English

• 1.   引言

  端粒酶是真核细胞内一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，其能够利用所携带的RNA为模板，并借助自身催化蛋白亚基的逆转录酶活性，将端粒重复序列(TTAGGG)添加至染色体3'末端^[1~3]。在正常情况下，位于染色体3'末端的端粒的长度会随着细胞有丝分裂次数的增加而缩短，最终缩短至临界长度时，细胞就会发生衰老和死亡。但在某些情况下，细胞内端粒酶被异常活化; 此时，端粒酶可以通过添加端粒重复序列的方式维持端粒的长度，从而使细胞保留分裂能力并获得一定程度的永生。研究表明，端粒酶的异常活化在正常细胞中几乎不发生，但在超过85%的肿瘤细胞中被检出。因此，端粒酶的异常活化被认为是细胞癌变的一个重要的细胞生物学异常过程，是肿瘤发生的关键步骤和重要指标^{[4, 5]}。近年来，作为一种潜在的肿瘤标志物和治疗靶点，研究者开发出很多端粒酶的检测方法^[6~12]。Shao等^[7]提出了一种依赖于端粒重复序列中鸟嘌呤电化学响应的端粒酶电化学检测方法; Zhang等^[9]利用端粒重复序列所形成的G-四链体结构能够抵抗核酸外切酶I切割的性质，发展了一种结果裸眼可视的端粒酶比色检测方法; Ling等^[11]利用铂纳米颗粒封装的金属-有机框架材料为信号源，发展了一种可以实现最低每毫升100个肿瘤细胞中端粒酶检测的电化学方法。尽管这些方法可以有效地实现端粒酶的检测，但在灵敏性等方面仍存在一定的缺陷; 这限制了相应方法在生物医学研究和临床诊断中的实际应用。因此，通过引入高效的信号放大技术，发展一种更加灵敏的端粒酶检测方法具有重要意义。

  DNA等核酸分子具有良好的序列识别性能。通过设计适当的序列并控制适当的条件，DNA等核酸分子可以在核酸工具酶或化学熵变化的驱动下进行扩增或自组装，最终形成复杂的核酸结构并实现信号的有效放大^[13~15]。目前，常用的核酸信号放大策略(如聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、切刻内切酶信号放大(NESA)等)大多依赖于核酸工具酶的使用，而这可能会在一定程度上限制信号放大的效率并增加成本。依赖于核酸自组装过程的无酶核酸信号放大策略在近年来逐渐受到关注。杂交链式反应(Hybridization chain reaction，HCR)技术是一种代表性的无酶核酸信号放大策略，其涉及到两个发卡环DNA探针在引发链作用下的交替杂交过程^[16]。HCR技术操作简单、反应条件温和、结果可靠，因而在核酸、蛋白质甚至环境微生物等的检测中都得到了应用，并展现出良好的信号放大能力^[17~23]。

  本研究提出了一种HCR辅助多重信号放大策略，发展了一种高灵敏的端粒酶电化学检测方法。以端粒酶催化引物延伸所形成的DNA序列作为引发链，启动HCR过程，实现信号的第一重放大; 进而通过生物素与链霉亲和素之间的相互作用，引入辣根过氧化物酶(HRP)，实现信号的第二重放大。本方法展现出高灵敏度，可以实现最低每毫升10个HeLa细胞裂解液中端粒酶的灵敏检测。

  2.   实验部分

  2.1   仪器与试剂

  CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器有限公司); XS105PU电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司); MICRO 22冷冻离心机(德国Hettich公司)。

  3-环已胺-1-丙磺酸(CHAPS)、磷酸三氯乙酯(TCEP)、吐温20(Tween-20)、疏基乙醇(MCH)、邻苯二胺(OPD)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、碱性磷酸酶(ALP)、凝血酶(Thrombin)购于Sigma-Aldrich公司; dNTPs购于New England Biolabs公司; 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)购于上海玉博生物科技有限公司; HeLa细胞株、MCF-7细胞株、BT-474细胞株和小肠上皮(IEC)细胞株均购于上海生博生物医学科技有限公司; 牛血清白蛋白(BSA)购于北京鼎国生物技术有限公司。本实验中所用试剂至少为分析纯。DNA探针由上海生工有限公司合成，序列如表 1所示。

  表 1

  

  表 1  实验中使用的DNA探针的序列

  Table 1.  Sequences of DNA probes used in the experiments

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  名称 Name	序列(5'~3') Sequence (from 5' to 3')
  Probe H1	Biotin-(CH)6-TTAGGGTTAGGGATGTGCCCTAACCCTAACCCTAA
  Probe H2	Biotin-(CH)6-CACATCCCCTAACCCTAATTAGGGTTAGGGTTAGGG
  Primer TS	SH-AATCCGTCGAGCAGAGTT

  实验中使用的缓冲液包括: DNA固定缓冲液: 10 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.4)，含1 mmol/L EDTA、10 mmol/L TCEP和0.1 mol/L NaCl; DNA杂交缓冲液: 50 mmol/L磷酸盐缓冲(PBS)溶液(pH 7.4)，含0.5 mol/L NaCl; HRP结合缓冲液: 0.1 mol/L PBS溶液(pH 7.4);细胞裂解缓冲液: 10 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.5)，含1 mmol/L MgCl₂、0.5% CHAPS、10%甘油和0.1 mmol/L PMSF; 引物延伸缓冲液: 20 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.4)，含1.5 mmol/L MgCl₂、63 mmol/L KCl、1 mmol/L EGTA和0.005% Tween-20;电化学测试缓冲液: 0.1 mol/L PBS溶液(pH 8.3)，含1 mmol/L H₂O₂和10 mmol/L OPD; 实验用水为超纯水(18 MΩ cm，Milli-Q系统，美国Millipore公司)。

  2.2   实验方法

  2.2.1   引物链修饰金电极(TS-AuE)的制备

  引物链(TS链)通过5'末端巯基，自组装于金电极表面。处理好的金电极浸入含0.5 μmol/L TS链的DNA固定缓冲液中修饰16 h; 然后，将金电极置于1 mmol/L MCH溶液中避光反应1 h，以封闭电极上的组装位点。

  2.2.2   细胞的培养和裂解

  HeLa等细胞株在37℃、5% CO₂/95%空气条件下，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。在指数生长末期，将培养液以800 r/min离心5 min，分离细胞，用0.1 mol/L无菌PBS溶液(pH 7.2)洗涤两次。随后，使用200 μL裂解缓冲液将细胞重悬，并置于冰上孵育，进行细胞裂解30 min。然后在4℃以12000 r/min离心20 min，获得含有端粒酶的细胞裂解液, 于-80℃保存。

  2.2.3   HCR辅助多重信号放大

  首先将TS链修饰的金电极浸入含有20 μL细胞裂解液和1 mmol/L dNTPs的引物延伸缓冲液中，37℃下反应2 h，以实现端粒酶催化的引物延伸过程。将金电极冲洗干净，置于含有100 nmol/L H1链和100 nmol/L H2链的DNA杂交缓冲液中(使用前，H1和H2链均在95℃加热5 min，并缓慢冷却至室温)，反应2 h。最后，将金电极与链霉亲和素修饰HRP孵育1 h。

  2.2.4   电化学检测

  电化学检测实验在CHI660C电化学工作站上进行，采用三电极系统:金电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极为对电极。使用差分脉冲伏安法(DPV)采集电化学信号，扫描范围为－0.55~－0.35 V。在电化学测试前，溶液中通入氮气15 min。

  3.   结果与讨论

  3.1   实验原理

  图 1为基于HCR辅助多重信号放大策略电化学检测端粒酶的机理和示意图。当不存在端粒酶时，在金电极表面的TS链无法与后续加入的发卡环探针H1或H2链反应，因而无法引发HCR辅助多重信号放大过程。但当检测体系中存在端粒酶时，端粒酶能够催化TS链发生延伸，产生能够与发卡环探针H1部分互补杂交的序列。在此状态下，发卡环探针H1和H2通过支点介导的链置换过程依次组装杂交于电极表面，形成由多条H1和H2链组成的长距DNA双链，实现信号的初步放大。进一步利用H1和H2链末端修饰的生物素与链霉亲和素之间的高亲和力，在电极表面组装链霉亲和素功能化的HRP(SA-HRP)，HRP在H₂O₂存在条件下催化OPD氧化生成2, 3-二氨基吩嗪(DAP)，实现信号的再次放大和端粒酶的灵敏电化学检测。

  图 1

  

  图 1.  基于HCR辅助多重信号放大策略电化学检测端粒酶的示意图

  Figure 1.  Schematic illustration of the mechanism to detect telomerase based on hybridization chain reaction (HCR)-assisted multiple signal amplification

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  3.2   可行性验证和条件优化

  首先考察了所建立的电化学方法的可行性。如图 2所示，当检测体系中加入浓度为每毫升50000个细胞的HeLa细胞裂解液时，DPV图谱在-0.45 V附近存在一个明显的电化学响应峰(曲线a); 而在空白对照实验，DPV图谱中只有一个很小的背景信号峰(曲线b)。此结果说明HeLa细胞裂解液中的端粒酶能够催化引物的延伸，从而引发HCR以及后续的HRP组装和催化过程，证实了所建立的方法用于端粒酶检测的可行性。如图 2c所示，当体系中仅含有细胞裂解液和H1时，无法发生HCR，电化学信号大大减弱。上述结果表明，HCR辅助多重信号放大策略可以有效地提高检测的灵敏性。

  图 2

  

  图 2.  检测每毫升50000个细胞的HeLa细胞裂解液中的端粒酶的DPV图谱。(a)HeLa细胞裂解液+发卡环探针H1和H2; (b)发卡环探针H1和H2; (c) HeLa细胞裂解液+发卡环探针H1

  Figure 2.  Differential pulse voltammetric (DPV) curves upon detecting telomerase in cell lysate of 50000 cells/mL HeLa cells. (a) HeLa cell lysate + hairpin probe H1 and H2. (b) hairpin probe H1 and H2 and (c) HeLa cell lysate +hairpin probe H1 and H2

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  进一步利用所建立的电化学方法对于不同细胞裂解液中的端粒酶进行了检测。如图 3所示，在端粒酶异常活化的肿瘤细胞组(HeLa、MCF-7、BT-474)，DPV响应明显; 在缺乏端粒酶活化的小肠上皮细胞(IEC)组，检测到的DPV响应显著降低。上述结果表明，所建立的电化学方法可以有效地区分端粒酶活性差异明显的正常细胞和肿瘤细胞，进一步证实了本方法用于端粒酶检测的可行性。

  图 3

  

  图 3.  检测(a)MCF-7细胞、(b)HeLa细胞、(c)BT-474细胞和(d)IEC细胞裂解液中的端粒酶时的DPV响应

  Figure 3.  DPV responses obtained upon detecting telomerase in (a) MCF-7, (b) HeLa, (c) BT-474 and (d) IEC cell lysate

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  3.3   端粒酶的电化学检测

  对HCR反应时间进行了优化。如图 4所示，随着HCR过程持续时间的逐渐延长，检测相同浓度端粒酶时得到的DPV响应峰电流值逐渐增加; 当反应时间超过120 min后，DPV响应峰电流值基本保持恒定。因此，最终选择120 min作为HCR过程的反应时间。

  图 4

  

  图 4.  检测HeLa细胞裂解液(50000 cell/mL)中的端粒酶时的DPV响应峰电流随HCR反应时间的变化

  Figure 4.  Dependence of DPV peak current upon detecting telomerase in HeLa cells lysate (50000 cells/mL) on HCR reaction time

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  在最优化的HCR反应时间条件下，对不同浓度的HeLa细胞裂解液中的端粒酶进行了检测。如图 5A所示，随着HeLa细胞浓度的增加，DPV电化学响应特征峰逐渐增强，这说明随着HeLa细胞浓度的增加，细胞裂解液中端粒酶的浓度也逐渐增加，从而引起越来越多的由H1和H2在电极表面通过HCR过程自组装形成长DNA双链，最终固定更多的HRP分子，催化产生更高的电化学响应。图 5B显示了DPV响应峰电流值随HeLa细胞浓度的变化情况。从内插图可见，当HeLa细胞浓度在50~10000 cell/mL范围内时，DPV响应峰电流值随着细胞浓度对数值的增加而线性增大，线性回归方程为I(μA)=-2.58+2.28lgC (cell/mL)，r²=0.970。本方法可以实现每毫升10个HeLa细胞裂解液中端粒酶的检测，与现有的端粒酶检测方法相比具有相近或更低的检出限(表 2)，且3次测定的相对标准偏差(RSD)低于5%，表明本方法应用于细胞裂解液中端粒酶的检测具有良好的可重复性。

  图 5

  

  图 5.  (A) 检测不同浓度HeLa细胞裂解液中的端粒酶时所得到的DPV图谱。从a至i分别为0、10、50、100、500、1000、5000、10000和50000 HeLa cell/mL。(B)DPV响应峰电流值与HeLa细胞浓度之间的关系。插入图为HeLa细胞浓度在10~10000 cell/mL范围内，峰电流值与浓度对数值之间的线性关系

  Figure 5.  (A) DPV responses obtained upon analyzing different concentrations of telomerase in cell lysate of (from a to i) 0, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 and 50000 HeLa cells/mL. (B) Calibration curve for the electrochemical detection of telomerase in cell lysate with different HeLa cell concentration. Inset shows the linear relationship between DPV peak current and logarithm of HeLa cell concentration

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  表 2

  

  表 2  本文建立的端粒酶电化学检测方法与现有检测方法的对比

  Table 2.  Comparison of different assay methods for telomerase detection

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  检测技术 Detection technique	线性范围 Linear range (cell/mL)	检出限 Detection limit (cell/mL)	参考文献 Reference
  电化学 Electrochemical method	1000~6000	1000	[7]
  电化学发光 Electrochemiluminescence	50~1000000	11	[8]
  比色 Colorimetry	0~200	29	[9]
  电化学 Electrochemical method	500~10000000	100	[11]
  电化学 Electrochemical method	50~10000	10	本方法 This method

  考察了所建立的方法应用于端粒酶检测时的选择性。实验结果如图 6所示，同样的条件下，检测浓度为每毫升50000个细胞的HeLa细胞裂解液中端粒酶时得到的DPV响应峰电流值约为7 μA; 而对于非特异性蛋白，最终得到的DPV响应峰电流值仅略高于空白对照组的响应值。这表明本方法用于检测端粒酶具有良好的选择性。

  图 6

  

  图 6.  检测HeLa细胞裂解液中的端粒酶以及其它对照蛋白时的DPV峰电流

  Figure 6.  DPV peak currents for detecting telomerase, alkaline phosphatase (ALP), thrombin, bovine serum albumin (BSA) and blank control

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  4.   结论

  建立了一种基于HCR辅助多重信号放大策略灵敏检测端粒酶的电化学方法，通过端粒酶催化金电极表面的引物序列延伸触发HCR反应，并进一步利用生物素和链霉亲和素之间的相互作用实现HRP在电极表面的固定，最终借助HCR和酶催化信号放大的有效偶联，将端粒酶的活性转化为灵敏的电化学响应信号。实验结果表明，本研究建立的电化学方法检测端粒酶具有良好的灵敏度和选择性，最低可以实现浓度为每毫升10个细胞的HeLa细胞裂解液中端粒酶的检测。同时，本方法可以有效区分肿瘤细胞和正常细胞，具有良好的应用前景。

  
  
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  图 1  基于HCR辅助多重信号放大策略电化学检测端粒酶的示意图

  Figure 1  Schematic illustration of the mechanism to detect telomerase based on hybridization chain reaction (HCR)-assisted multiple signal amplification

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  图 2  检测每毫升50000个细胞的HeLa细胞裂解液中的端粒酶的DPV图谱。(a)HeLa细胞裂解液+发卡环探针H1和H2; (b)发卡环探针H1和H2; (c) HeLa细胞裂解液+发卡环探针H1

  Figure 2  Differential pulse voltammetric (DPV) curves upon detecting telomerase in cell lysate of 50000 cells/mL HeLa cells. (a) HeLa cell lysate + hairpin probe H1 and H2. (b) hairpin probe H1 and H2 and (c) HeLa cell lysate +hairpin probe H1 and H2

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  图 3  检测(a)MCF-7细胞、(b)HeLa细胞、(c)BT-474细胞和(d)IEC细胞裂解液中的端粒酶时的DPV响应

  Figure 3  DPV responses obtained upon detecting telomerase in (a) MCF-7, (b) HeLa, (c) BT-474 and (d) IEC cell lysate

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  图 4  检测HeLa细胞裂解液(50000 cell/mL)中的端粒酶时的DPV响应峰电流随HCR反应时间的变化

  Figure 4  Dependence of DPV peak current upon detecting telomerase in HeLa cells lysate (50000 cells/mL) on HCR reaction time

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  图 5  (A) 检测不同浓度HeLa细胞裂解液中的端粒酶时所得到的DPV图谱。从a至i分别为0、10、50、100、500、1000、5000、10000和50000 HeLa cell/mL。(B)DPV响应峰电流值与HeLa细胞浓度之间的关系。插入图为HeLa细胞浓度在10~10000 cell/mL范围内，峰电流值与浓度对数值之间的线性关系

  Figure 5  (A) DPV responses obtained upon analyzing different concentrations of telomerase in cell lysate of (from a to i) 0, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 and 50000 HeLa cells/mL. (B) Calibration curve for the electrochemical detection of telomerase in cell lysate with different HeLa cell concentration. Inset shows the linear relationship between DPV peak current and logarithm of HeLa cell concentration

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  图 6  检测HeLa细胞裂解液中的端粒酶以及其它对照蛋白时的DPV峰电流

  Figure 6  DPV peak currents for detecting telomerase, alkaline phosphatase (ALP), thrombin, bovine serum albumin (BSA) and blank control

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  表 1  实验中使用的DNA探针的序列

  Table 1.  Sequences of DNA probes used in the experiments

  名称 Name	序列(5'~3') Sequence (from 5' to 3')
  Probe H1	Biotin-(CH)6-TTAGGGTTAGGGATGTGCCCTAACCCTAACCCTAA
  Probe H2	Biotin-(CH)6-CACATCCCCTAACCCTAATTAGGGTTAGGGTTAGGG
  Primer TS	SH-AATCCGTCGAGCAGAGTT

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  表 2  本文建立的端粒酶电化学检测方法与现有检测方法的对比

  Table 2.  Comparison of different assay methods for telomerase detection

  检测技术 Detection technique	线性范围 Linear range (cell/mL)	检出限 Detection limit (cell/mL)	参考文献 Reference
  电化学 Electrochemical method	1000~6000	1000	[7]
  电化学发光 Electrochemiluminescence	50~1000000	11	[8]
  比色 Colorimetry	0~200	29	[9]
  电化学 Electrochemical method	500~10000000	100	[11]
  电化学 Electrochemical method	50~10000	10	本方法 This method

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