGO-CdTe/GCE ECL 1.25×10-13 5.00×10-13~5.00×10-8 [42]
    2.1.2   氨基甲酸酯类农药的ECL检测

    氨基甲酸酯类农药是另一种合成农药，它比有机磷农药出现时间晚，主要用于防治粮食、蔬菜等作物的病虫害。虽然其毒性较有机磷农药低，但是仍具有较强的致癌性[47]。

    早在2006年，Lin等[48]将多壁碳纳米管和Ru(bpy)32+发光体固定到玻碳电极上，利用含有氨基官能团的氨基甲酸酯类农药可以增强Ru(bpy)32+ ECL信号这一原理，建立了一种简单、灵敏的方法对氨基甲酸酯类农药进行检测。该传感器可实现水中多种氨基甲酸酯类农药(抗蚜威、灭多虫、涕灭威和虫螨威)的检测。但是，当多种氨基甲酸酯类农药同时存在时，体系的检测选择性较差。

    针对这一问题，适配体被应用于传感器的构建，来提高其选择性。2016年，Li等[15]引入适配体构建生物传感器对氨基甲酸酯类农药虫螨威进行检测。首先将负载金纳米粒子的C60(C60-Au)固定到玻碳电极上，虫螨威适配体的两端分别修饰碳点和巯基，并通过Au—S键合作用固定到金纳米粒子上，利用C60-Au与碳点之间发生能量共振转移，促使C60-Au中的能量转移到碳点上，增强发光体碳点的ECL信号。当有目标物虫螨威存在时，可与适配体发生特异性结合，C60-Au与碳点之间距离变远，限制了能量共振转移的发生，ECL信号降低。基于以上原理对虫螨威实现了特异性分析检测，检测限低至8.80×10-13 mol/L(如图 3所示)。2017年，该课题组进一步利用此原理对涕灭威进行了检测[49]，不过此次发生能量共振转移的是Ru(bpy)32+与金纳米粒子之间。该传感器实现了对涕灭威的高灵敏、特异性检测，检测限低至9.60×10-12 mol/L。

    图 3

    图 3.  碳点ECL生物传感器检测虫螨威的示意图[15]
    Figure 3.  Diagram for the detection of acarb by carbon dot ECL biosensor[15]
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    2.1.3   有机氯农药的ECL检测

    含氯苯酚是有机氯农药的一种，也是环境中典型的持久性有机污染物。其中，五氯苯酚(PCP)是含氯苯酚家族中最常用和最强的致癌物质之一[50]。

    利用ECL对五氯苯酚的检测主要是基于PCP对发光体ECL信号的影响这一原理实现的。相关检测性能如表 3所示。

    表 3

    表 3  ECL传感器对五氯苯酚的检测性能[14, 16, 50-53]
    Table 3.  Determination of Pentachlorophenol by ECL[14, 16, 50-53]
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    Illuminant Coreactants LOD/(mol·L-1) Linear range/(mol·L-1) Ref.
    g-C3N4 O2 1.00×10-11 1.00×10-11~1.00×10-7 [16]
    CQDsa K2S2O8 1.00×10-12 1.00×10-12~1.00×10-8 [50]
    CdS QDsb K2S2O8 1.00×10-12 1.00×10-12~1.00×10-9 [14]
    ZnO K2S2O8 1.60×10-13 5.00×10-13~6.11×10-8 [51]
    Au NCsc K2S2O8 1.00×10-14 1.00×10-14~1.00×10-10 [52]
    CuO NWsd K2S2O8 7.00×10-15 1.00×10-14~1.00×10-9 [53]
    a.Carbon quantum dots; b.CdS quantum dots; c.Au nanoclusters; d.Copper oxide nanowires.

    Yang等[50]首次提出用一步电化学还原技术制备碳点和石墨烯复合物。其中，碳点作为发光体，K2S2O8作为共反应物，石墨烯作为信号放大试剂，提高体系的ECL信号。加入PCP后，PCP被碳点吸附在表面，并与激发态碳点发生氧化反应，导致碳点ECL信号减弱。基于此原理对水中的PCP实现了快速、实时检测，检测限为1.00×10-12 mol/L。为了提高传感器的灵敏度，该课题组在2014年采用相同的机理构建了一种发光体为金纳米簇、共反应物为过硫酸钾的传感器对PCP进行检测[52]。利用石墨烯负载金纳米簇，实现金纳米簇ECL信号的放大，提高检测灵敏度。该传感器检测限进一步降低至1.00×10-14 mol/L。该方法与室温磷光法[54]、荧光共振能量转移法[55]、电化学法[56]等相比，具有较低的检测限。

    除了量子点、金纳米簇以外，g-C3N4作为一种新型的碳材料，以其无毒、低成本、化学性质稳定等优点，受到人们的广泛关注[16]。Xia等[16]首次采用一步电化学还原技术制备了g-C3N4和石墨烯复合物，石墨烯不仅可以负载g-C3N4，还可以增强g-C3N4的ECL信号。基于PCP可以与激发态g-C3N4发生反应，淬灭ECL信号的原理，对PCP进行分析，检测限为1.00×10-11 mol/L。

    2.2   ECL在真菌毒素检测方面的应用

    真菌毒素是由丝状真菌产生的毒性极强的次生代谢产物，其繁殖需要温暖、潮湿的环境[7]。在这种适宜的环境中，尤其是当缺少有效防霉措施时，玉米、小麦、大豆等谷物很容易发生霉变而受到真菌毒素的污染。目前，许多真菌毒素已被检测出来，毒性较强的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素、呕吐毒素和赭曲霉毒素等。这些真菌毒素具有高毒性或致癌性，可对人类和动物造成急性或慢性影响[7]，如破坏细胞结构，损害动物体肝脏、肾脏、神经、造血等组织器官[57]。

    有些基于ECL构建的传感器对真菌毒素的检测引入了生物识别原件[58-65](抗体或适配体)，其选择性好、灵敏度高(表 4)。

    表 4

    表 4  ECL传感器对真菌毒素的检测性能[58-65]
    Table 4.  Detection of mycotoxins by ECL sensors[58-65]
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    Target Illuminant Coreactants Biological element LOD/(g·mL-1) Linear range/(g·mL-1) Ref.
    AFB1a Cu/Ni/Ru K2S2O8 Antigen, antibody 3.90×10-12 1.00×10-11~1.00×10-7 [58]
    AFB1 Luminol H2O2 Antibody 5.00×10-14 1.00×10-13~5.00×10-8 [59]
    AFB1 Anode:luminol Cathode：

    CdTe/CdS/ZnS QDs    		 H2O2 Aptamer 3.74×10-14 1.56×10-12~3.12×10-9 [60]
    DONb RuSi@Ru(bpy)32+ K2S2O8 Antibody 1.00×10-12 5.00×10-12~1.00×10-7 [61]
    DON Ru(bpy)32+ F-couSiPcc Antigen, antibody 3.00×10-14 1.00×10-13~2.00×10-8 [62]
    OTAd Ru(phen)32+ TPA Aptamer 2.00×10-14 5.00×10-14~5.00×10-10 [63]
    OTA Ru(bpy)32+ TPA - 2.70×10-14 1.00×10-13~1.48×10-8 [64]
    OTA Ru(bpy)32+ TPA - 2.50×10-16 1.00×10-15~2.00×10-7 [65]
    a.Aflatoxin B1; b.Mycotoxin deoxynivalenol; c.Fluoro-coumarin silicon(IV) phthalocyanine; d.Ochratoxin A.
    2.2.1   黄曲霉毒素的ECL检测

    黄曲霉毒素主要存在于谷物、坚果、棉籽及相关产品中，是由真菌黄曲霉和寄生曲霉等产生的有毒代谢物和强致癌物[66]。黄曲霉毒素可以分为不同的种类，如黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素M1(AFM1)等，其中AFB1的毒性最强[60]。

    近年来，用于检测黄曲霉毒素的ECL免疫生物传感器成为研究热点[60-61, 66-67]。例如，Lv等[59]利用介孔碳负载AFB1的抗体和银纳米粒子，并通过银-氨基键将发光体鲁米诺与银纳米粒子结合，构建了一种ECL免疫生物传感器。而AFB1与抗体结合阻碍了鲁米诺与溶液中共反应物H2O2的接触，导致鲁米诺ECL信号降低，该传感器可实现AFB1的灵敏检测，检测限为5.00×10-14 g/mL(如图 4所示)。该ECL免疫传感器与已有的检测AFB1的电化学免疫传感器[68]、电免疫传感器[69]、表面电浆共振[70]、电化学阻抗传感器[71]、化学发光竞争性适配体分析传感器[72]、光生物传感器[73]相比，具有较低的检测限和较宽的检测范围。

    图 4

    图 4.  ECL免疫生物传感器检测AFB1的示意图[59]
    Figure 4.  Performance analysis for the detection of AFB1 by ECL immunosensor[59]
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    适配体具有可以与抗体相媲美的高亲和力和选择性，而且适配体的生产成本更低，所以一些科研人员将黄曲霉毒素的适配体引入到ECL生物传感器中[60, 74]。如Wu等[60]分别以CdTe/CdS/ZnS QDs和鲁米诺为阴、阳极发光体，建立了一种比率ECL适配体传感器(如图 5所示)。HRP可以催化H2O2使其参与鲁米诺的ECL反应。加入AFB1后，由于AFB1的适配体与AFB1结合，导致含有HRP的互补链脱离玻碳电极表面。因为阴、阳极发光体的共反应物都是H2O2，阳极鲁米诺的反应效率由于HRP的减少而降低，更多的H2O2参与到阴极ECL反应，最终导致QDs的ECL信号增强，而鲁米诺的ECL信号降低。基于ECL强度比(QDs/鲁米诺)实现食品中AFB1的有效检测，检测限低至3.74×10-14 g/mL。

    图 5

    图 5.  比率ECL生物传感器检测AFB1的示意图[60]
    Figure 5.  Diagram for the detection diagram of AFB1 by Ratiometric ECL biosensor[60]
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    2.2.2   呕吐毒素的ECL检测

    呕吐毒素(DON)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，主要由镰刀菌产生的次生代谢物[63]，污染小麦和玉米等谷类作物，也会污染粮食制品。科研人员对此毒素的ECL检测方法主要是引入抗原抗体构建ECL免疫生物传感器[61-62]。

    Zheng等[62]首次将Ru(bpy)32+与共反应物氟香豆素硅(Ⅳ)酞菁复合成为自增强的ECL试剂。具有良好电学性质的丙烯-3, 4, 9, 10-四羧酸(PTCA)上结合了DON，使其可以与连接DON抗体的ECL试剂结合，并增强其ECL信号。当游离的DON与抗体结合时，抗体与连接在PTCA上的DON结合位点减少，ECL信号减弱。根据固定抗原和游离抗原与抗体的竞争反应构建了一种扩增的竞争性ECL免疫传感器，用于呕吐毒素的检测，检测限低至3.00×10-14 g/mL(如图 6所示)。

    图 6

    图 6.  竞争性ECL免疫生物传感器检测呕吐毒素的示意图[62]
    Figure 6.  Diagram for the detection of DON by competitive-type ECL immunosensor[62]
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    2.2.3   赭曲霉毒素的ECL检测

    赭曲霉毒素A(OTA)是真菌毒素中另一种常见的毒素，它具有毒性大、分布广等特点，对农产品的污染严重，与人类健康密切相关。对于该毒素的ECL检测主要是利用OTA与适配体的结合这一原理进行的[63, 75-77]。

    Yang等[63]通过Au-S将OTA适配体的互补链固定到金电极表面，加入适配体后，适配体与互补DNA链配对结合。当有目标物OTA存在时，适配体与OTA结合从电极表面释放。随后，电极表面游离的DNA与初始滚动圆引物杂交并诱导超支化滚环扩增反应。Ru(phen)32+可以嵌入到扩增反应的产物双链DNA中，体系的ECL信号增强，基于此原理构建的传感器可以对OTA进行分析检测(如图 7所示)。

    图 7

    图 7.  ECL生物传感器检测OTA的示意图[63]
    Figure 7.  Diagram for the detection of OTA by ECL biosensor[63]
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    除了引入适配体可以提高传感器的特异性之外，研究者们尝试引用具有类似生物元件(抗体和适配体)的高特异性及较好环境耐受性的人工合成的分子印迹聚合物(MIP)构建ECL传感器检测真菌毒素。2016年，Wang等[64]研制了一种MIP ECL传感器。MIP是模板分子、功能单体通过特殊的作用力制备出分子印迹聚合物，然后洗去模板分子留下空穴以便特异性识别模板分子。共反应物TPA通过未结合的孔洞与固定在电极表面的Ru(bpy)32+反应。当OTA与空穴特异性结合后ECL信号降低，从而实现对OTA高灵敏检测，检测限为2.70×10-14 g/mL。

    3.   结论与展望

    综上所述，利用ECL方法构建传感器对农药残留和真菌毒素检测的体系主要包括吡啶钌配合物体系、鲁米诺体系和量子点体系，这些传感器具有简单、快速和灵敏等优点，所以，有关ECL方法相关领域的研究越来越多，且ECL生物传感器的构建方法也日趋成熟。但是，以ECL构建的传感器对这些物质的分析仍存在一些挑战和难题，如许多ECL传感器并不能实现现场、即时检测，大多都需要在实验室中完成相关操作；而且生物传感器中的酶和适配体容易受环境影响失去活性，导致传感器的重现性和稳定性降低，对检测环境要求较高。因此，未来ECL传感器对以上物质的研究方向是实现ECL传感器小型、便于携带、实时的现场检测，并不易受环境的影响。随着农药和真菌毒素种类的逐渐增多，研究可实现同时检测多种目标物的ECL传感器是检测农药残留和真菌毒素领域的进一步发展方向。

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  • Scheme 1  ECL mechanism of luminol reaction with H2O2[33]

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    图 1  双酶鲁米诺ECL生物传感器检测OPs的示意图[5]

    Figure 1  Diagram for the detection of OPs by double enzyme luminol ECL biosensor[5]

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    图 2  比率ECL生物传感器检测蔬菜中EP的示意图[42]

    Figure 2  Diagram for the detection of EP in vegetables by ratiometric luminol ECL biosensor[42]

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    图 3  碳点ECL生物传感器检测虫螨威的示意图[15]

    Figure 3  Diagram for the detection of acarb by carbon dot ECL biosensor[15]

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    图 4  ECL免疫生物传感器检测AFB1的示意图[59]

    Figure 4  Performance analysis for the detection of AFB1 by ECL immunosensor[59]

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    图 5  比率ECL生物传感器检测AFB1的示意图[60]

    Figure 5  Diagram for the detection diagram of AFB1 by Ratiometric ECL biosensor[60]

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    图 6  竞争性ECL免疫生物传感器检测呕吐毒素的示意图[62]

    Figure 6  Diagram for the detection of DON by competitive-type ECL immunosensor[62]

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    图 7  ECL生物传感器检测OTA的示意图[63]

    Figure 7  Diagram for the detection of OTA by ECL biosensor[63]

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    表 1  ECL酶生物传感器对有机磷农药的检测性能[5, 39-42]

    Table 1.  Detection performance of ECL enzyme biosensor for organophosphorus pesticides[5, 39-42]

    Target Illuminant Coreactants Enzyme LODa/(mol·L-1)) Linear range/(mol·L-1) Ref.
    MPb CdTe QDsc O2 Acetylcholinesterase 2.80×10-10 7.60×10-10~3.80×10-8
    7.60×10-8~5.70×10-7    		 [40]
    OPs C-g-C3N4-PEId K2S2O8e Acetylcholinesterase 3.00×10-13 1.00×10-12~5.00×10-6 [41]
    Glyphosate ZnS QDsf K2S2O8 Horseradish peroxidase -g 1.00×10-10~1.00×10-2 [39]
    OPs Luminol H2O2h acetylcholinesterase
    and choline oxidase    		 8.00×10-11 1.00×10-10~5.00×10-8 [5]
    EPi Anode:PFO dotsj
    Cathode: CdTe QDs    		 Anode: O2
    Cathode: H2O2    		 acetylcholinesterase
    and choline oxidase    		 1.25×10-13 5.00×10-13~1.00×10-8 [42]
    a.Limit of detection; b.Methyl parathion; c.CdTe quantum dots; d.Carboxylated graphitic carbon nitride-poly(ethylenimine); e.Potassium persulfate; f.ZnS quantum dots; g.Not mentioned in the original literature; h.Hydrogen peroxide; i.Ethyl paraoxon; j.Polymer poly(9, 9-dioctylfluorene) dots.
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    表 2  不同传感器对EP的检测性能[42-46]

    Table 2.  Comparison of different modified electrode for the determination of EP[42-46]

    ]Electrode materials Determine method LOD/(mol·L-1) Linear range/(mol·L-1) Ref.
    AChE-ChOx/Au-Pt NPs/3-APTES/GCE Amperometry - 1.50×10-7~2.00×10-7 [43]
    AChE/Au-PPy-rGO/GCE Amperometry 5.00×10-10 1.00×10-9~5.00×10-6 [44]
    AChE/sol gel-TCNQ-MWCNT/SPE Amperometry 3.00×10-11 1.00×10-10~5.00×10-7 [45]
    AChE/g-C3N4-CD-Fc-COOH/GCE ECL 3.00×10-13 1.00×10-12~5.00×10-7 [46]
    AChE-ChOx/PFO-RGO-CdTe/GCE ECL 1.25×10-13 5.00×10-13~5.00×10-8 [42]
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    表 3  ECL传感器对五氯苯酚的检测性能[14, 16, 50-53]

    Table 3.  Determination of Pentachlorophenol by ECL[14, 16, 50-53]

    Illuminant Coreactants LOD/(mol·L-1) Linear range/(mol·L-1) Ref.
    g-C3N4 O2 1.00×10-11 1.00×10-11~1.00×10-7 [16]
    CQDsa K2S2O8 1.00×10-12 1.00×10-12~1.00×10-8 [50]
    CdS QDsb K2S2O8 1.00×10-12 1.00×10-12~1.00×10-9 [14]
    ZnO K2S2O8 1.60×10-13 5.00×10-13~6.11×10-8 [51]
    Au NCsc K2S2O8 1.00×10-14 1.00×10-14~1.00×10-10 [52]
    CuO NWsd K2S2O8 7.00×10-15 1.00×10-14~1.00×10-9 [53]
    a.Carbon quantum dots; b.CdS quantum dots; c.Au nanoclusters; d.Copper oxide nanowires.
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    表 4  ECL传感器对真菌毒素的检测性能[58-65]

    Table 4.  Detection of mycotoxins by ECL sensors[58-65]

    Target Illuminant Coreactants Biological element LOD/(g·mL-1) Linear range/(g·mL-1) Ref.
    AFB1a Cu/Ni/Ru K2S2O8 Antigen, antibody 3.90×10-12 1.00×10-11~1.00×10-7 [58]
    AFB1 Luminol H2O2 Antibody 5.00×10-14 1.00×10-13~5.00×10-8 [59]
    AFB1 Anode:luminol Cathode：

    CdTe/CdS/ZnS QDs    		 H2O2 Aptamer 3.74×10-14 1.56×10-12~3.12×10-9 [60]
    DONb RuSi@Ru(bpy)32+ K2S2O8 Antibody 1.00×10-12 5.00×10-12~1.00×10-7 [61]
    DON Ru(bpy)32+ F-couSiPcc Antigen, antibody 3.00×10-14 1.00×10-13~2.00×10-8 [62]
    OTAd Ru(phen)32+ TPA Aptamer 2.00×10-14 5.00×10-14~5.00×10-10 [63]
    OTA Ru(bpy)32+ TPA - 2.70×10-14 1.00×10-13~1.48×10-8 [64]
    OTA Ru(bpy)32+ TPA - 2.50×10-16 1.00×10-15~2.00×10-7 [65]
    a.Aflatoxin B1; b.Mycotoxin deoxynivalenol; c.Fluoro-coumarin silicon(IV) phthalocyanine; d.Ochratoxin A.
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  • 发布日期:  2019-04-01
  • 收稿日期:  2018-12-29
  • 接受日期:  2019-02-21
  • 修回日期:  2019-02-13
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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