English

• 1.   引言

  稀土元素是一类性质相似的元素-镧系元素及与其同族的稀土类元素的总称，因其独特的4f电子结构而具有特殊的光、电、磁等特性。稀土元素是亲氧元素，其特征配位原子是氧，可与很多含氧的配体，如羧酸、冠醚、β-二酮、含氧的磷类萃取剂等，发生配位作用生成高配位数的稀土配合物^[1]，稀土离子与配体的相互作用还可以改变、修饰和增强稀土元素的特性，因此稀土也被称为神奇的“新材料宝库”^[2]。

  凝血酶(Thrombin，Tb)是一种由Tb前体形成的多功能丝氨酸蛋白酶，位于外源性和内源性凝血途径的共同通路中，不但具有催化纤维蛋白元变成纤维蛋白、促进血液凝固和调控凝血等作用，同时也是肿瘤发生发展过程中的重要因子。早在一百多年前人们就发现了肿瘤与凝血系统的关系^[3]，肿瘤的发生和发展与血液的高凝状态有着双向关系，肿瘤组织自身可以生成凝血因子，引发血液高凝状态，而血栓的发生又可以促进肿瘤组织的恶性进展^{[4, 5]}。因此，Tb活性检测对临床疾病诊断、病程发展、预后以及疗效监测和评估等都具有重要意义。常用的Tb检测方法有化学发光法^[6]、荧光法^[7]、电化学法^[8]、比色法^[9]等，这些方法多采用核酸适配体为识别单元，并需要在适配体上修饰信号分子，过程复杂、耗时且成本较高。因此，发展免标记、高灵敏的Tb传感新方法具有重要意义。

  Tb由A、B两条多肽链组成，其中A链含49个氨基酸残基，B链含259个氨基酸残基，A、B两条链通过一个二硫键相连，Tb可通过酸性氨基酸残基与稀土离子结合。近年来，碳纳米点^[10]、金属纳米簇^[11]等荧光纳米材料发展迅速，稀土离子可通过配位作用与碳纳米材料结合并改变其特性^[12]。本研究利用稀土离子与Tb以及荧光纳米材料之间的相互作用，建立了免标记、灵敏的Tb识别传感方法。石墨烯量子点(GQDs)具有良好的荧光特性，稀土离子Er³⁺可与GQDs表面的羧酸发生配位作用，诱导GQDs聚集而使其荧光猝灭，当样品中存在Tb时，Tb中的氮、氧等原子可与Er³⁺发生配位，从而与GQDs竞争结合Er³⁺，使得GQDs的荧光恢复，据此实现了Tb的灵敏检测，建立了基于Er³⁺介导GQDs荧光开关的Tb传感新方法，为稀土离子在Tb检测中的应用提供了新途径。检测原理如图 1所示。

  图 1

  

  图 1.  基于Er³⁺介导GQDs荧光开关的凝血酶(Tb)检测原理图

  Figure 1.  Schematic illustration of thrombin (Tb) detection based on Er³⁺ mediated fluorescent switch of graphene quantum dots (GQDs)

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  2.   实验部分

  2.1   仪器与试剂

  F-7000荧光光谱仪(日本日立公司); UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司); JEM-2010透射电子显微镜(日本电子株式会社); Tenson 27傅里叶变换红外光谱仪、Multimode-8原子力显微镜(德国布鲁克公司)。

  石墨粉(99.8%，325目，阿法埃莎(中国)化学有限公司); Er₂O₃(99.99%)、凝血酶(美国Sigma-Aldrich公司); 牛血清白蛋白(BSA)、辣根过氧化物酶(HRP)、血红蛋白(Hb)、伴刀豆球蛋白(Con A)、溶菌酶(Lyso)和免疫球蛋白(IgG)购自上海生物科技有限公司。血样取自南昌大学医院。所用试剂均为分析纯，缓冲溶液和储备溶液均使用经Milli-Q超纯水仪处理的超纯水(电阻率≥18.3 MΩ·cm)配制。

  2.2   实验方法

  2.2.1   石墨烯量子点的制备

  采用酸处理的方法制备GQDs^[13]。将1.0 g石墨粉加入到250 mL反应瓶中，再依次加入60 mL浓HNO₃和180 mL浓H₂SO₄，超声2 h后，置于80℃水浴锅中回流24 h; 冷却至室温后，将得到的深棕色混合物稀释至800 mL，用Na₂CO₃中和溶液至pH≈7，浓缩后用1000 Da透析袋透析，即得到GQDs，于4℃保存。

  2.2.2   凝血酶检测

  将10 μL 0.25 mg/mL GQDs、20 μL 150 μmol/L Er³⁺、不同浓度Tb加入到20 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)中，补加超纯水至总体积为200 μL，振荡摇匀后，室温下检测溶液的荧光强度并记录数据。荧光检测条件：激发波长270 nm，入射和出射狭缝宽度均为5 nm，激发电压700 V，荧光测定使用400 μL低散射微量池。

  2.2.3   样本检测

  从南昌大学医院收集人血样品，5000 r/min离心15 min，取上清液，用超纯水稀释100倍，作为待测样本。样品中的Tb检测与2.2.2节类似，将10 μL 0.25 mg/mL GQDs、20 μL 150 μmol/L Er³⁺、不同浓度Tb、20 μL血清加入到20 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)中，补加超纯水至总体积为200 μL，振荡摇匀后，测定荧光光谱。

  3.   结果与讨论

  3.1   GQDs的制备与表征

  GQDs的透射电镜(TEM)图如图 2A所示，所制备的GQDs呈大小均匀的纳米点状，分散性好，平均直径约2.6 nm。采用原子力显微镜(AFM)进一步测定GQDs的层数、厚度及形貌特征(图 2B)，可见GQDs尺寸均一、分散均匀，平均高度约为0.9 nm，表明制备的GQDs大多为单层/双层结构^[14]。由傅里叶红外光谱图(图 2C)可见，GQDs在1056 cm^-1处出现了COH/COC的C—O伸缩振动峰^[15]，在1636 cm^-1处出现了COO^-的伸缩振动峰^[16]，在3457 cm^-1处出现了—OH伸缩振动峰^[17]，表明GQDs表面有丰富的含氧功能基团。图 2D为GQDs的紫外可见吸收光谱和荧光光谱，GQDs在228和280 nm处出现了特征吸收峰，其中228 nm处的吸收峰对应于C＝C键的π-π^*跃迁，280 nm处的吸收峰对应于C＝O键的n-π^*跃迁^[18]。考察了GQDs的最大激发和最大发射光谱及其在不同激发波长下的荧光光谱，当激发波长从250 nm变化到400 nm时，GQDs的荧光发射峰强度呈先增大后减小的趋势，当激发波长为270 nm时，GQDs的荧光发射最强，最大荧光发射波长为456 nm，斯托克斯位移为186 nm。当采用不同光源照射时，GQDs呈现不同颜色，在可见光照射下GQDs呈淡黄色，而在365 nm紫外光照射下则发出强的蓝色荧光。

  图 2

  

  图 2.  (A) GQDs的TEM图，内插图：GQDs的直径分布图; (B)GQDs的AFM图，内插图：GQDs的高度分布图; (C)GQDs的傅立叶变换红外光谱图; (D)GQDs的紫外可见吸收光谱、激发光谱(λ_em=456 nm)和发射光谱图(250~400 nm)。内插图：GQDs在可见光(左)和365 nm紫外光(右)照射下的照片

  Figure 2.  (A) Transmission electron microscope (TEM) image of GQDs. Inset: size distribution of GQDs. (B) Atomic force microscope (AFM) image of GQDs. Inset: height distribution profile of GQDs. (C) Fourier transform infrared spectrum of GQDs. (D) UV-vis absorption spectrum, excitation spectrum (λ_em=456 nm) and emission spectra of GQDs at excitation wavelength from 250 nm to 400 nm. Inset: photographs of GQDs exposed to the natural light (left) and 365 nm ultraviolet light (right) respectively

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  3.2   凝血酶检测机理和可行性分析

  由荧光光谱(图 3A)可见，GQDs有良好的荧光发射性能(曲线a); 当在GQDs溶液中加入Er³⁺时，GQDs的荧光强度大大降低(曲线b)，这是由于GQDs的表面存在大量的羧基和羟基等含氧基团，Er³⁺可以与氧原子发生配位作用，生成高配位数的GQDs/Er³⁺配合物，导致GQDs聚集而荧光减弱; 当在GQDs溶液中加入Tb时，GQDs的荧光基本不变(曲线c); 当在GQDs/Er³⁺中加入Tb时，Tb中的氮、氧等原子可与Er³⁺发生配位，从而与GQDs竞争结合Er³⁺，减弱了GQDs与Er³⁺的作用，使得GQDs的荧光恢复(曲线d)，与文献[12]报道一致。采用TEM表征Tb、GQDs与Er³⁺作用前后的形貌变化。当在GQDs中加入Er³⁺时，GQDs明显地呈网状聚集分布(图 3B); 当将Tb加入到GQDs和Er³⁺溶液中时，GQDs呈分散状态(图 3C)。TEM结果进一步表明Er³⁺可与GQDs作用使GQDs发生聚集，而Tb可以与GQDs竞争结合Er³⁺，减弱了Er³⁺与GQDs的结合，使得GQDs不发生聚集。

  图 3

  

  图 3.  (A) GQDs, GQDs+Er³⁺, GQDs+Tb和GQDs+Er³⁺+Tb的荧光光谱。(B)GQDs+Er³⁺和(C)GQDs+Er³⁺+Tb的TEM图。GQD，Er³⁺和Tb的浓度分别为12.5 μg/mL, 15 μmol/L和20 nmol/L

  Figure 3.  (A) Fluorescence spectra of GQDs, GQDs+Er³⁺, GQDs+Tb and GQDs+Er³⁺+Tb. TEM images of (B) GQDs+Er³⁺ and (C) GQDs+Er³⁺+Tb. concentrations of GQDs, Er³⁺ and Tb are 12.5 μg/mL, 15 μmol/L and 20 nmol/L, respectively

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  3.3   pH值和Er³⁺浓度的影响

  稀土离子通常被视为一种硬酸，在碱性条件下能与硬碱OH^－形成不溶性复合物，从而阻止GQDs与Er³⁺的结合。考察了pH在5.5~10.0之间变化时GQDs、GQDs/Er³⁺和GQDs/Er³⁺/Tb的荧光光谱，由图 4A可见，当pH=7.4时，GQDs/Er³⁺的荧光最低，对Tb的响应灵敏，因此选择pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液进行实验。此外，还考察了Er³⁺浓度对GQDs荧光强度的影响，由图 4B可见，GQDs的荧光随着Er³⁺浓度的增加而减弱，当Er³⁺浓度为15 μmol/L时，GQDs的荧光猝灭率超过90%，因此，Er³⁺最佳浓度选择15 μmol/L。

  图 4

  

  图 4.  (A) pH值和(B)Er³⁺浓度对GQDs荧光强度的影响

  Figure 4.  Effects of (A) pH and (B) Er³⁺ concentration on the fluorescence intensity of GQDs

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  3.4   方法的选择性

  考察了相同浓度的其它蛋白对Tb检测的影响。由图 5可见，GQDs/Er³⁺的荧光很弱(Blank)，将Tb及其它蛋白质分别加入到GQDs和Er³⁺溶液中后，只有Tb使GQDs的荧光显著增强，而其它蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)、辣根过氧化物酶(HRP)、血红蛋白(Hb)、伴刀豆球蛋白(Con A)、溶菌酶(Lyso)和免疫球蛋白(IgG)，对GQDs的荧光均无明显影响，表明本方法对Tb检测具有良好的选择性。

  图 5

  

  图 5.  BSA, Hb, HRP, Con A, Lyso和IgG对Tb检测的选择性。GQDs，Er³⁺和蛋白质的浓度分别为12.5, 15和70 nmol/L

  Figure 5.  Selectivity evaluation for Tb detection against other analytes like bovine serum albumin (BSA), hemoglobin (Hb), horseradish peroxidase (HRP), concanavalin A (Con A), lysozyme (Lyso) and mouse IgG (IgG). The concentrations of GQDs, Er³⁺ and proteins were 12.5, 15 and 70 nmol/L, respectively

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  3.5   凝血酶检测

  在优化的实验条件下，考察了本方法对Tb的检测性能。将10 μL 0.25 mg/mL GQDs、20 μL 150 μmol/L Er³⁺、20 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)和不同浓度的Tb混合，补加超纯水至总体积为200 μL，测量溶液的荧光强度，结果如图 6所示。GQDs的荧光强度与Tb浓度在0.1~6 nmol/L范围内呈良好的线性关系(R²=0.993)，检出限为0.049 nmol/L(S/N=3)。与文献报道的其它方法相比，本方法对Tb的检出限更低(表 1)。

  图 6

  

  图 6.  (A) 在50 mmol/L Tris-HCl的缓冲溶液(pH 7.4)中，12.5 μg/mL GQDs和15μmol/L Er³⁺与不同浓度Tb(0~70 nmol/L)反应后的荧光光谱图。(B)GQDs荧光强度与Tb浓度的关系曲线。内插图：检测Tb线性关系曲线

  Figure 6.  (A) Fluorescence spectra of 12.5 μg/mL GQDs, 15 μmol/L Er³⁺ and different concentrations of Tb (0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 9.0, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 and 70 nmol/L) in 50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl buffer solution. (B) Plot of the fluorescence intensity of GQDs against the concentrations of Tb ranging from 0 to 70 nmol/L. Inset: calibration curve for Tb detection

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  表 1

  

  表 1  不同Tb检测方法比较

  Table 1.  Comparison of different analytical methods for Tb sensing

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  检测方法 Detection method	探针 Probe	线性范围 Linear range (nmol/L)	检出限 Limit of detection (nmol/L)	Ref.
  Fluorescence	GQDs/Er3+	0.1~6.0	0.049	This work
  Fluorescence	3MI-aptamer	－	5	[19]
  Fluorescence	SGI/aptamer/cDNA duplexes	－	1.1	[20]
  PCL	ZnPc(OAr)4@SiO2	0.25~5	0.08	[21]
  Absorbance	Aptamer-AuNP	－	2	[22]
  Colorimetric detection	G-quadruplex/DNAzyme	20~200	20	[23]
  Electrochemical	MB	6~60	3	[24]
  FRET	Carbon nanoparticles	0.5~20	0.18	[25]
  FRET	UCNPs-aptamer and Au NRs	2.5~90	1.5	[26]
  MI: 3-甲基-异黄喋呤; SGI:荧光染料; PCL:光致化学发光; MB:亚甲基蓝; FRET:荧光共振能量转移。 MI: 3-methyl-isoxanthopterin; SGI: SYBR Green I; PCL: photoinduced chemiluminescence; MB: methylene blue; FRET: fluorescence resonance energy transfer.

  3.6   实际样品分析

  为考察本方法的实用性，对实际血液样品进行分析检测。向待测血液样品中分别添加0.50、1.50、3.00和5.00 nmol/L的Tb标准溶液，采用本方法进行检测，结果如表 2所示，回收率为98.0%~105.3%，相对标准偏差为0.6%~4.2%，表明本方法实用性良好。

  表 2

  

  表 2  实际血样中Tb的加标回收检测结果(n=3)

  Table 2.  Recovery test results of Tb in real blood samples (n=3)

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  样品 Sample	添加量 Added (nmol/L)	测定值 Measured (nmol/L)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%)
  1	0.50	0.49	98.0	4.2
  2	1.50	1.58	105.3	0.9
  3	3.00	3.15	105.0	1.0
  4	5.00	4.98	99.6	0.6

  本研究通过强酸氧化剥离方式制备出表面含有大量含氧基团的荧光GQDs，利用GQDs以及Tb与Er³⁺的配位作用，构建了检测Tb的荧光传感方法。结果表明，本方法具有简单、灵敏度高、选择性好以及免标记等优点，可用于实际样品中Tb的分析检测，为复杂样品中Tb的识别传感提供了新思路。

  
  
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• 

  图 1  基于Er³⁺介导GQDs荧光开关的凝血酶(Tb)检测原理图

  Figure 1  Schematic illustration of thrombin (Tb) detection based on Er³⁺ mediated fluorescent switch of graphene quantum dots (GQDs)

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  图 2  (A) GQDs的TEM图，内插图：GQDs的直径分布图; (B)GQDs的AFM图，内插图：GQDs的高度分布图; (C)GQDs的傅立叶变换红外光谱图; (D)GQDs的紫外可见吸收光谱、激发光谱(λ_em=456 nm)和发射光谱图(250~400 nm)。内插图：GQDs在可见光(左)和365 nm紫外光(右)照射下的照片

  Figure 2  (A) Transmission electron microscope (TEM) image of GQDs. Inset: size distribution of GQDs. (B) Atomic force microscope (AFM) image of GQDs. Inset: height distribution profile of GQDs. (C) Fourier transform infrared spectrum of GQDs. (D) UV-vis absorption spectrum, excitation spectrum (λ_em=456 nm) and emission spectra of GQDs at excitation wavelength from 250 nm to 400 nm. Inset: photographs of GQDs exposed to the natural light (left) and 365 nm ultraviolet light (right) respectively

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  图 3  (A) GQDs, GQDs+Er³⁺, GQDs+Tb和GQDs+Er³⁺+Tb的荧光光谱。(B)GQDs+Er³⁺和(C)GQDs+Er³⁺+Tb的TEM图。GQD，Er³⁺和Tb的浓度分别为12.5 μg/mL, 15 μmol/L和20 nmol/L

  Figure 3  (A) Fluorescence spectra of GQDs, GQDs+Er³⁺, GQDs+Tb and GQDs+Er³⁺+Tb. TEM images of (B) GQDs+Er³⁺ and (C) GQDs+Er³⁺+Tb. concentrations of GQDs, Er³⁺ and Tb are 12.5 μg/mL, 15 μmol/L and 20 nmol/L, respectively

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  图 4  (A) pH值和(B)Er³⁺浓度对GQDs荧光强度的影响

  Figure 4  Effects of (A) pH and (B) Er³⁺ concentration on the fluorescence intensity of GQDs

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  图 5  BSA, Hb, HRP, Con A, Lyso和IgG对Tb检测的选择性。GQDs，Er³⁺和蛋白质的浓度分别为12.5, 15和70 nmol/L

  Figure 5  Selectivity evaluation for Tb detection against other analytes like bovine serum albumin (BSA), hemoglobin (Hb), horseradish peroxidase (HRP), concanavalin A (Con A), lysozyme (Lyso) and mouse IgG (IgG). The concentrations of GQDs, Er³⁺ and proteins were 12.5, 15 and 70 nmol/L, respectively

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  图 6  (A) 在50 mmol/L Tris-HCl的缓冲溶液(pH 7.4)中，12.5 μg/mL GQDs和15μmol/L Er³⁺与不同浓度Tb(0~70 nmol/L)反应后的荧光光谱图。(B)GQDs荧光强度与Tb浓度的关系曲线。内插图：检测Tb线性关系曲线

  Figure 6  (A) Fluorescence spectra of 12.5 μg/mL GQDs, 15 μmol/L Er³⁺ and different concentrations of Tb (0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 9.0, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 and 70 nmol/L) in 50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl buffer solution. (B) Plot of the fluorescence intensity of GQDs against the concentrations of Tb ranging from 0 to 70 nmol/L. Inset: calibration curve for Tb detection

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  表 1  不同Tb检测方法比较

  Table 1.  Comparison of different analytical methods for Tb sensing

  检测方法 Detection method	探针 Probe	线性范围 Linear range (nmol/L)	检出限 Limit of detection (nmol/L)	Ref.
  Fluorescence	GQDs/Er3+	0.1~6.0	0.049	This work
  Fluorescence	3MI-aptamer	－	5	[19]
  Fluorescence	SGI/aptamer/cDNA duplexes	－	1.1	[20]
  PCL	ZnPc(OAr)4@SiO2	0.25~5	0.08	[21]
  Absorbance	Aptamer-AuNP	－	2	[22]
  Colorimetric detection	G-quadruplex/DNAzyme	20~200	20	[23]
  Electrochemical	MB	6~60	3	[24]
  FRET	Carbon nanoparticles	0.5~20	0.18	[25]
  FRET	UCNPs-aptamer and Au NRs	2.5~90	1.5	[26]
  MI: 3-甲基-异黄喋呤; SGI:荧光染料; PCL:光致化学发光; MB:亚甲基蓝; FRET:荧光共振能量转移。 MI: 3-methyl-isoxanthopterin; SGI: SYBR Green I; PCL: photoinduced chemiluminescence; MB: methylene blue; FRET: fluorescence resonance energy transfer.

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  表 2  实际血样中Tb的加标回收检测结果(n=3)

  Table 2.  Recovery test results of Tb in real blood samples (n=3)

  样品 Sample	添加量 Added (nmol/L)	测定值 Measured (nmol/L)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%)
  1	0.50	0.49	98.0	4.2
  2	1.50	1.58	105.3	0.9
  3	3.00	3.15	105.0	1.0
  4	5.00	4.98	99.6	0.6

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