English

• 1.   引言

  MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其长约19~25个核苷酸，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译^{[1, 2]}。目前已鉴别出1000多种miRNAs，这些miRNAs调控着30%人体的转录后基因表达调控^[3]。研究发现，miRNAs在细胞发育^[4]、增殖^[5]、分化^[6]、细胞凋亡^[7]和造血^[8]中均有重要的作用。研究表明，miRNAs的异常表达与癌症有关，包括慢性淋巴白血病^[9]、结直肠肿瘤^[10]、儿科伯基特淋巴瘤^[11]、肺癌^[12]、大细胞淋巴瘤^[13]、胶质淋巴瘤^[14]及B细胞淋巴瘤^[15]。血液中miRNAs的稳定性，高度保守性、时序性和组织特异性使其成为一类理想的肿瘤标记物^[16]。

  与传统的核酸检测相比，miRNAs其独特的特点，如序列短、家族序列同源性高、低丰度表达，增加了其检测难度。Northern印迹分析^[17]和原位杂交^[18]是miRNAs标准检测方法，但操作复杂、成本高、反应时间长、灵敏度低，无法满足简便快速的检测要求。目前，基于序列扩增反应的miRNAs检测方法，包括反转录PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)^{[19, 20]}、滚环扩增(Rolling circle amplification, RCA)^{[21, 22]}及恒温指数扩增(Isothermal exponential amplification)^{[23, 24]}被广泛应用。其中RT-PCR法，如茎环引物RT-PCR和miRNAs加尾RT-PCR均需要逆转录反应和热循环操作，这增加了实验成本及设计的复杂性。RCA通过恒温聚合酶产生带有重复序列的单链长DNA分子，但该方法耗时。因此，开发简单、灵敏度高、特异性强、低成本的miRNAs分析方法仍然是一个挑战。

  纳米金颗粒(AuNPs)对荧光粒子有超高的淬灭能力，能通过表面等离子增强能量转移效应(Surface plasmon-enhanced energy transfer，SPEET)^{[25, 26]}，其特异的表面等离子共振特征激发了强烈的荧光淬灭行为，如AuNPs能够淬灭一定距离范围内的荧光纳米银簇(AgNCs)。与供体和受体之间的偶极-偶极相互作用的荧光共振能量转移(Förster resonance energy transfer，FRET)类似，AuNPs和AgNCs间SPEET属于偶极-表面相互作用。基于SPEET，本研究采用偶联酶级联反应信号扩增策略，开发了一种简单、快速、无标记的miRNAs的定量检测方法。

  2.   实验部分

  2.1   仪器与试剂

  紫外-可见吸收光谱和荧光光谱测定采用BioTek酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)，琼脂糖凝胶电泳实验采用凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)，PCR实验采用Bio-Rad公司CFX-96实时定量PCR仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)进行。

  实验所用miRNAs由宝生物工程有限公司合成，DNA探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体序列见表 1。Vent DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶(纽英伦生物技术公司); RNase inhibitor(赛默飞世尔科技有限公司); miRNA检测试剂盒、焦碳酸二乙酯(DEPC)、dNTP(宝生物工程(大连)有限公司); AgNO₃(国药集团化学试剂有限公司); NaBH₄(天莲精细化工有限公司); HAuCl₄·3H₂O、十二烷基硫酸钠(SDS)、30%的丙烯酰胺胶液、三羧甲基磷酸(TECP)及全染试剂(Stain-All)、柠檬酸钠(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司); 苯甲基磺酰氟(PMSF，碧云天生物技术有限公司); 人乳腺癌细胞系MDA-MB231、人肝癌细胞系HEPG-2、人宫颈癌细胞系HeLa(中国科学院上海生科院细胞资源中心)。实验所用溶液及缓冲液均由DEPC水配制，所用枪头均无RNA酶，无需处理。

  表 1

  

  表 1  本实验中使用的核酸序列

  Table 1.  Nucleic acids sequences used in this work

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  名称Name	序列* Sequence (5'→3')
  let-7a	UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
  let-7b	UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU
  let-7c	UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU
  let-7d	AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU
  let-7e	UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGU
  let-7f	UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU
  let-7g	UGAGGUAGUAGUUUGUACAGU
  Probe a	AACTATACAACCTACTACCTCAGACTCAACTATACAACCTACTACCTCA-SH
  Probe b	TATCGACCCCCCTCGATAAACATATCAATTGATATGTT
  * miRNA序列双下划线部分代表与靶标let-7a不同的碱基序列。
  * Underlined characters represent the different bases compared with let-7a in the tested miRNAs.

  2.2   实验方法

  2.2.1   纳米金合成及其核酸修饰

  直径20 nm纳米金(AuNPs)合成及其核酸修饰参考文献[27]的方法。100 mL 0.01% HAuCl₄加热至沸腾，在剧烈搅拌下，迅速加入2.5 mL 1%柠檬酸钠溶液，加热沸腾后再持续搅拌加热15 min至溶液变色，停止加热，使溶液自然冷却至室温，AuNPs胶体溶液用0.22 μmol/L滤膜过滤，离心浓缩AuNPs，定量。取80 μL 1.0×10^-8 mol/L的AuNPs溶液，加入12 μL SDS溶液，加水补至120 μL，充分振荡混匀。新鲜配制的6 μL TCEP(5.0×10^-2 mol/L)加入到16 μL Probe a探针(1.0×10^-4 mol/L)，混合均匀，加水定容至60 μL，静置15 min。2 μL Probe a探针和2.0×10^-9 mol/L AuNPs混合后加入5 μL PB缓冲液(1.0×10^-2 mol/L)，室温下静置10 min，加入2.0 mol/L NaCl溶液老化，反应结束后，ddH₂O洗涤浓缩重复5次，加入200 μL DEPC水，4℃保存备用。

  2.2.2   靶标miRNA的检测

  2.0×10^-5 mol/L Probe b置于PCR仪上95℃反应5 min，室温放置20 min，冷却待用; 取1.0×10^-6 mol/L Probe b与0.3×10^-9 mol/L Probe a-AuNP预先混合，室温孵育30 min待用。该实验的反应过程分为A和B混合液，A混合液包括0.5×Nt.BstNBI缓冲液、1.0×10^-6 mol/L Probe b、0.3×10^-9 mol/L Probe a-AuNP溶液、2.5×10^-4 mol/L dNTPs、0.8 U/μL RNase抑制剂、靶标miRNA; B混合液包括1×Vent DNA聚合酶缓冲液、0.06 U/μL Vent DNA聚合酶、0.04 U/μL Nt.BstNBI。将A和B等体积混合，于55℃反应90 min，然后于80 ℃反应5 min，最后冷却至室温。在上述反应液中加入1.2×10^-5 mol/L AgNO₃，剧烈振荡混匀，避光放置20 min; 然后加入1.2×10^-5 mol/L NaBH₄，振荡5 s，避光放置20 min; 最后将反应溶液转移到黑色384微孔板中，在酶标仪上读取580 ~800 nm的荧光发射谱，激发波长为560 nm，读取波长间隔为2 nm。

  2.2.3   非变性聚丙烯酰胺凝胶实验

  电泳样品的制备过程如下: 18 μL样品反应液中加入2 μL 10×上样缓冲液，振荡混匀，离心后，加样到20%非变性聚丙烯酰胺凝胶胶孔内。在100 V的电压下电泳2 h，然后调整电压至120 V，继续电泳4 h。电泳结束后，非变性聚丙烯酰胺凝胶置于20 mL ddH₂O中清洗1次，然后用染色液(0.005% Stain-All，5%甲酰胺，25%异丙醇，1.5×10^-5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8)染色12 h，ddH₂O水清洗显色1 h，最后将凝胶置于白板上，数码相机拍照。

  2.2.4   细胞裂解液中miRNA检测

  人乳腺癌细胞系MDA-MB231、人肝癌细胞系HEPG-2、人宫颈癌细胞系HeLa在含有5% CO₂培养箱中培养，生长条件温度为37℃，培养基为DMEM，添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素。当细胞培养至10⁷个/mL左右时，采用1 mL胰蛋白酶消化细胞2~3 min，以新鲜培养基洗涤3次。细胞裂解液的制备参考文献[28]的方法，首先离心收集培养基中细胞，用PBS缓冲液漂洗细胞3次后，加入细胞裂解液(1.0% Triton X-100，5.0×10^-2 mol/L Tris-HCl，5.0×10^-2 mol/L NaCl，1.0×10^-3 mol/L EDTA，1.0×10^-3 mol/L PMSF)，于冰上放置30 min后，95℃反应孵育5 min，离心，取上清液。

  3.   结果与讨论

  3.1   实验原理

  实验原理如图 1所示。反应体系主要包括如下成分: Probe b-Probe a-AuNP，Vent DNA聚合酶，Nt.BstNBI切刻内切酶和dNTPs。Probe a从3′端至5′端设计如下: 3′端巯基修饰用于组装AuNPs，靶标miRNA互补序列，Nt.BstNBI核酸内切酶酶切序列，及Probe b互补序列。Probe b为荧光AgNCs合成模板。当检测样本中存在靶标miRNA，它与Probe b-Probe a-AuNP复合物上Probe a特异性结合，作为引物激活Vent DNA聚合酶进行特性恒温扩增反应，置换下与Probe a结合的Probe b探针，Nt.BstNBI核酸内切酶特异性识别DNA双链中的特定切割位点，进行单链切刻，具有链置换活性Vent DNA聚合酶继续延伸和置换反应，生成一条与miRNA的序列相同的单链DNA，可作为靶标与Probe b-Probe a-AuNP上Probe a结合，启动新一轮相同反应。恒温反应一定时间后，反应体系中加入AgNO₃和NaBH₄溶液，释放的Probe b能够合成高亮度的荧光AgNCs，反应体系荧光信号显著增强，其信号强度与靶标miRNA的浓度相关。当检测样本中不存在靶标miRNA，Vent DNA聚合酶和Nt.BstNBI核酸内切酶介导的酶级联反应不会发生，Probe b-Probe a-AuNP复合物上Probe b与加入的AgNO₃溶液在NaBH₄还原作用下，合成荧光AgNCs，由于AuNPs与AgNCs间SPEET效应，导致AgNCs的荧光淬灭，反应体系中的荧光信号降低。

  图 1

  

  图 1.  (A) 纳米金与纳米银簇间表面等离子增强能量转移效应示意图; (B)miRNA检测工作原理图

  Figure 1.  (A) Schematic representation of surface plasmon-enhanced energy transfer (SPEET) between gold nanoparticles (AuNPs) and silver nanoclusters (AgNCs). (B) Working principle of miRNA detection

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  3.2   可行性分析

  选择同源性很高的let-7家族中let-7a作为检测靶标，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光谱实验验证本方法的可行性。反应体系中存在靶标let-7a时，在Vent DNA聚合酶和Nt.BstNBI核酸内切酶作用下置换出Probe b-Probe a-AuNP复合物上结合的Probe b，如图 2A中泳道6中方框所示。由图 2B可见，当存在靶标let-7a时，反应体系荧光信号显著增强。当不存在靶标let-7a时，反应体系中荧光信号低，表明AgNCs的荧光被AuNPs淬灭。以上实验结果表明，靶标介导的酶级联反应及AuNPs与AgNCs间具有SPEET效应。

  图 2

  

  图 2.  非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光谱实验的方法可行性验证。(A)M: 500 bp DNA Ladder; 泳道1: let-7a;泳道2: Probe b; 泳道3: Probe a; 泳道4: Probe a-AuNP; 泳道5: Probe a-AuNP和Probe b; 泳道6: Probe b-Probe a-AuNP和let-7a;方框标识释放的Probe b。(B)荧光发射光图谱。

  Figure 2.  Feasibility test using non-denaturing PAGE and fluorescence measurement. (A) M: 500 bp DNA ladder. Lane 1: let-7a, Lane 2: Probe b, Lane 3: Probe a, Lane 4: Probe a-AuNP. Lane 5: Probe a-AuNP and Probe b, Lane 6: Probe b-Probe a-AuNP, and let-7a. The blue rectangle shows the different brightness without and with miRNA. The rectangle shows the position of the dsDNA in the presence of miRNA. (B) Fluorescence spectra of the reaction systems with and without let-7a, respectively.

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  3.3   实验条件优化

  在测试本方法的检测性能前，对反应体系中AuNPs溶液浓度、RNase抑制剂浓度、Vent DNA聚合酶浓度、Nt.BstNBI核酸内切酶浓度和反应温度进行了优化。如图 3A所示，当反应体系中不加AuNPs溶液时，无SPEET效应，AgNCs荧光值很高; 当加入AuNPs溶液时，随浓度增加，AgNCs荧光降低，AuNPs浓度增加至0.3 nmol/L时，AgNCs荧光强度趋于稳定。RNase抑制剂能够提供无RNA酶环境，避免靶标miRNA降解，但含有巯基化合物1, 4二硫苏糖醇(DTT)，其巯基能够与AgNCs形成稳定的Ag-S复合物，对AgNCs的荧光有淬灭效应。此外，高浓度DTT能够破坏AuNPs和巯基修饰Probe a间的AuS键，导致Probe a从AuNPs解离。如图 3B所示，当反应体系中RNase抑制剂浓度为0.8 U/μL，荧光变化比(F/F₀)最高。如图 3CDE所示，Vent DNA聚合酶和Nt.BstNBI核酸内切酶最佳浓度分别为0.06和0.04 U/μL，最佳反应温度为55℃。

  图 3

  

  图 3.  反应条件优化。(A)AuNPs浓度，(B)RNase抑制剂浓度，(C)Vent DNA聚合酶浓度，(D)Nt.BstNBI核酸内切酶浓度，(E)反应温度。误差线表示3次独立实验的标准偏差。

  Figure 3.  Optimization of concentration of AuNPs (A), concentration of RNase inhibitor (B), concentration of Vent DNA polymerase (C), concentration of Nt.BstNBI (D), and reaction temperature (E). Error bars indicate the standard deviations of the three independent experiments.

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  3.4   方法的灵敏度

  在上述优化条件下，在相同的反应体系中加入不同浓度靶标let-7a(0、4.0×10^-11 mol/L、8.0×10^-11 mol/L、2.0×10^-10 mol/L、4.0×10^-10 mol/L、1.0×10^-9 mol/L、1.0×10^-8 mol/L、2.0×10^-8 mol/L、5.0×10^-8 mol/L、1.0×10^-7 mol/L)，考察本方法的灵敏度。实验结果如图 4A所示，随着靶标let-7a浓度增加，AgNCs荧光强度逐渐增加，表明释放出更多的Probe b至反应溶液中。如图 4B所示，当靶标let-7a浓度在4.0×10^-11 ~2.0×10^-8 mol/L范围内，反应体系中荧光强度与let-7a浓度具有较好的线性关系，线性方程为FL=581.9 lgC_let-7a－363.38，相关系数R²=0.985，检出限为2.5×10^-11 mol/L(3σ/S, 其中σ表示空白样品偏差，S为线性方程斜率)。以上实验结果表明，本方法具有应用于miRNA定量分析的潜力。本方法与其它miRNA检测方法的性能比较见表 2。

  图 4

  

  图 4.  检测灵敏性研究。(A)反应体系中不同浓度let-7a的荧光图谱; (B)不同浓度let-7a的荧光信号，插入图: let-7a浓度对数值(4.0×10^-11~2.0×10^-8 mol/L)与荧光强度的线性曲线。误差线表示3个独立实验的标准偏差。

  Figure 4.  Sensitivity investigation for detection of let-7a. (A) Fluorescence spectra of the reaction system after adding different concentrations of let-7a; (B) Plot of fluorescence intensity enhancement versus the concentration of let-7a. Inset represents the base 10 logarithms of let-7a concentration in the range from 4.0×10^-11 mol/L to 2.0×10^-8 mol/L. Error bars indicate the standard deviations of three independent experiments.

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  表 2

  

  表 2  本方法与其它miRNA检测方法的性能比较

  Table 2.  Comparison of the proposed method with other reported miRNA detection methods

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  检测方法 Method	检出限 Limit of detection (mol/L)	时间 Time (h)	参考文献 Reference
  基于磁性氧化石墨烯的化学发光共振能量转移法 Method based on magnetic graphene oxide-assisted chemiluminescence resonance energy transfer	7.9×10-11	1	[29]
  基于WS2的化学发光共振能量转移法 Method based on WS2 nanosheet-assisted chemiluminescence resonance energy transfer	1.8×10-10	3	[30]
  基于聚多巴胺纳米球的化学发光共振能量转移法 Method based on polydopamine-assisted chemiluminescence resonance energy transfer	5.0×10-11	2	[31]
  基于双链特异性核酸酶的纳米金比色法 Colorimetric detection method based on duplex-specific nuclease	1.6×10-11	1.8	[32]
  基于双链特异性核酸酶的荧光检测法 Fluorescence detection method based on duplex-specific nuclease	5.0×10-12	2	[33]
  基于WS2的荧光检测法 Fluorescence detection method based on WS2 nanosheet	0.3×10-12	0.67	[34]
  基于恒温指数扩增反应的纳米金比色法 Colorimetric detection method based on isothermal exponential amplification reaction	4.6×10-14	1	[35]
  基于纳米氧化铜粒子的荧光检测法 Fluorescence detection method based on CuO nanoparticle	5.2×10-13	1.3	[36]
  基于纳米金与纳米银簇间相互作用荧光检测法 Fluorescence detection method based on the interaction between gold nanoparticles and silver nanoclusters	2.5×10-11	2.4	本方法 This method

  3.5   方法的选择性

  选择let-7家族序列研究本方法的特异性，包括let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7g序列，测试两个浓度5.0×10^-8 mol/L和5.0×10^-11 mol/L。如图 5所示，当靶标let-7a存在时，反应体系能够高效扩增，产生显著的AgNCs荧光。当反应体系中存在其他let-7家族序列时，AgNCs产生较弱的荧光，表明当靶标是let-7a的同源序列时，酶级联反应不完全。如图 5B柱状图所示，let-7e、let-7f的荧光变化比(F/F₀)略高于两个碱基不同的let-7b、let-7d、let-7g，但远低于靶标let-7a产生的荧光变化比。上述实验结果表明本方法选择性好，能够区分同源家族序列之间单碱基差异。

  图 5

  

  图 5.  选择性实验。(A)检测5.0×10^-8 mol/L和5.0×10^-11 mol/L let-7家族序列的荧光图谱; (B)检测5.0×10^-8 mol/L和5.0×10^-11 mol/L let-7家族序列的荧光变化比(F/F₀)柱状图。F和F₀分别代表有无靶标序列时的荧光值。误差线表示三个独立实验的标准偏差。

  Figure 5.  Selectivity of the proposed method by testing different target miRNAs. (A) Luorescence spectra of the reaction system after adding different miRNAs. (B) Comparison of relative fluorescence enhancement (F/F₀) for equal concentration (5.0×10^-8 mol/L and 5.0×10^-11 mol/L) of different miRNAs obtained under identical conditions. F and F₀ are the fluorescence intensities at 636 nm in the presence and absence of target, respectively. Error bars indicate the standard deviations of three independent experiments.

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  3.6   实际样品分析

  为了测试本方法应用于实际样本中的性能，定量检测了3种癌细胞细胞裂解液(HeLa、MDA-MB231、HEPG-2)中let-7a，同时采用基于RT-PCR法的商业化试剂盒检测相同细胞裂解液样本中let-7a。如图 6所示，本方法获得的结果与试剂盒结果相似。此外进行了加标回收实验，将6.0×10^-11 mol/L let-7a加到3种细胞裂解液中，回收率为103.2%~106.6%。结果表明，本方法能应用于细胞裂解液中miRNAs的定量分析，具有实际应用的潜力。

  图 6

  

  图 6.  HeLa, MDA-MB231, HEPG-2细胞裂解液中let-7a浓度测定，红色柱状图表示本方法，绿色柱状图表示miRNA商业化检测试剂盒方法。

  Figure 6.  Practical application test of let-7a in cancer cell lysates of of HeLa, MDA-MB231, HEPG-2, bars represent the detected amount of let-7a in cancer lysates of HeLa, MDA-MB231, HEPG-2 with our method (red bars) and commercial method (green bars).

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  4.   结论

  基于AuNPs与AgNCs间表面等离子增强能量转移效应，偶联DNA聚合酶和核酸内切酶介导的恒温扩增反应，实现靶标循环再生的信号放大，建立了生物样本中miRNA的定量检测方法。本方法基于DNA聚合酶和核酸内切酶恒温扩增反应，避免了传统PCR过程对热循环仪器的要求; 操作简便，恒温反应90 min; DNA探针不需要额外的荧光标记，极大地降低了实验成本。

  
  
• 1. [1]

     Rana T M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2007, 8(1):23-36 doi: 10.1038/nrm2085

  2. [2]

     Lee R C, Feinbaum R L, Ambros V. Cell, 1993, 75(5):843-854 doi: 10.1016/0092-8674(93)90529-Y

  3. [3]

     Griffiths-Jones S, Saini H K, Dongen S V, Enright A J. Nucleic Acids Res., 2008, 36(SI):D154-D158

  4. [4]

     Brennecke J, Hipfner D R, Stark A, Russell R B, Cohen S M. Cell, 2003, 113(1):25-36 doi: 10.1016/S0092-8674(03)00231-9

  5. [5]

     Wang Y, Keys D N, Auyoung J K, Chen C. J. Cell Physiol., 2009, 218(2):251-255 doi: 10.1002/jcp.v218:2

  6. [6]

     Dostie J, Mourelatos Z, Yang M, Sharma A, Dreyfuss G. RNA, 2003, 9(2):180-186 doi: 10.1261/rna.2141503

  7. [7]

     Xu P, Vernooy S Y, Guo M, Hay B A. Curr. Biol., 2003, 13(9):790-795 doi: 10.1016/S0960-9822(03)00250-1

  8. [8]

     Chen C Z, Li L, Lodish H F, Bartel D P. Science, 2004, 303(5654):83-86 doi: 10.1126/science.1091903

  9. [9]

     Calin G A, Dumitru C D, Shimizu M, Bichi R, Zupo S, Noch E, Aldler H, Rattan S, Keating M, Rai K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99(24):15524-15529 doi: 10.1073/pnas.242606799

  10. [10]

      Michael M Z, O' Connor S M, van Holst Pellekaan N G, Young G P, James R J. Mol. Cancer Res., 2003, 1(12):882-891

  11. [11]

      Metzler M, Wilda M, Busch K, Viehmann S, Borkhardt A. Genes Chromosomes Cancer, 2004, 39(2):167-169 doi: 10.1002/(ISSN)1098-2264

  12. [12]

      Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, Tomida S, Osada H, Endoh H, Harano T, Yatabe Y, Nagino M, Nimura Y. Cancer Res., 2004, 64(11):3753-3756 doi: 10.1158/0008-5472.CAN-04-0637

  13. [13]

      Eis P S, Tam W, Sun L, Chadburn A, Li Z, Gomez M F, Lund E, Dahlberg J E. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2005, 102(10):3627-3632 doi: 10.1073/pnas.0500613102

  14. [14]

      Chan J A, Krichevsky A M, Kosik K S. Cancer Res., 2005, 65(14):6029-6033 doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-0137

  15. [15]

      Kluiver J, Poppema S, De J D, Blokzijl T, Harms G, Jacobs S, Kroesen B J, Van den Berg A. J. Pathol., 2005, 207(2):243-249 doi: 10.1002/path.v207:2

  16. [16]

      Mitchell P S, Parkin R K, Kroh E M, Fritz B R, Wyman S K, Pogosova-Agadjanyan E L, Peterson A, Noteboom J, O'Briant K C, Allen A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105(30):10513-10518 doi: 10.1073/pnas.0804549105

  17. [17]

      Válóczi A, Hornyik C, Varga N, Burgyán J, Kauppinen S, Havelda Z. Nucleic Acids Res., 2004, 32(22):e175 doi: 10.1093/nar/gnh171

  18. [18]

      Pena J T G, Cherin S L, Rouhanifard S H, Janos L, Markus H, Aleksandra M, Cindy L, Daniel H, Philipp B, Mihaela Z. Nat. Meth., 2009, 6(2):139-141 doi: 10.1038/nmeth.1294

  19. [19]

      Raymond C K, Roberts B S, Garrettengele P, Lim L P, Johnson J M. RNA, 2005, 11(11):1737-1744 doi: 10.1261/rna.2148705

  20. [20]

      Chen C, Ridzon D A, Broomer A J, Zhou Z, Lee D H, Nguyen J T, Barbisin M, Xu N L, Mahuvakar V R, Andersen M R. Nucleic Acids Res., 2005, 33(20):e179 doi: 10.1093/nar/gni178

  21. [21]

      Jonstrup S P, Koch J, Kjems J. RNA, 2006, 12(9):1747-1752 doi: 10.1261/rna.110706

  22. [22]

      Chen A, Ma S, Zhuo Y, Chai Y, Yuan R. Anal. Chem., 2016, 88(6):3203-3210 doi: 10.1021/acs.analchem.5b04578

  23. [23]

      Jia H, Li Z, Liu C, Cheng Y. Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49(32):5498-5501 doi: 10.1002/anie.201001375

  24. [24]

      Yin B C, Liu Y Q, Ye B C. J. Am. Chem. Soc., 2012, 134(11):5064-5067 doi: 10.1021/ja300721s

  25. [25]

      Chen C W, Wang C H, Wei C M, Hsieh C Y, Chen Y T, Chen Y F, Lai C W, Liu C L, Hsieh C C, Chou P T. J. Phys. Chem. C, 2009, 114:799-802

  26. [26]

      Liu J M, Chen J T, Yan X P. Anal. Chem., 2013, 85:3238-3245 doi: 10.1021/ac303603f

  27. [27]

      Vetten M A, Tlotleng N, Tanner Rascher D, Skepu A, Keter F K, Boodhia K, Koekemoer L A, Andraos C, Tshikhudo R, Gulumian M. Part. Fibre Toxicol., 2013, 10:50 doi: 10.1186/1743-8977-10-50

  28. [28]

      Osborn L, Kunkel S, Nabel G J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86(7):2336-2340 doi: 10.1073/pnas.86.7.2336

  29. [29]

      Bi S, M. Chen X, Jia Q, Dong Y. Nanoscale, 2015, 7:3745-3753 doi: 10.1039/C4NR06603K

  30. [30]

      Zhao J J, Jin X, Vdovenko M, Zhang L L, Sakharov I Y, Zhao S L. Chem. Commun., 2015, 51:11092-11095 doi: 10.1039/C5CC04381F

  31. [31]

      Wang J, Yin B C, Ye B C. Biosens. Bioelectron., 2016, 80:366-372 doi: 10.1016/j.bios.2016.02.005

  32. [32]

      Wang J, Li R D, Yin B C, Ye B C. Analyst, 2015, 140:6306-6312 doi: 10.1039/C5AN01350J

  33. [33]

      Degliangeli F, Kshirsagar P, Brunetti V, Pompa P P, Fiammengo R. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (6):2264-2267 doi: 10.1021/ja412152x

  34. [34]

      Xi Q, Zhou D M, Kan Y Y, Ge J, Wu Z K, Yu R Q, Jiang J H. Anal. Chem., 2014, 86:1361-1365 doi: 10.1021/ac403944c

  35. [35]

      Li R D, Yin B C, Ye B C. Biosens. Bioelectron., 2016, 86:1011-1016 doi: 10.1016/j.bios.2016.07.042

  36. [36]

      Li R D, Wang J, Yin B C, Ye B C. Biosens. Bioelectron., 2015, 77:995-1000

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  图 1  (A) 纳米金与纳米银簇间表面等离子增强能量转移效应示意图; (B)miRNA检测工作原理图

  Figure 1  (A) Schematic representation of surface plasmon-enhanced energy transfer (SPEET) between gold nanoparticles (AuNPs) and silver nanoclusters (AgNCs). (B) Working principle of miRNA detection

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  图 2  非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光谱实验的方法可行性验证。(A)M: 500 bp DNA Ladder; 泳道1: let-7a;泳道2: Probe b; 泳道3: Probe a; 泳道4: Probe a-AuNP; 泳道5: Probe a-AuNP和Probe b; 泳道6: Probe b-Probe a-AuNP和let-7a;方框标识释放的Probe b。(B)荧光发射光图谱。

  Figure 2  Feasibility test using non-denaturing PAGE and fluorescence measurement. (A) M: 500 bp DNA ladder. Lane 1: let-7a, Lane 2: Probe b, Lane 3: Probe a, Lane 4: Probe a-AuNP. Lane 5: Probe a-AuNP and Probe b, Lane 6: Probe b-Probe a-AuNP, and let-7a. The blue rectangle shows the different brightness without and with miRNA. The rectangle shows the position of the dsDNA in the presence of miRNA. (B) Fluorescence spectra of the reaction systems with and without let-7a, respectively.

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  图 3  反应条件优化。(A)AuNPs浓度，(B)RNase抑制剂浓度，(C)Vent DNA聚合酶浓度，(D)Nt.BstNBI核酸内切酶浓度，(E)反应温度。误差线表示3次独立实验的标准偏差。

  Figure 3  Optimization of concentration of AuNPs (A), concentration of RNase inhibitor (B), concentration of Vent DNA polymerase (C), concentration of Nt.BstNBI (D), and reaction temperature (E). Error bars indicate the standard deviations of the three independent experiments.

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  图 4  检测灵敏性研究。(A)反应体系中不同浓度let-7a的荧光图谱; (B)不同浓度let-7a的荧光信号，插入图: let-7a浓度对数值(4.0×10^-11~2.0×10^-8 mol/L)与荧光强度的线性曲线。误差线表示3个独立实验的标准偏差。

  Figure 4  Sensitivity investigation for detection of let-7a. (A) Fluorescence spectra of the reaction system after adding different concentrations of let-7a; (B) Plot of fluorescence intensity enhancement versus the concentration of let-7a. Inset represents the base 10 logarithms of let-7a concentration in the range from 4.0×10^-11 mol/L to 2.0×10^-8 mol/L. Error bars indicate the standard deviations of three independent experiments.

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  图 5  选择性实验。(A)检测5.0×10^-8 mol/L和5.0×10^-11 mol/L let-7家族序列的荧光图谱; (B)检测5.0×10^-8 mol/L和5.0×10^-11 mol/L let-7家族序列的荧光变化比(F/F₀)柱状图。F和F₀分别代表有无靶标序列时的荧光值。误差线表示三个独立实验的标准偏差。

  Figure 5  Selectivity of the proposed method by testing different target miRNAs. (A) Luorescence spectra of the reaction system after adding different miRNAs. (B) Comparison of relative fluorescence enhancement (F/F₀) for equal concentration (5.0×10^-8 mol/L and 5.0×10^-11 mol/L) of different miRNAs obtained under identical conditions. F and F₀ are the fluorescence intensities at 636 nm in the presence and absence of target, respectively. Error bars indicate the standard deviations of three independent experiments.

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  图 6  HeLa, MDA-MB231, HEPG-2细胞裂解液中let-7a浓度测定，红色柱状图表示本方法，绿色柱状图表示miRNA商业化检测试剂盒方法。

  Figure 6  Practical application test of let-7a in cancer cell lysates of of HeLa, MDA-MB231, HEPG-2, bars represent the detected amount of let-7a in cancer lysates of HeLa, MDA-MB231, HEPG-2 with our method (red bars) and commercial method (green bars).

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  表 1  本实验中使用的核酸序列

  Table 1.  Nucleic acids sequences used in this work

  名称Name	序列* Sequence (5'→3')
  let-7a	UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
  let-7b	UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU
  let-7c	UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU
  let-7d	AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU
  let-7e	UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGU
  let-7f	UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU
  let-7g	UGAGGUAGUAGUUUGUACAGU
  Probe a	AACTATACAACCTACTACCTCAGACTCAACTATACAACCTACTACCTCA-SH
  Probe b	TATCGACCCCCCTCGATAAACATATCAATTGATATGTT
  * miRNA序列双下划线部分代表与靶标let-7a不同的碱基序列。
  * Underlined characters represent the different bases compared with let-7a in the tested miRNAs.

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  表 2  本方法与其它miRNA检测方法的性能比较

  Table 2.  Comparison of the proposed method with other reported miRNA detection methods

  检测方法 Method	检出限 Limit of detection (mol/L)	时间 Time (h)	参考文献 Reference
  基于磁性氧化石墨烯的化学发光共振能量转移法 Method based on magnetic graphene oxide-assisted chemiluminescence resonance energy transfer	7.9×10-11	1	[29]
  基于WS2的化学发光共振能量转移法 Method based on WS2 nanosheet-assisted chemiluminescence resonance energy transfer	1.8×10-10	3	[30]
  基于聚多巴胺纳米球的化学发光共振能量转移法 Method based on polydopamine-assisted chemiluminescence resonance energy transfer	5.0×10-11	2	[31]
  基于双链特异性核酸酶的纳米金比色法 Colorimetric detection method based on duplex-specific nuclease	1.6×10-11	1.8	[32]
  基于双链特异性核酸酶的荧光检测法 Fluorescence detection method based on duplex-specific nuclease	5.0×10-12	2	[33]
  基于WS2的荧光检测法 Fluorescence detection method based on WS2 nanosheet	0.3×10-12	0.67	[34]
  基于恒温指数扩增反应的纳米金比色法 Colorimetric detection method based on isothermal exponential amplification reaction	4.6×10-14	1	[35]
  基于纳米氧化铜粒子的荧光检测法 Fluorescence detection method based on CuO nanoparticle	5.2×10-13	1.3	[36]
  基于纳米金与纳米银簇间相互作用荧光检测法 Fluorescence detection method based on the interaction between gold nanoparticles and silver nanoclusters	2.5×10-11	2.4	本方法 This method

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