English

• 1.   引言

  超氧阴离子自由基(O₂^·-)是细胞内氧气发生单电子还原反应产生的活性氧自由基(ROS)产物^[1]。细胞内多种蛋白质和酶参与了上述反应，包括线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅳ、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、环氧合酶等^[2~4]。产生的O₂^·-在细胞内短暂驻留或传递，随后与细胞内多种还原性物质或生物大分子发生化学反应，进行相关的氧化还原信号调控^[5~7]。例如，O₂^·-在SOD的歧化作用下，生成H₂O₂，通过H₂O₂对NOX蛋白的活性进行调控，进而调控细胞的增殖。当机体产生过量O₂^·-后，可以激活细胞的自噬或凋亡信号通路，导致细胞死亡，最终引发多种疾病^[8]。例如，细胞内的O₂^·-与NO反应，迅速生成ONOO^-，过量的ONOO^-可以激活Caspase凋亡蛋白或引起脂质过氧化，导致细胞的凋亡或坏死^[9]。因此，发展高灵敏、高选择性的O₂^·-检测技术，对O₂^·-的浓度变化进行动态监测，可以揭示O₂^·-浓度的变化规律，剖析相关疾病发生发展的分子机制，发现疾病治疗靶点。

  目前，检测O₂^·-的方法较多，包括ESR^[10]、紫外分光光度法^[11]、高效液相色谱法^[12]、质谱法等^[13]。但是上述方法据需要将细胞或组织离体破碎后进行体外检测，存在样品预处理过程干扰检测结果及检测操作复杂等问题。荧光成像方法具有高灵敏、高时空分辨、易操作等优势^[14~16]。因此为了实现对细胞内O₂^·-真实浓度检测，原位荧光成像分析方法成为最理想的手段。而应用该方法的关键问题是发展检测O₂^·-荧光探针。近年来，研究者设计了多种O₂^·-荧光探针，本文从探针结构特点出发，综述近年检测O₂^·-的分子探针、纳米探针、蛋白探针以及化学发光探针的研究进展，并对O₂^·-探针的设计与应用研究前景进行了展望。

  2.   检测O₂^·-的荧光探针

  2.1   探针结构设计策略

  目前，检测O₂^·-的分子荧光探针结构设计策略如图 1所示，主要分为3种：第一种是分子内电荷转移机制(ICT)。探针与O₂^·-反应后的偶极染料具有ICT激发态，从而增强荧光。第二种是光诱导电子转移机制(PET)。探针与O₂^·-反应后，阻断PET对染料荧光的猝灭从而恢复或增强荧光。第三种是将一个潜在的荧光分子通过与O₂^·-的反应转化为荧光分子，这个过程常包含探针结构的较大变化。

  图 1

  

  图 1.  检测O₂^·-探针的3种设计策略

  Figure 1.  Three design strategies of probes for detection of O₂^·-. PET, photoinduced electron transfer; ICT, intramolecular charge transfer

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  2.2   检测O₂^·-的分子探针

  本课题组^{[7, 17, 18]}分别构建了两种动态、可逆检测活体内O₂^·-的双光子荧光探针1~3 (图 2)。探针均利用咖啡酸酯与O₂^·-的专一性反应，将咖啡酸基团分别共价偶联三聚氰胺基团(1)、苯乙烯基吡嗪基团(2)和荧光素基团(3)。与O₂^·-/谷胱甘肽(GSH)反应后，探针酚醌结构互变导致荧光信号发生可逆变化，均可实现对O₂^·-动态、可逆双光子荧光检测。此外，探针2表现出更优良的双光子荧光性能，探针3实现了对线粒体内O₂^·-和pH值的同时检测。利用双光子荧光成像技术，分别揭示了小鼠肝脏缺血再灌注损伤中O₂^·-浓度升高(1)、O₂^·-浓度升高导致线虫寿命缩短(2)以及线粒体过度融合过程中，O₂^·-和pH值介导的信号转导通路(3)。

  图 2

  

  图 2.  探针1~3结构及其响应机理

  Figure 2.  Structure and sensing mechanism of probe 1-3

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  本课题组^[19]还发展了特异性检测活体线粒体内O₂^·-的双光子荧光探针4 (图 3)。该探针选用苯并噻唑啉为O₂^·-的特异性识别单元，以芴为双光子荧光发色团，阳离子三苯基膦为线粒体靶向基团。探针与O₂^·-反应后，PET效应被阻断，荧光增强。探针4具有灵敏度高、反应速度快、选择性高、光稳定性好等优点。作者利用双光子荧光成像技术，研究在佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)刺激下，HepG2和HeLa细胞及小鼠发炎腹腔线粒体内O₂^·-的浓度变化。此外，基于相同的O₂^·-识别单元(苯并噻唑啉)，本课题组^[20]还发展了检测内质网O₂^·-浓度变化的双光子荧光探针5。该探针以萘二酰亚胺为荧光团，以对甲苯磺酰胺为定位单元, 利用双光子荧光成像发现了糖尿病小鼠内质网内O₂^·-浓度高于正常水平。

  图 3

  

  图 3.  探针4~6结构及其响应机理

  Figure 3.  Structure and sensing mechanism of probe 4-6

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  Li等^[21]设计合成了检测细胞及活体内O₂^·-的双光子荧光探针6 (图 3)。该探针以苯并噻唑啉为O₂^·-的特异性识别单元，以喹啉衍生物为双光子荧光发色团。探针与O₂^·-反应后，π电子共轭程度增加且ICT程度增强，探针荧光强度明显增强。基于探针优良的生物相容性和光学性能，Li等^[21]采用成像揭示了肺炎模型小鼠内源性O₂^·-水平明显高于正常水平。

  Hu等^[22]报道了具有高选择性和高灵敏度优势检测线粒体中O₂^·-荧光探针7 (图 4)。该探针以三氟甲基磺酸酯为识别位点，荧光素为荧光团，带有正电荷的三苯基膦为线粒体定位基团。O₂^·-与三氟甲基磺酸酯进行亲核重排反应后，内酯型低荧光的荧光素结构形成开环共轭的强荧光结构。作者发现，THP-1细胞在静息状态及抗霉素A刺激下，线粒体中O₂^·-浓度上升。Lu等^[23]基于相同的反应机理，设计合成了一个O₂^·-双光子荧光探针8。该探针以具有双光子荧光特性的萘为荧光团，以三氟甲基磺酸酯为识别基团。作者利用双光子荧光显微镜，发现PMA刺激后的小鼠肝脏组织中的O₂^·-水平升高。

  图 4

  

  图 4.  探针7~9结构及其响应机理

  Figure 4.  Structure and sensing mechanism of probe 7-9

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  Si等^[24]利用O₂^·-的亲核性，发展了荧光增强型探针9，以2, 4-二硝基磺酸酯为O₂^·-识别单元，以荧光素为发色团，同时共价偶联线粒体的定位肽链(MLSP)。作者应用探针9进行细胞成像，发现PMA和单壁纳米管刺激的活细胞线粒体中O₂^·-的浓度高于正常水平。

  Chen课题组^{[25, 26]}报道了两个基于七甲川花菁染料的荧光探针10和11，对线粒体O₂^·-和多硫化物(H₂S_n)的连续变化进行可视化分析。利用O₂^·-的氧化性，探针C N单键被氧化生成七甲川花菁荧光团，然而由于PET的荧光猝灭作用，此时花菁荧光只有一定程度增强。随后在H₂S_n作用下，探针结构分别发生两种变化：H₂S_n识别基团中的硝基转变为氨基，PET作用被阻断，导致探针荧光强度进一步增强；或转变为变酮式花菁结构，探针的光谱发生移动。应用该探针，作者实现了活细胞线粒体中外源性和内源性O₂^·-和H₂S_n的荧光成像检测，发现线粒体内过高的O₂^·-会导致细胞癌变。

  Manjare等^[27]设计合成了一种基于BODIPY荧光团，可逆检测细胞内O₂^·-的荧光探针12 (图 5)。该探针以联二硒结构为O₂^·-的识别单元，被O₂^·-氧化后的硒氧产物，阻断了PET效应，实现了探针的荧光增强。利用探针的高灵敏度、高选择性等特点，作者发现PMA刺激的乳腺癌细胞内O₂^·-浓度高于正常水平。

  图 5

  

  图 5.  探针12结构及其响应机理^[27]

  Figure 5.  Structure and sensing mechanism of probe 12 ^[27]

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  Gao等^[28]发展了一个特异性识别O₂^·-的具有聚集诱导发光(AIE)特性的探针13 (5，以二苯氧膦为识别基团，四苯乙烯衍生物为荧光团以及甲酚基作为连接基团。探针识别O₂^·-后，连接基团断键，生成具有AIE性质的四苯乙烯衍生物，发射的荧光由红色转为绿色。该探针具有对O₂^·-荧光响应的高选择性及双通道发射的特点。利用共聚焦荧光成像技术，作者发现炎症诱导或凋亡诱导的肝癌细胞内O₂^·-浓度高于正常水平。

  Liu等^[29]报道了一种动态、可逆检测O₂^·-的双光子荧光探针14 (图 6)。该探针以萘-BODIPY为双光子荧光团，以邻苯二酚为O₂^·-的识别基团。与O₂^·-/谷胱甘肽(GSH)反应后，PET效应导致荧光信号发生可逆变化，实现对O₂^·-动态、可逆双光子荧光检测。基于双光子成像深度深的优势，作者实现了300 μm深度的小鼠肝脏组织O₂^·-成像，发现PMA刺激后小鼠体内O₂^·-浓度明显高于正常水平。

  图 6

  

  图 6.  探针14结构及其响应机理^[29]

  Figure 6.  Structure and sensing mechanism of probe 14 ^[27]

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  Zhang等^[30]设计合成了一种近红外发射检测O₂^·-的双光子荧光探针(图 7)。该探针以二苯基膦酸基团为识别基团，以部花菁-氧杂蒽的衍生物为荧光团。探针与O₂^·-反应后，发生亲核重排反应，荧光增强。作者使用该探针，利用双光子荧光显微镜观察发现，LPS刺激的小鼠体内O₂^·-浓度高于正常水平。

  图 7

  

  图 7.  探针15结构及其响应机理^[30]

  Figure 7.  Structure and sensing mechanism of probe 15 ^[30]

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  2.3   检测O₂^·-的纳米探针

  Gao等^[31]设计合成了一种基于碳量子点的新型荧光探针16 (图 8)，建立了检测O₂^·-的比率荧光分析方法。该探针以二氢乙锭为O₂^·-的识别基团，以碳点为荧光的参比基团。当探针与O₂^·-反应后，二氢乙锭被O₂^·-氧化为乙锭，在625 nm处发出明亮的红色荧光，以红-绿的比率荧光实现对O₂^·-的高灵敏检测。作者将该探针应用于细胞荧光比率成像，发现经LPS刺激后，Hela细胞内O₂^·-的浓度升高，红-绿荧光比值从0.78升高到1.24。

  图 8

  

  图 8.  探针16结构及其响应机理^[31]

  Figure 8.  Structure and sensing mechanism of probe 16 ^[31]

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  Zhou等^[32]发展了一种基于二氧化硅胶体粒子的比率荧光检测O₂^·-的纳米探针17，该探针以二氢乙锭为O₂^·-的识别基团，异硫氰根荧光素为荧光参比基团掺杂二氧化硅胶体粒子，以红-绿的比率荧光变化反映O₂^·-的浓度变化。作者采用ROSUP复合物刺激Hela细胞后，细胞的O₂^·-浓度升高。荧光成像结果表明探针17可以对细胞内O₂^·-浓度的变化进行比率荧光成像。

  本课题组^[33]设计合成了一种高灵敏度的荧光检测O₂^·-的纳米探针18 (图 9)。该探针将2-氯-1, 3-二苯并噻唑林环己烷包覆在Ag@SiO₂的核壳结构表面，利用表面等离子体共振性能，实现了对O₂^·-的高灵敏检测，检出限为0.73 nmol/L。此探针具有高选择性，与O₂^·-反应的荧光强度是与H₂O₂反应的1000倍。利用此纳米材料良好的生物兼容性，对PMA刺激的巨噬细胞内O₂^·-水平的升高进行了荧光成像分析。

  图 9

  

  图 9.  探针18结构及反应机理^[33]

  Figure 9.  Structure and sensing mechanism of probe 18 ^[33]

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  2.4   检测O₂^·-的蛋白探针

  Wang等^[34]构建了一种检测O₂^·-的黄色荧光蛋白探针19 (图 10)，利用该荧光蛋白探针对活细胞的O₂^·-变化进行荧光成像分析，发现了细胞中O₂^·-生成事件，并命名为超氧炫(Superoxide flash)，同时揭示心肌细胞中线粒体ROS兴奋的新机制^[6]。此外，Shen等^[35]还利用O₂^·-炫的特性，对线虫的寿命进行预测，第3天发现, 线虫体内O₂^·-炫出现的频率越低，线虫的寿命越长。

  图 10

  

  图 10.  探针19对线虫体内O₂^·-炫的荧光成像^[34]

  Figure 10.  Confocal visualization of a single-mitochondrion superoxide flash in a rat cardiac myocyte ^[34]

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  2.5   检测O₂^·-的化学发光探针

  本课题组^[36]设计合成了一种超高灵敏检测O₂^·-的化学发光能量共振探针20。该探针以咪唑并吡嗪作为O₂^·-的识别基团和能量供体，以共轭聚合物为能量受体和信号放大基团。咪唑并吡嗪与O₂^·-反应后，生成氨基吡嗪并发出明亮的绿光。该探针具有超高灵敏度，检出限为19.3 pmol/L。利用该探针的优良性能，对细胞和小鼠体内的O₂^·-浓度变化进行化学发光成像分析发现，LPS导致小鼠腹部O₂^·-浓度升高7.9倍。此外，利用该探针对肿瘤模型小鼠和正常小鼠内源性O₂^·-进行成像研究发现，肿瘤部位的O₂^·-浓度比正常组织高3.0倍。本课题组^[37]还发展了一个兼具化学发光和聚集诱导发光特性的O₂^·-探针21，对O₂^·-的识别基团为咪唑并吡嗪，聚集诱导发光部分为四苯乙烯。基于该探针优良的选择性和灵敏度，对肝细胞内源性O₂^·-水平进行了化学发光/荧光双模式成像分析。

  Bag等^[38]设计合成了一种基于BODIPY-鲁米诺的检测O₂^·-的化学发光能量共振探针22 (图 11)。探针以鲁米诺作为O₂^·-的识别基团和能量供体，以BODIPY为能量受体。鲁米诺与O₂^·-反应后，肼键断键，生成邻苯二甲酸衍生物，同时提供能量激发染料BODIPY发光。作者利用化学发光成像发现PMA刺激的脾脏细胞内O₂^·-浓度高于正常水平。

  图 11

  

  图 11.  探针22结构及反应机理^[38]

  Figure 11.  Structure and sensing mechanism of probe 22 ^[38]

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  3.   展望

  小分子、纳米、蛋白和化学发光探针等多种成像工具均可实现细胞及活体内O₂^·-变化的成像分析, 小分子探针具有更好的生物兼容性、稳定性及操作简便的特点；纳米探针在多功能组装方面更具优势；蛋白探针可以实现精准定位；化学发光探针利用化学反应产生的能量激发分子发光，无需外加光源激发，降低了背景荧光而具有超高信噪比。因此，应根据实际检测环境与需求进行探针的设计与应用。

  体内O₂^·-具有浓度动态变化、在细胞各区域广泛分布等特点，尽管目前已有多种探针用于细胞及活体内O₂^·-变化的成像分析，但为使其在相关检测中发挥更大作用，揭示与疾病相关的分子机制，检测O₂^·-的探针还应从以下几个方面进行发展：(1)深组织成像。可以借助双光子、三光子等成像技术，发展具有组织穿透深度的探针，实现活体原位示踪O₂^·-的变化。(2)精准定位成像。由于O₂^·-可分布在细胞多个细胞器内，发挥多种信号转导作用，只有发展多种精准定位不同细胞器的荧光探针，才能深入研究细胞器之间O₂^·-的通讯关系，揭示与疾病相关的分子机制。(3)超高分辨探针。靶向不同细胞器的探针，还应兼具超高分辨的特点，借助超高分辨显微镜(分辨率40 nm)，真正辨析不同细胞器中O₂^·-的相互作用。(4)多组分探针。整合多个识别基团及荧光团于一体的成像材料，可以在同一位置实现多组分的成像检测，尤其是对O₂^·-的上下游信号分子的同时检测。(5)多种探针技术的融合。打破探针类型的分界，将多种类型探针的优势技术融合, 例如结合蛋白的探针精准定位和小分子探针的高稳定性的特点，在细胞内实现蛋白定位与小分子探针的自动偶联。

  构建检测O₂^·-的新型荧光探针仍将是今后生物成像领域的重要研究内容之一，这将为全面理解O₂^·-在相关疾病发生发展过程中的信号转导作用提供重要的新材料和新技术。

  
  
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  36. [36]

      Li P, Liu L, Xiao H, Zhang W, Wang L, Tang B. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138(9):2893-2896 doi: 10.1021/jacs.5b11784

  37. [37]

      Niu J, Fan J, Wang X, Xiao Y, Xie X, Jiao X, Sun C Z, Tang B. Anal. Chem., 2017, 89 (13):7210-7215 doi: 10.1021/acs.analchem.7b01425

  38. [38]

      Bag S, Tseng J C, Rochford, J. Org. Biomol. Chem., 2015, 13(6):1763-1767 doi: 10.1039/C4OB02413C

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  图 1  检测O₂^·-探针的3种设计策略

  Figure 1  Three design strategies of probes for detection of O₂^·-. PET, photoinduced electron transfer; ICT, intramolecular charge transfer

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  图 2  探针1~3结构及其响应机理

  Figure 2  Structure and sensing mechanism of probe 1-3

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  图 3  探针4~6结构及其响应机理

  Figure 3  Structure and sensing mechanism of probe 4-6

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  图 4  探针7~9结构及其响应机理

  Figure 4  Structure and sensing mechanism of probe 7-9

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  图 5  探针12结构及其响应机理^[27]

  Figure 5  Structure and sensing mechanism of probe 12 ^[27]

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  图 6  探针14结构及其响应机理^[29]

  Figure 6  Structure and sensing mechanism of probe 14 ^[27]

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  图 7  探针15结构及其响应机理^[30]

  Figure 7  Structure and sensing mechanism of probe 15 ^[30]

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  图 8  探针16结构及其响应机理^[31]

  Figure 8  Structure and sensing mechanism of probe 16 ^[31]

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  图 9  探针18结构及反应机理^[33]

  Figure 9  Structure and sensing mechanism of probe 18 ^[33]

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  图 10  探针19对线虫体内O₂^·-炫的荧光成像^[34]

  Figure 10  Confocal visualization of a single-mitochondrion superoxide flash in a rat cardiac myocyte ^[34]

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  图 11  探针22结构及反应机理^[38]

  Figure 11  Structure and sensing mechanism of probe 22 ^[38]

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