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• 肉桂酰酪胺类似物已被发现存在于等芸香科花椒属植物根茎皮、腺果藤根茎和兰科黄兰等植物中^[1-8]，天然或合成的此类化合物具有抗血小板聚集^{[6-7, 9-11]}、抗炎^[12]、抗菌^[13-15]、诱导癌细胞凋亡^[16-17]、预防和治疗阿尔茨海默症^[18]等多种生理活性。柄果花椒酰胺是从芸香科柄果花椒树皮中提取得到的一种生物碱^[2]，属于肉桂酰酪胺类似物，其类似物在台湾胡椒木的茎和腺果藤的茎根中均有发现^[6-8]。柄果花椒酰胺在体外具有抗血小板聚集及降转氨酶活性的作用^[9]，其类似物也被发现具有抗血小板聚集作用^{[6-7, 9-11]}。因此，柄果花椒酰胺及其类似物的全合成对进一步研究构效关系具有一定的意义。目前报道合成肉桂酰酪胺类化合物的方法包括两类：一类是先制备肉桂酸或肉桂酰氯，再生成酰胺^[9-10]；另一类是生成酰胺后再生成肉桂酰部分的碳碳双键^[19-20]。

  本研究选择第一类合成方法，确定并优化了柄果花椒酰胺的全合成路线。该路线以苯甲醛衍生物为原料，经Knoevenagel缩合反应^[21]、酰化反应^{[9, 12]}及甲基化^[23]反应合成了柄果花椒酰胺(4a)(Scheme 1)。考虑到天然产物柄果花椒酰胺及台湾木胡椒根茎中发现的类似物中，酰胺基团均为甲基化状态，为了探究结构中肉桂酰苯环上甲氧基取代、酪胺上羟基和酰胺上胺基被甲基化对化合物活性的影响，得到体外抗血小板聚集活性更高的抑制剂，本文合成了一系列柄果花椒肉桂酰酪胺类似物(Scheme 1)。其中，甲氧基代肉桂酸类化合物1a~1h的合成，采用相应的醛与丙二酸在微波条件下制备，条件温和，收率在60%~97%之间。酰化反应时若采用N, N′-二环己基碳二亚胺(DCC)作偶联剂进行反应，产物中混杂DCC及二环己基脲(DCU)，难以得到目标产物。改用O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)作偶联剂能得到较好的分离效果及较理想的收率。借助变温核磁^[25-27]、质谱和单晶衍射，甲基化所得目标产物的结构得以确证。最后，采健康新西兰兔血研究了目标产物抗ADP(二磷酸腺苷)诱导血小板聚集的体外活性。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis route of the cinnamoyl-tyramine amide analogues

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  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  Bruker DRX-400型核磁共振仪(美国Varian公司)；LC/Q-Tof MS型液相色谱/四间串联质谱仪(美国Agilent公司)；HP1100LC/MSD型质谱仪(美国Agilent公司)；LD-2A型低速离心机(中国北京医用离心厂)；LBY-NJ4型血小板聚集测定仪(中国北京普利生仪器有限公司)。

  二甲亚砜(≥99.8%)购自于美国Sigma公司；聚氧乙烯氢化蓖麻油(＞99%)购自于青岛优索化学科技有限公司；四氢呋喃(≥99.0%)购自于天津市科密欧化学试剂有限公司，经蒸馏后使用，其余试剂均为市售分析纯。新西兰兔(雌雄兼用，2.0~2.5 kg，购自于大连医科大学实验动物中心，实验动物许可证号为：SCXK(辽)2013-0003)。

  1.2   实验方法

  3-(3, 4-亚甲二氧基)苯丙烯酸(1a)  将胡椒醛(1.03 g，7.9 mmol)，丙二酸(2.08 g，20 mmol)溶于吡啶(40 mL)中，加入吡咯烷(2 mL)，搅拌溶解，微波反应(600 W，80 ℃)。薄层色谱法(TLC)监测，2 h反应完全。将反应液倾入冷盐酸(6 mol/L，200 mL)中，搅拌，有白色固体析出。抽滤，干燥，得白色固体1a，产率60%;¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ:7.60(d, 1H, J=15.9 Hz, H-8), 7.28(d, 1H, J=1.7 Hz, H-2), 7.17(dd, 1H, J=8.0 Hz, 1.7 Hz, H-6), 6.91(d, 1H, J=8.0 Hz, H-5), 6.39(d, 1H, J=15.9 Hz, H-8), 6.08(s, 2H, OCH₂O)。

  分别以相应苯甲醛衍生物投料，同法操作，制得化合物1b~1h。

  化合物1b  淡紫色粉末，产率97%;¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.80(d, 1H, J=15.9 Hz, H-7), 7.56(m, 2H, H-2, 6), 7.42(m, 3H, H-3, 4, 5), 6.46(d, 1H, J=15.9 Hz, H-8)。

  化合物1c  淡黄色粉末，产率91%;¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.75(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.51(dd, 2H, J=2.0, 6.8 Hz, H-2, 6), 6.92(dd, 2H, J=2.0, 6.8 Hz, H-3, 5), 6.32(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.85(s, 3H, OCH₃)。

  化合物1d  黄色粉末，产率86%;¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:8.01(d, 1H, J=15.9 Hz, H-7), 7.47(d, 1H, J=8.0 Hz, H-6), 6.60(s, 1H, H-3), 6.52(d, 1H, J=8.0 Hz, H-5), 6.45(d, 1H, J=15.9 Hz, H-8), 3.88(s, 3H, OCH₃), 3.85(s, 3H, OCH₃)。

  化合物1e  黄绿色粉末，产率97%;¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:8.08(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.07(d, 1H, J=2.8 Hz, H-6), 6.94(dd, 1H, J=8.8, 3.2 Hz, H-4), 6.86(d, 1H, J=8.8 Hz, H-3), 6.52(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.86(s, 3H, OCH₃), 3.80(s, 3H, OCH₃)。

  化合物1f  淡黄色粉末，产率92%;¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.73(d, 1H, J=15.6 Hz, H-7), 7.14(dd, 1H, J=8.4, 2 Hz, H-6), 7.08(d, 1H, J=2 Hz, H-2), 6.88(d, 1H, J=8.4 Hz, H-5), 6.33(d, 1H, J=15.6 Hz, H-8), 3.92(s, 6H, OCH₃)。

  化合物1g  淡黄色粉末，产率90%;¹H NMR400 MHz, CDCl₃), δ:7.71(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 6.69(d, 2H, J=4.0 Hz, H-2, 6), 6.52(s, 1H, H-4), 6.42(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.82(s, 6H, OCH₃)。

  化合物1h  白色粉末，产率87%;¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.71(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 6.79(s, 2H, H-2, 6), 6.36(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.90(s, 9H, OCH₃)。

  N-对羟基苯乙基-(3, 4-亚甲二氧基)苯丙烯酰胺(2a)  将化合物1a(0.75 g，4.36 mmol)，酪胺(0.60 g，4.36 mmol)，三乙胺(10 mL)，溶于乙腈(50 mL)中，搅拌完全溶解后加入HBTU(2.10 g，5.50 mmol)。TLC监测0.5 h反应完全。将反应液浓缩，加入二氯甲烷(50 mL)，依次用10%柠檬酸溶液(50 mL)、饱和食盐水(50 mL)、去离子水(50 mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得黄色液体，柱层析色谱分离(V(石油醚):V(丙酮)=2:1)，得白色固体2a，产率51%;mp 176~178 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ:7.45(d, 1H, J=15.6 Hz, H-7), 7.09(d, 1H, J=1.5 Hz, H-2), 7.06(d, 2H, J=8.4 Hz, H-13, 17), 7.05(dd, 1H, J=8.0, 1.5 Hz, H-6), 6.86(d, 1H, J=8.0 Hz, H-5), 6.76(d, 2H, J=8.4 Hz, H-14, 16), 6.52(d, 1H, J=15.6 Hz, H-8), 6.04(s, 2H, OCH₂O), 3.47~3.52(m, 2H, H-10), 2.75(t, 2H, J=7.6 Hz, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₈H₁₈NO₄[M+H]⁺312.12，实测值:312.24。

  同法操作，制得化合物2b~2h。

  化合物2b  白色固体，产率53%;mp 188~189 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ:7.56(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.51(m, 2H, H-2, 6), 7.41~7.35(m, 3H, H-3, 4, 5), 7.07(d, 2H, J=8.0, 1.7 Hz, H-13, 17), 6.76(d, 2H, J=8.0 Hz, H-14, 16), 6.67(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.50(m, 2H, H-10), 2.91(m, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₇H₁₈NO₂[M+H]⁺268.13，实测值:268.23。

  化合物2c  白色固体，产率55%;mp 118~128 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ:7.75(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.49(dd, 2H, J=6.8, 2.0 Hz, H-2, 6), 7.07(dd, 2H, J=8.0, 1.7 Hz, H-13, 17), 6.93(dd, 2H, J=6.8, 2.0 Hz, H-3, 5), 6.75(dd, 2H, J=8.0, 1.7 Hz, H-14, 16), 6.51(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.83(s, 3H, OCH₃), 3.47(m, 2H, H-10), 2.77(m, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₈H₂₀NO₃[M+H]⁺298.14，实测值:298.17。

  化合物2d  白色固体，收率56%;mp 165~167 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ:8.03(d, 1H, J=15.9 Hz, H-7), 7.95(d, 1H, J=8.0 Hz, H-6), 7.13(dd, 2H, J=8.0, 1.7 Hz, H-13, 17), 6.72(dd, 2H, J=8.0, 1.7 Hz, H-14, 16), 6.60(s, 1H, H-3), 6.52(d, 1H, J=8.0 Hz, H-5), 6.45(d, 1H, J=15.9 Hz, H-8), 3.88(s, 3H, OCH₃), 3.85(s, 3H, OCH₃), 3.53(m, 2H, H-10), 2.76(m, 2H, H-11)。ESI-HRMS(m/z)计算值:C₁₉H₂₂NO₄[M+H]⁺328.1543，实测值: 328.1540。

  化合物2e  白色固体，收率59%;mp 179~181 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ:8.08(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.18(dd, 2H, J=2.8 Hz, H-6), 7.05(dd, 1H, J=8.0, 1.7 Hz, H-13, 17), 6.94(dd, 1H, J=8.8, 2.8 Hz, H-4), 6.86(d, 1H, J=8.8 Hz, H-3), 6.73(dd, 2H, J=8.0, 1.7 Hz, H-14, 16), 6.48(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.67(s, 3H, OCH₃), 3.65(s, 3H, OCH₃), 3.50(m, 2H, H-10), 2.71(m, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₉H₂₂NO₄[M+H]⁺328.15，实测值:328.17。

  化合物2f  白色固体，收率57%;mp 140~143 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ:7.82(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.17(d, 2H, J=8.0 Hz, H-13, 17), 7.09(d, 1H, J=4.0 Hz, H-2), 6.98 (dd, J=8.4, 4.0 Hz, 1H, H-6), 6.90(d, 1H, J=8.4 Hz, H-5), 6.85(d, 2H, J=8.0 Hz, H-14, 16), 6.69(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.83(s, 3H, OCH₃), 3.76(s, 3H, OCH₃), 3.52(m, 2H, H-10), 2.79(m, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₉H₂₂NO₄[M+H]⁺328.15，实测值:328.24。

  化合物2g  白色固体，收率56%;mp 181~183 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ:7.47(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.1 4(d, 2H, J=8.0 Hz, H-13, 17), 6.70(s, 2H, H-2, 6), 6.68(d, 2H, J=8.0 Hz, Ar-14, 16), 6.45(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 6.37(s, 1H, H-4), 3.82(s, 6H, OCH₃), 3.56(m, 2H, H-10), 2.72(m, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₉H₂₂NO₄[M+H]⁺328.15，实测值:328.27。

  化合物2h  白色固体，收率57 %; mp 174~176 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ: 7.44(d, 2H, J=16.0 Hz, H-7), 7.21(d, 2H, J=8.0 Hz, H-13, 17), 6.87(s, 2H, H-2, 6), 6.76(d, 2H, J=8.0 Hz, H-14, 16), 6.59(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.86(s, 6H, OCH₃), 3.74(s, 3H, OCH₃), 3.50(m, 2H, H-10), 2.76(m, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₂₀H₂₄NO₅[M+H]⁺358.16，实测值:358.25。

  N-对甲氧基苯乙基-(3, 4-亚甲二氧基)苯丙烯酰胺(3a)  将化合物2a(0.11 g，0.33 mmol)、氢氧化钾(0.18 g，3.2 mmol)、碘化钠(34 mg，0.23 mmol)溶于丙酮(10 mL)中，室温下搅拌原料溶解后，加入碘甲烷(47 mg，0.33 mmol)，回流反应。TLC监测反应完全。反应液中加入去离子水(30 mL)，二氯甲烷萃取(50 mL×2)，饱和食盐水(50 mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂，得白色针状固体3a，收率82%;mp 170~172 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CD₃COCD₃), δ:7.44(d, 1H, J=15.6 Hz, H-7) 7.22(brs, 1H, NH), 7.16(d, 2H, J=8.6 Hz, H-13, 17), 7.09(d, 1H, J=1.5 Hz, H-2), 7.05(dd, 1H, J=8.0 Hz, 1.5 Hz, H-6), 6.86(d, 1H, J=8.0 Hz, H-5), 6.85(d, 1H, J=8.6 Hz, H-14, 16), 6.50(d, 1H, J=15.6 Hz, H-7), 6.04(s, 2H, OCH₂O), 3.76(s, 3H, OCH₃), 3.47~3.54(m, 2H, H-10), 2.79(m, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₉H₂₀NO₄[M+H]⁺326.14，实测值:326.17。

  同法操作，制得化合物3b~3h。

  化合物3b  白色固体，收率96%;mp 142~144 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.61(d, 1H, J=15.6 Hz, H-7), 7.47(m, 2H, H-2, 6), 7.34(m, 3H, H-3, 4, 5), 7.14(d, 2H, J=8.8 Hz, H-13, 17), 6.86(d, 2H, J=8.8 Hz, H-14, 16), 6.33(d, 1H, J=15.6 Hz, H-8), 5.69(brs, 1H, NH), 3.79(s, 3H, OCH₃), 3.62 (q, 2H, J=6.9 Hz, H-10), 2.83(t, 2H, J=6.9 Hz, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₈H₂₀NO₂[M+H]⁺282.15，实测值:282.15。

  化合物3c  白色固体，收率95%;mp 164~166 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.57(d, 1H, J=15.6 Hz, H-7), 7.40(dd, 2H, J=11.2, 2.8 Hz, H-2, 6), 7.12(dd, 2H, J=9.6, 2.8 Hz, H-13, 17), 6.87(m, 4H, H-3, 5, 14, 16), 6.20(d, 1H, J=15.6 Hz, H-8), 5.63(brs, 1H, NH), 3.82(s, 3H, OCH₃), 3.79(s, 3H, OCH₃), 3.60(q, 2H, J=8.0 Hz, H-10), 2.82(t, 2H, J=8.0 Hz, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₉H₂₂NO₃[M+H]⁺312.16，实测值:312.21。

  化合物3d  白色固体，收率96%;mp 127~130 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.80(d, 1H, J=15.8 Hz, H-7), 7.36(d, 1H, J=8.2 Hz, H-6), 7.12(d, 2H, J= 8.6 Hz, H-13, 17), 6.83(d, 2H, J=8.6 Hz, H-14, 16), 6.43(dd, 1H, J=8.2, 2.4 Hz, H-5), 6.42(d, 1H, J=2.4 Hz, H-3), 6.39(d, 1H, J=15.8 Hz, H-8), 5.93(br s, 1H, NH), 3.80(s, 6H, OCH₃), 3.77(s, 3H, OCH₃), 3.59(q, 2H, J=7.0 Hz, H-10), 2.81(t, 2H, J=7.0 Hz, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₂₀H₂₄NO₄[M+H]⁺342.17，实测值:342.23。

  化合物3e  淡黄色固体，收率90%;mp 143~145 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:8.07(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.18(dd, 2H, J=8.0, 1.7 Hz, H-13, 17), 7.05(d, 1H, J=2.8 Hz, H-6), 6.94(dd, 1H, J=8.8, 3.2 Hz, H-4), 6.86(d, 1H, J=8.8 Hz, H-3), 6.73(dd, 2H, J=8.0, 1.7 Hz, H-14, 16), 6.48(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.67(s, 3H, OCH₃), 3.65(s, 3H, OCH₃), 3.61(s, 3H, OCH₃), 3.50(m, 2H, H-10), 2.71(m, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₂₀H₂₄NO₄[M+H]⁺342.17，实测值:342.31。

  化合物3f  白色固体，收率98%;mp 145~146 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.56(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.15(d, 2H, J=8.0 Hz, H-13, 17), 7.07(d, 1H, J=4.0 Hz, H-2), 6.98(dd, J=8.4, 4.0 Hz, 1H, H-6), 6.90(d, 1H, J=8.4 Hz, H-5), 6.85(d, 2H, J=8.0 Hz, H-14, 16), 6.20(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.90(s, 6H, OCH₃), 3.80(s, 3H, OCH₃), 3.62(m, 2H, H-10), 2.83(m, 2H, H-11)。¹³C NMR(100 MHz, CDCl₃), δ:166.2(C-9), 158.2(C-15), 150.5(C-3), 149.1(C-4), 140.6(C-7), 130.9(C-12), 129.7(C-13, 17), 127.8(C-1), 121.9(C-6), 118.7(C-8), 114.0(C-14, 16), 111.1(C-2), 109.7(C-5), 55.9(OCH₃), 55.8(OCH₃), 55.2(OCH₃), 41.0(C-10), 34.7(C-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₂₀H₂₄NO₄[M+H]⁺342.17，实测值:342.31。

  化合物3g  白色固体，收率90%;mp＞300 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.49(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.14(d, 2H, J=8.0 Hz, H-13, 17), 6.70(s, 2H, H-2, 6), 6.68(d, 2H, J=8.0 Hz, H-14, 16), 6.45(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 6.37(s, 1H, H-4), 3.82(s, 9H, OCH₃), 3.56(m, 2H, H-10), 2.72(m, 2H, H-11)。¹³C NMR(100 MHz, CDCl₃), δ:166.2(C-9), 161.5(C-3, 5), 157.8(C-15), 141.8(C-7), 134.2(C-1), 129.8(C-13, 17), 120.3(C-8), 114.3(C-14, 16), 105.6(C-2, 6), 99.7(C-4), 55.9(OCH₃), 55.9(OCH₃), 55.7(OCH₃), 40.7(C-10), 35.2(C-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₂₀H₂₄NO₄[M+H]⁺342.17，实测值:342.25。

  化合物3h  白色固体，收率93%;mp 117~119 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃), δ:7.38(d, 2H, J=16.0 Hz, H-7), 7.21(d, 2H, J=8.0 Hz, H-13, 17), 6.83(d, 2H, J=8.0 Hz, H-14, 16), 6.80(s, 2H, H-2, 6), 6.59(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.86(s, 6H, OCH₃), 3.74(s, 3 H, OCH₃), 3.62(m, 2H, H-10), 2.74(m, 2H, H-11)。¹³C NMR(100 MHz, CDCl₃), δ:166.3(C-9), 158.4(C-15), 153.1(C-3, 5), 142.7(C-7), 138.2(C-4), 132.3(C-12), 130.5(C-13, 17), 132.3(C-12), 127.5(C-1), 118.3(C-8), 114. 0(C-14, 16), 103.1(C-2, 6), 60.8(OCH₃), 56.2(OCH₃), 55.8(OCH₃), 41.0(C-10), 34.8(C-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₂₁H₂₆NO₅[M+H]⁺372.18，实测值:372.28。

  N-甲基-N-对甲氧基苯乙基-(3, 4-亚甲基二氧基)苯丙烯酰胺(4a)  将化合物3a(0.50 g，1.54 mmol)溶于无水四氢呋喃(20 mL)中，N₂气保护，冰浴下强烈搅拌，加入氢化钠(0.25 g，3.08 mmol)，继续强烈搅拌30 min，加入碘甲烷(0.14 mL，2.31 mmol)。移去冰浴室温搅拌，TLC检测4 h反应完全。反应液中加入去离子水(30 mL)，二氯甲烷萃取(50 mL×3)，有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂。得黄色油状液体，正己烷/甲苯重结晶得白色固体4a，收率52%;mp 85~86 ℃; ¹H NMR(400 MHz, DMSO, 80 ℃), δ:7.25(s, 1H, H-2), 7.16(d, 2H, J=8.4 Hz, H-13, 17), 7.10(d, 1H, J=8.0 Hz, H-6), 6.88(d, 1H, J=8.0 Hz, H-5), 6.84(d, 2H, J=8.4 Hz, H-14, 16), 6.04(s, 2H, CH₂O), 3.72(s, 3H, OCH₃), 3.09(s, 3H, NCH₃), 3.64(t, 2H, H-10), 2.98(t, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₂₀H₂₂NO₄[M+H]⁺340.15，实测值:340.19。同法操作，制得化合物4b~4h。

  化合物4b  白色固体，收率66%;mp 84~85 ℃; ¹H NMR(400 MHz, DMSO, 80 ℃), δ:7.60(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.43~7.3 2(m, 5H, H-2, 3, 4, 5, 6), 7.11(dd, 2H, J=8.0, 2.8 Hz, H-13, 17), 6.86(dd, 2H, J=8.0, 2.8 Hz, H-14, 16), 6.29(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.78(s, 3H, OCH₃), 3.63(s, 2H, NCH₃), 3.41(m, 2H, H-10), 2.82(m, 2H, H-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₁₉H₂₂NO₂[M+H]⁺396.16，实测值:296.27。

  化合物4c  淡黄色固体，收率52%;mp 130~132 ℃; ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃, 80 ℃), δ:7.52(d, 2H, J=8.0 Hz, H-3, 5), 7.34(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.15(d, 2H, J=8.0 Hz, H-13, 17), 6.94(d, 2H, J=16 Hz, H-2, 6), 6.84(d, 2H, J=16 Hz, H-14, 16), 6.76(d, 1H, J=16.0 Hz, H-8), 3.79(s, 3H, OCH₃), 3.68(s, 3H, OCH₃), 3.62(t, 2H, H-10), 2.96(s, 3H, NH₃), 2.77(t, 2H, H-11)。ESI-HRMS(m/z)计算值:C₂₀H₂₄NO₃[M+H]⁺326.1751，实测值:326.1748。

  化合物4d  白色絮状固体，收率70%;mp＞300 ℃。¹H NMR(400 MHz, DMSO, 80 ℃), δ:7.74~6.37(m, 10H, H-3, 4, 5, 6, 13, 14, 16, 17, H-7, H-8), 3.81(s, 3H, OCH₃), 3.79(s, 3H, OCH₃), 3.75(s, 3H, OCH₃), 3.29(s, 3H, NCH₃), 3.63(m, 2H, H-10), 2.84(m, 2H, H-11)。ESI-HRMS(m/z)计算值:C₂₁H₂₆NO₄[M+H]⁺356.1856，实测值:356.1851。

  化合物4e  白色固体，收率45%;mp 87~89 ℃; ¹H NMR(400 MHz, DMSO, 80 ℃), δ:7.95~6.76(m, 10H, H-3, 4, 6, 13, 14, 16, 17, CH-H, CHCO), 3.85(s, 3H, OCH₃), 3.84(s, 3H, OCH₃), 3.79(s, 3H, OCH₃), 3.63(m, 2H, H-10), 3.31(s, 3H, NCH₃), 2.84(m, 2H, H-11)。ESI-HRMS(m/z)计算值:C₂₁H₂₆NO₄[M+H]⁺356.1856，实测值:356.1852。

  化合物4f  淡黄色固体，收率86%;mp 89~90 ℃; ¹H NMR(400 MHz, DMSO, 80 ℃), δ:7.29(d, 1H, J=16.0 Hz, H-7), 7.15(s, 1H, H-2), 7.14(d, 2H, J=8.0 Hz, H-13, 17), 7.10(d, J=8 Hz, 1H, H-6), 7.65(d, 1H, J=8 Hz, H-5), 6.82(d, 2H, J=8.0 Hz, H-14, 16), 3.82(s, 3H, OCH₃), 3.80(s, 3H, OCH₃), 3.69(s, 3H, NCH₃), 3.63(t, 2H, J=8 Hz, H-10), 2.79(t, 2H, J=8 Hz, H-11)；¹³C NMR(100 MHz, CDCl₃), δ:166.96(C-9), 158.44(C-15), 150.30(C-3), 148.98(C-4), 141.61(C-7), 130.34(C-12), 129.78(C-13, 17), 128.39(C-1), 121.55(C-8), 114.15(C-6), 113.90(C-14, 16), 111.04(C-2), 109.88(C-5), 55.91(OCH₃), 55.17(OCH₃), 52.03(C-10), 34.43(NCH₃), 34.31(C-11)。ESI-MS(m/z)计算值:C₂₁H₂₆NO₄[M+H]⁺356.19，实测值:356.13。

  化合物4g  淡黄色固体，收率39%;mp 204~205 ℃; ¹H NMR(400 MHz, DMSO，80 ℃), δ:7.34~6.27(m, 10H, H-2, 4, 6, 14, 16, 17, CH-H), 3.84(s, 6H, OCH₃), 3.64(m, 2H, H-10), 3.17(s, 3H, CH₃N), 2.79(m, 2H, H-11)。ESI-HRMS(m/z)计算值:C₂₁H₂₆NO₄[M+H]⁺356.1856，实测值:356.1857。

  化合物4h  白色固体，收率46%;mp 110~115 ℃; ¹H NMR(400 MHz, DMSO, 80 ℃), δ:7.31~6.80(m, 9H, H-2, 6, 13, 14, 16, 17, CH-H), 3.82(s, 6H, OCH₃), 3.71(s, 3H, OCH₃), 3.64(m, 2H, H-10), 3.05(s, 3H, CH₃N), 2.77(m, 2H, H-11)。ESI-HRMS(m/z)计算值:C₂₂H₂₈NO₅[M+H]⁺386.1962，实测值:386.1959。

  1.3   柄果花椒酰胺及其类似物的活性评价

  1.3.1   血小板血浆(PRP)与贫血小板血浆(PPP)的制备

  兔禁食24 h，麻醉，颈总动脉插管取血，109 mmol/L枸橼酸钠抗凝。抗凝血900 r/min离心10 min，取上层乳白色悬浊液为PRP；剩余血液以3500 r/min离心10 min，吸取上清液得PPP。

  1.3.2   不同浓度化合物药液的配制

  称取0.01 mmol化合物，用DMSO与Cremophor的混合溶液稀释至0.5 mL(DMSO的浓度为33%)，超声10 min，使化合物完全溶解，加水配成浓度分别为1.5、3.0、4.5、6 mmol/L的化合物药液储备液；再取各浓度储备液10 μL加入290 μL的PRP，此时待测化合物的浓度分别为50、100、150、200 μmol/L。

  1.3.3   血小板聚集率的测定

  按照Born氏比浊法原理，采用四通道血小板聚集测定仪测试。在测试方杯中加入一个小磁棒，依次加入10 μL药液，290 μL PRP，混匀后预热5 min，加入ADP(300 mol/L)诱导血小板聚集，反应时间为5 min，记录5min内血小板最大聚集率，按照以下公式计算血小板聚集的抑制率(AI)。

  $ AI(\% ) = \frac{{A{R_1}-A{R_2}}}{{A{R_1}}} \times 100\% $

  式中，AI为血小板聚集抑制率，AR₁为对照组最大聚集率，AR₂为给药组最大聚集率。

  2.   结果与讨论

  2.1   化合物的结构表征

  在合成的中间产物及目标化合物中，所得已知化合物结构表征数据与文献报道基本相符，化合物2d、2g、4c、4d、4e、4g和4h是新化合物。其中羟基和胺基均甲基化的4系列产物，虽然TLC监测纯度较高，质谱信息合理，但25 ℃测得的¹H NMR中存在两套谱峰(图 1)。依据文献^{[6, 27]}中对化合物4f升温核磁测试提示，对4系列化合物也进行了变温核磁测试，以化合物4f进行试验，以DMSO为溶剂测定了其¹H NMR(400 MHz)的升温谱图(图 1)。在25 ℃条件下，¹H NMR谱图中存在两组峰，化学位移值δ如表 1。由图 1可知，6.5~7.5的范围内，随着温度的升高，异构体A中的H₂、H₆、H₇和H₈的化学位移向高场方向移动，异构体B中的H₂、H₆、H₇和H₈的化学位移向低场方向移动，最终成为一组峰。这是由于C—N键旋转速度随温度升高变快，导致双键性质不再明显，该范围内的两套峰逐渐合为一套峰，谱图容易解析从而说明3系列化合物实现了酰胺上的甲基化。取其它新化合物测定变温¹H NMR，也出现了上述现象。对该化合物的结构分析推测是由该系列化合物中存在旋转异构现象(图 2)以及酰胺C—N键的双键性质造成的。当3系列的化合物N上经过甲基化反应，增加了其翻转的位阻。低温时，酰胺C—N键的部分双键性质显著^[27]，氮原子与C1、C7、C8和C9共轭处于同一平面，此外N上连有酪胺这种较大的基团限制了C—N键的旋转，造成了低温下两种构型转换较慢，¹H NMR中出现两组峰；升高温度有助于C—N键旋转并且弱化C—N的双键性质，加快了两种异构体的相互转换，¹H谱中逐渐合并成一组谱峰。

  图 1

  

  图 1.  化合物4f的变温核磁

  Figure 1.  Variable-temperature¹H NMR pectra of compound 4f

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  图 2

  

  图 2.  化合物4f的立体异构

  Figure 2.  The stereoisomerism of compound 4f

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  表 1

  

  表 1  化合物4f(DMSO，400 MHz)的核磁数据

  Table 1.  ¹H NMR data of compound 4f(DMSO, 400 MHz)

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  No.	A	B
  2	7.33(1H, s)	7.33(1H, s)
  5	6.95(1H, d, J=8.0 Hz)	6.95 (1H, d, J=8.0 Hz)
  6	7.10(1H, d, J=8.0 Hz)	7.20 (1H, d, J=8.0 Hz)
  7	7.21(1H, d, J=15.3 Hz)	7.41 (1H, d, J=15.3 Hz)
  8	6.72(1H, d, J=15.3 Hz)	7.02 (1H, d, J=15.3 Hz)
  10	3.55(2H, t, J=7.4 Hz)	3.72 (2H, t, J=7.4 Hz)
  11	2.77(2H, t, J=7.4 Hz)	2.77 (2H, t, J=7.4 Hz)
  13, 17	7.16(2H, d, J=8.0 Hz)	7.16 (2H, d, J=8.0 Hz)
  14, 16	6.80(2H, d, J=8.0 Hz)	6.86 (2H, d, J=8.0 Hz)
  NMe	2.96(3H, s)	2.96(3H, s)
  OMe-3	3.78(3H, s)	3.78(3H, s)
  OMe-4	3.82(3H, s)	3.82(3H, s)
  OMe-15	3.63(3H, s)	3.72(3H, s)

  对化合物4c进行单晶培养(二氯甲烷/乙醚)，进行X射线衍射确定结构(CCDC 1572258)，单晶衍射结果表明化合物4c结构正确(图 3，表 2)。因此，结合4系列化合物的质谱数据、化合物4f的核磁信息以及化合物4c的单晶数据，可以判断3系列化合物在THF中，以NaH为碱，CH₃I为甲基化试剂，能够实现酰胺上的甲基化，制得4系列化合物。

  图 3

  

  图 3.  带有原子编号的化合物4c的晶体结构

  Figure 3.  The crystal structure of compound 4c with the atom numbering scheme Displacement ellipsoids are drawn at 30% probability level. H atoms are presented as smallspheres

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  表 2

  

  表 2  化合物4c的晶体结构数据

  Table 2.  The crystal data of compound 4c

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  Formula	C20H23NO3	β/(°)	90
  Fw	325.39	γ/(°)	90
  T/K	296(2)	V/nm3	1.759 1(8)
  Space group	Pca21	Z	4
  cell_setting	Orthorhombic	ρcalcd/(g·cm-3)	1.229
  a/nm	3.782 9(9)	μ/mm-1	0.082
  b/nm	0.606 53(15)	S	1.051
  c/nm	0.766 67(19)	R1/wR2[I＞2σ(I)]	0.048 5/0.132 6
  α/(°)	90

  2.2   抗血小板聚集的构效关系浅析

  由表 3可知，对于ADP诱导的血小板聚集，9个类似物的抑制活性均强于柄果花椒酰胺，其中，化合物2c、4c、4f在200 μmol/L时的抑制率分别为50.0%、60.9%、53.3%，且其抑制率与浓度基本呈正相关。进一步分析这一系列化合物的构效关系发现：对A环上甲氧基取代个数及位置的考察表明，4位甲氧基取代对化合物的活性最为有利(化合物2c相比于化合物2b、化合物4c相比于化合物4b活性均有提高)，3位、4位甲氧基取代的效果次之(化合物2f相比于2c，化合物4f相比于化合物4c活性均有所降低)，3位、4位羟基由亚甲基相连的化合物活性要低于3、4羟基被分别甲基化的化合物；3位、4位和5位甲氧基取代会降低化合物活性(化合物2h相比于化合物2b，化合物4h相比于化合物4b活性均有所降低)，引入2位甲氧基显著降低化合物(化合物2d、3d、4d、2e、3e和4e)活性；甲基化B环15位羟基对化合物活性的影响较小；甲基化酰胺氮原子时，对活性的影响无规律，但对于化合物4b、4c和4f，酰胺氮原子的甲基化增强了化合物的抗血小板聚集活性。

  表 3

  

  表 3  体外抗血小板聚集活性测试

  Table 3.  Antiplatelet aggregation activity test in vitro(n=3)

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  Compd.	Inhibition rate/%				Compd.	Inhibition rate/%
  	50 μmol/L	100 μmol/L	150 μmol/L	200 μmol/L		50 μmol/L	100 μmol/L	150 μmol/L	200 μmol/L
  2a	-a	7.8	11.9	18.0	3e	-a	-a	1.5	5.9
  4a	-a	6.7	13.5	19.0	4e	5.5	6.8	7.4	5.1
  2b	2.1	6.5	40.1	38.2	2f	3.7	12.8	13.2	14.8
  3b	8.9	12.3	12.8	28.6	3f	-a	10.8	12.1	14.8
  4b	4.9	18.3	38.8	45.8	4f	9.5	22.3	45.9	53.3
  2c	2.0	15.0	34.3	50.0	2g	7.5	15.1	28.3	32.8
  4c	17.0	27.5	50.6	60.9	3g	6.4	12.0	28.2	30.6
  2d	-a	-a	11.1	15.7	4g	6.0	10.2	17.9	12.6
  3d	7.4	6.2	15.8	21.0	2h	8.4	5.8	17.9	18.5
  4d	3.3	6.9	7.8	14.6	4h	12.2	20.1	23.1	24.0
  2e	7.1	6.7	12.2	7.4	Clopidogrel bisulfate	-a	-a	-a	—a，b
  a.No inhibition rate; b.in the test system, the inhibition rate of clopidogrel bisulfate at 598 μmol/L was 23.4%.

  3.   结论

  鉴于柄果花椒酰胺的抗血小板聚集药理活性，采用芳香醛缩合、酰化、甲基化等反应，成功制得肉桂酰酪胺类似物，在酰胺甲基化产物的结构解析上做了较充分的研究。基于兔血小板体外聚集实验评价筛选出3个活性较强的化合物2c、4c、4f，初步分析了芳香环上甲氧基取代基的位置、酪胺氮原子和羟基甲基化对化合物活性的影响，为此类化合物抗血小板活性研究提供了一定参考。

  感谢大连理工大学大型设备开放共享测试基金项目的支持。感谢刘季红老师在核磁测试中的帮助，感谢陈平平博士和李学召博士在晶体结构解析中给予的帮助。

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  Scheme 1  Synthesis route of the cinnamoyl-tyramine amide analogues

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  图 1  化合物4f的变温核磁

  Figure 1  Variable-temperature¹H NMR pectra of compound 4f

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  图 2  化合物4f的立体异构

  Figure 2  The stereoisomerism of compound 4f

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  图 3  带有原子编号的化合物4c的晶体结构

  Figure 3  The crystal structure of compound 4c with the atom numbering scheme Displacement ellipsoids are drawn at 30% probability level. H atoms are presented as smallspheres

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  表 1  化合物4f(DMSO，400 MHz)的核磁数据

  Table 1.  ¹H NMR data of compound 4f(DMSO, 400 MHz)

  No.	A	B
  2	7.33(1H, s)	7.33(1H, s)
  5	6.95(1H, d, J=8.0 Hz)	6.95 (1H, d, J=8.0 Hz)
  6	7.10(1H, d, J=8.0 Hz)	7.20 (1H, d, J=8.0 Hz)
  7	7.21(1H, d, J=15.3 Hz)	7.41 (1H, d, J=15.3 Hz)
  8	6.72(1H, d, J=15.3 Hz)	7.02 (1H, d, J=15.3 Hz)
  10	3.55(2H, t, J=7.4 Hz)	3.72 (2H, t, J=7.4 Hz)
  11	2.77(2H, t, J=7.4 Hz)	2.77 (2H, t, J=7.4 Hz)
  13, 17	7.16(2H, d, J=8.0 Hz)	7.16 (2H, d, J=8.0 Hz)
  14, 16	6.80(2H, d, J=8.0 Hz)	6.86 (2H, d, J=8.0 Hz)
  NMe	2.96(3H, s)	2.96(3H, s)
  OMe-3	3.78(3H, s)	3.78(3H, s)
  OMe-4	3.82(3H, s)	3.82(3H, s)
  OMe-15	3.63(3H, s)	3.72(3H, s)

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  表 2  化合物4c的晶体结构数据

  Table 2.  The crystal data of compound 4c

  Formula	C20H23NO3	β/(°)	90
  Fw	325.39	γ/(°)	90
  T/K	296(2)	V/nm3	1.759 1(8)
  Space group	Pca21	Z	4
  cell_setting	Orthorhombic	ρcalcd/(g·cm-3)	1.229
  a/nm	3.782 9(9)	μ/mm-1	0.082
  b/nm	0.606 53(15)	S	1.051
  c/nm	0.766 67(19)	R1/wR2[I＞2σ(I)]	0.048 5/0.132 6
  α/(°)	90

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  表 3  体外抗血小板聚集活性测试

  Table 3.  Antiplatelet aggregation activity test in vitro(n=3)

  Compd.	Inhibition rate/%				Compd.	Inhibition rate/%
  	50 μmol/L	100 μmol/L	150 μmol/L	200 μmol/L		50 μmol/L	100 μmol/L	150 μmol/L	200 μmol/L
  2a	-a	7.8	11.9	18.0	3e	-a	-a	1.5	5.9
  4a	-a	6.7	13.5	19.0	4e	5.5	6.8	7.4	5.1
  2b	2.1	6.5	40.1	38.2	2f	3.7	12.8	13.2	14.8
  3b	8.9	12.3	12.8	28.6	3f	-a	10.8	12.1	14.8
  4b	4.9	18.3	38.8	45.8	4f	9.5	22.3	45.9	53.3
  2c	2.0	15.0	34.3	50.0	2g	7.5	15.1	28.3	32.8
  4c	17.0	27.5	50.6	60.9	3g	6.4	12.0	28.2	30.6
  2d	-a	-a	11.1	15.7	4g	6.0	10.2	17.9	12.6
  3d	7.4	6.2	15.8	21.0	2h	8.4	5.8	17.9	18.5
  4d	3.3	6.9	7.8	14.6	4h	12.2	20.1	23.1	24.0
  2e	7.1	6.7	12.2	7.4	Clopidogrel bisulfate	-a	-a	-a	—a，b
  a.No inhibition rate; b.in the test system, the inhibition rate of clopidogrel bisulfate at 598 μmol/L was 23.4%.

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