β-葡萄糖醛酸酶(GUS)广泛存在于动植物与微生物中，它能够催化β-D-吡喃葡萄糖基底物水解为相关的糖苷配基和D-葡萄糖醛酸[1]。人体内β-葡萄糖醛酸酶水平的升高与一些癌症有关[2, 3]，如结肠癌[4, 5]、肾癌[4]等。此外，由于β-葡萄糖醛酸酶是一种大肠杆菌的特异性酶，所以针对β-葡萄糖醛酸酶的分析所建立的大肠杆菌检测方法也有许多报道[6, 7]。目前，针对β-葡萄糖醛酸酶的检测的方法大多集中在比色法[5, 7]和基于有机荧光探针的化学传感法[8]。然而，比色法常受到基质干扰，导致β-葡萄糖醛酸酶的检测受到影响; 有机探针传感法所用底物的合成通常复杂且耗时。因此，发展简单有效的检测β-葡萄糖醛酸酶的方法非常重要。
内滤效应(IFE)作用机制是由于猝灭剂的吸收光谱与荧光团的激发光谱或发射光谱有重叠作用而引起的荧光猝灭。相比于传统的光物理过程，如共振能量转移[9]、电子转移[10]等，内滤效应过程无需考虑荧光物质与吸收物之间的距离，避免许多繁琐的标记，因此，内滤效应作为一种简单有效的荧光猝灭机制被广泛用于荧光传感分析[11, 12]。内滤效应作用的关键是使猝灭剂的吸收光谱与荧光团的激发光谱或发射光谱最大限度的重叠，从而引起荧光团最大限度的猝灭。由于传统的有机荧光染料的激发或发射光谱确定，很难有吸收物的吸收光谱与它们完全匹配，而量子点(QDs)由于其量子尺寸效应具有光谱可调的性质，近年来广泛用于基于内滤效应的荧光传感分析中[13, 14]。其中，基于荧光内滤效应进行生物酶的检测也有许多报道[15~17]。
本研究发现Mn-ZnS量子点的激发光谱与β-葡萄糖醛酸酶的特异性底物4-硝基苯-β-D-葡糖苷酸(PNPG)的吸收光谱有大幅重叠，而GUS催化分解的底物对硝基苯酚(PNP)的吸收光谱与该量子点的发射光谱无重叠，因此对该量子点磷光发射无影响。此外，Mn-ZnS QDs具有优异的室温磷光性质，可避免生物组织荧光背景感染，适用于生物样品分析[18]。本研究选用BSA包裹的Mn-ZnS量子点作为荧光剂，以GUS底物PNPG为吸收物，建立了一种基于内滤效应的简单、灵敏的磷光检测GUS的方法，并尝试用于大肠杆菌的检测。
F-7000荧光光谱仪(日本日立公司); Fluorolog-3荧光光谱仪与波长为280 nm的Spectral LED灯(Horiba Jobin Yvon公司); UV-1750紫外-可见分光光度计(日本岛津公司); Tecnai G2 F20 S-TWIN透射电子显微镜(美国FEI公司); 超纯水机(成都品诚科技有限公司)。
β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、4-硝基苯-β-D-葡糖苷酸(PNPG)、牛血清蛋白(BSA)、谷氨酸、组氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司); 葡萄糖、抗坏血酸、KCl、CaCl2、MgCl2、FeCl3、CuCl2·2H2O、Mn(Ac)2·4H2O、Zn(Ac)2·7H2O、Na2S·9H2O(成都科龙化学品有限公司); Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH(上海阿拉丁化学试剂有限公司); LB肉汤培养基(鹏世达实验品有限公司)。所用试剂均为分析纯。大肠杆菌(O157:H7)菌种由本校生命科学学院实验室提供。
采用文献[19]的方法，在室温中性条件下快速合成Mn掺杂的ZnS量子点。具体步骤如下：在288 μL超纯水中依次加入40 μL 10 mg/mL BSA溶液，40 μL 1 mmol/L Mn(Ac)2溶液，38 μL 20 mmol/L Zn(Ac)2溶液和50 μL Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.0)，静置5 min。涡旋振荡下，向上述溶液快速加入34 μL 20 mmol/L Na2S溶液，即可得到具有磷光的BSA包裹的Mn-ZnS量子点。
向2 mL离心管中加入200 μL PBS缓冲溶液(pH 6.8)，随后加入100 μL 1 mmol/L PNPG，再加入相应量的超纯水与一系列浓度的β-葡萄糖醛酸酶，终体积为1 mL，摇匀。将上述溶液放置37℃水浴锅中反应5 h，随后依次加入50 μL 0.5 mol/L NaOH和50 μL Mn-ZnS量子点，混匀后在300 nm激发光测定磷光。
称取0.6 g LB肉汤培养基溶于装有30 mL超纯水的锥形瓶中，高温灭菌。待培养基冷却后，用灭菌枪头吸取100 μL大肠杆菌菌种液接种，37℃恒温摇床上振荡培养12 h。吸取1 mL菌液，离心，用无菌水洗涤后注入装有9 mL无菌水试管中，制成10-1倍菌悬液。按上述操作制备10倍递增的菌悬液，取100 μL 10-6倍菌悬液涂布平板计数，平行样做3组。
吸取上述不同浓度菌悬液与0.1 mmol/L底物PNPG在37℃水浴反应5 h，随后依次加入50 μL 0.5 mol/L NaOH和50 μL Mn-ZnS量子点，混匀后在300 nm激发光下进行室温磷光强度测定。
如图 1A所示，Mn-ZnS量子点在250~310 nm处有较强的宽紫外可见吸收带，在300 nm激发波长下，此量子点有窄而强的磷光发射光谱，在600 nm处磷光发射最强。由高分辨透射电镜图(图 1B)可见，BSA包裹的Mn-ZnS量子点为球状，且单分散性良好。此量子点表征结果与文献[18]的结果相符。
本研究选择BSA包裹的Mn-ZnS量子点进行磷光内滤传感，用于检测β-葡萄糖醛酸酶。控制实验表明，GUS的紫外-可见吸收与量子点的激发光谱几乎无重叠(图 2A)，且GUS几乎不影响量子点磷光信号(图 2B)。如图 3A所示，β-葡萄糖醛酸酶底物PNPG的吸收光谱与Mn-ZnS量子点激发光谱有大幅重叠，当体系存在PNPG时，Mn-ZnS量子点的磷光会因二者的内滤效应而猝灭。向体系中加入GUS后，PNPG在该酶的作用下分解为PNP(图 3B)。此产物的吸收光谱(λex: 405 nm)与量子点的激发光谱没有重叠，使得量子点磷光恢复，从而实现对β-葡萄糖醛酸酶的检测。此外，由于Mn-ZnS量子点大的Stokes位移(~300 nm)，PNP的吸收与量子点的发射光谱也无重叠，避免了二次内滤效应对发射能量的吸收所导致的对检测灵敏度的影响。
由图 4A中曲线a~f可见，随着PNPG浓度增大，在磷光峰位置未变情况下，Mn-ZnS量子点磷光强度逐渐下降，说明PNPG可猝灭Mn-ZnS量子点。通常，由于荧光寿命可表示物质激发态信息，所以它的测定对研究能量转移或电子转移导致的荧光猝灭具有意义。而由图 4B可见，即使在PNPG或GUS存在下，该量子点的磷光寿命几乎未改变，表明PNPG对该量子点的猝灭作用并不是基于对激发态的影响。由图 4C可见，Mn-ZnS量子点的猝灭作用强弱是随着激发波长的改变而变化，在300 nm处猝灭作用最强，且其基于激发波长改变的磷光猝灭曲线与PNPG的吸收光谱几乎完全重叠。综上，PNPG对Mn-ZnS量子点的猝灭是因内滤效应(IFE)所致。
分别对反应温度与反应时间进行了优化。本体系下，β-葡萄糖醛酸酶在37℃时活性最高。考察了体系反应时间与Mn-ZnS量子点磷光信号变化关系，结果表明，反应5 h后，信号增长缓慢，因此本研究选择反应5 h后进行GUS的测定。
在优化的实验条件下，各浓度(0~500 U/L)β-葡萄糖醛酸酶与PNPG，Mn-ZnS量子点体系的内滤效应磷光强度恢复效率之间的关系见图 5。如图 5A所示，随着β-葡萄糖醛酸酶加入浓度升高，Mn-ZnS量子点磷光信号随PNPG浓度的降低而逐渐恢复。图 5B显示了Mn-ZnS量子点磷光恢复效率，β-葡萄糖醛酸酶在浓度为10~300 U/L范围内与体系(I－I0)/I0值呈线性关系，线性方程为y=0.0169+0.00414x，相关系数为0.9975，检出限为7 U/L。
如表 1所示，在优化的最优条件下考察了多种生物体常见物质对测定β-葡萄糖醛酸酶的干扰。此时所用β-葡萄糖醛酸酶浓度为100 U/L。从表 1可知，除Cu2+以外，其它共存物质在相应浓度下对β-葡萄糖醛酸酶的活性影响很小。据文献[20, 21]报道，Cu2+会抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性，因此本工作中Cu2+会对检测有较大干扰。
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| 存在物质 Existing substances |
浓度 Concentration |
信号变化 Changed intensity (%) |
| 谷氨酸 Glutamic acid | 100 μmol/L | 5.1 |
| 组氨酸 Histidine | 100 μmol/L | 1.6 |
| 缬氨酸 Valine | 100 μmol/L | -5.3 |
| 异亮氨酸 Isoleucine | 100 μmol/L | -3.3 |
| 天冬酰胺 Asparagine | 100 μmol/L | -3.9 |
| 苏氨酸 Threonine | 100 μmol/L | 1.2 |
| 天门冬氨酸 Arginine | 100 μmol/L | -5.1 |
| 丙氨酸 Alanine | 50 μmol/L | -8.2 |
| 半胱氨酸 L-cysteine | 20 μmol/L | -1.3 |
| 葡萄糖 Glucose | 10 mmol/L | -1.9 |
| 谷胱甘肽 GSH | 1 μmol/L | 1.1 |
| 抗坏血酸 Ascorbic acid | 1 μmol/L | -3.2 |
| K+ | 1 mmol/L | -0.20 |
| Ca2+ | 100 μmol/L | 5.6 |
| Mg2+ | 50 μmol/L | -1.6 |
| Fe3+ | 500 nmol/L | 0.06 |
| Zn2+ | 2 μmol/L | 0.38 |
| Mn2+ | 500 nmol/L | 4.6 |
| Cu2+ | 200 nmol/L | -26.0 |
微生物中，β-葡萄糖醛酸酶是一种大肠杆菌的特异性酶，因此针对GUS的分析所建立的大肠杆菌检测方法已有许多报道[6, 7]。本研究利用大肠杆菌该特性，将Mn-ZnS量子点-PNPG磷光内滤体系用于大肠杆菌浓度的检测，有效地避免了生物荧光背景干扰。内滤体系中不同浓度大肠杆菌所产生的磷光信号响应见图 6。大肠杆菌细胞浓度为107 cell/mL时，体系的磷光信号明显增强，与空白样品可明显区分; 当大肠杆菌浓度增长至108 cell/mL，体系磷光信号大幅度增长，这是由于体系中分泌的大量GUS导致的。上述结果表明，本方法可用于大肠杆菌的的检测，证明了所合成的磷光探针用于大肠杆菌检测的可行性。
本研究建立了一种基于Mn-ZnS量子点-PNPG磷光内滤体系检测β-葡萄糖醛酸酶方法。本方法无需标记，操作简单，可用于大肠杆菌的检测，并有望用于实际样品分析。
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图 1 (A) Mn-ZnS量子点的紫外可见吸收与磷光发射光谱; (B)Mn-ZnS量子点的透射电镜图
Figure 1 (A) UV-Vis spectra and phosphorescent emission of Mn-ZnS quantum dots (QDs); (B) transmission electron microscopic (TEM) image of Mn-ZnS QDs
图 2 GUS对量子点影响示意图：(A)GUS的紫外-可见吸收光谱与Mn-ZnS量子点的激发光谱; (B)1、10、100、1000和10000 U/L浓度的GUS时Mn-ZnS量子点的磷光强度对比图
Figure 2 (A)UV-Vis spectrum of glucuronidase (GUS) and excitation spectrum of the Mn-ZnS QDs; (B) illustration of Mn-ZnS QDs phosphorescence in the presence of different concentrations of GUS (1, 10, 100, 1000 and 10000 U/L)
图 3 基于磷光内滤效应检测GUS的示意图：(A)Mn-ZnS量子点的激发和发射光谱与PNPG的吸收光谱; (B)PNPG与GUS作用后的吸收光谱及与Mn-ZnS量子点的激发和发射光谱的对比
Figure 3 (A) Illustration of detection of GUS based on phosphorescence inner-filter effect (IFE). (A) Excitation and emission spectra of Mn-ZnS QDs and absorption spectrum of PNPG; (B) absorption spectrum of PNPG after reacting with GUS and comparison with excitation and emission spectra of Mn-ZnS QDs
图 4 Mn-ZnS量子点与PNPG之间的内滤效应的证实：(A)Mn-ZnS量子点磷光强度随PNPG浓度的增加的磷光强度猝灭图; (B)Mn-ZnS QDs、Mn-ZnS QDs + PNPG、Mn-ZnS QDs + PNPG + GUS的磷光寿命; (C)Mn-ZnS量子点与存在0.1 mmol/L PNPG的Mn-ZnS量子点溶液在220~340 nm激发下磷光信号比值(曲线a)与PNPG在220~340 nm紫外-可见吸收(曲线b)图
Figure 4 Confirmation of IFE between Mn-ZnS QDs and 4-nitrophenyl-β-D-glucuronide (PNPG): (A) Phosphorescence spectra of Mn-ZnS QDs upon addition of various concentrations of PNPG; (B) phosphorescence decay curves of Mn-ZnS QDs, Mn-ZnS QDs + PNPG, and Mn-ZnS QDs + PNPG + GUS; and (C) comparison of absorption of PNPG and the excitation wavelength-dependent phosphorescence quenching of Mn-ZnS in the presence of 0.1 mmol/L PNPG
图 5 磷光探针对GUS的检测性能：(A)不同GUS浓度下Mn-ZnS量子点-PNPG的磷光光谱; (B)磷光恢复效率与GUS浓度的关系
Figure 5 Analytical performance of the proposed phosphorescent probe for detection of GUS: (A) phosphorescent spectra of Mn-ZnS QDs-PNPG system in the presence of different concentrations of GUS; and (B) calibration curve for detection of GUS
图 6 Mn-ZnS量子点-PNPG体系用于检测大肠杆菌的浓度
Figure 6 Detection of E. coli by Mn-ZnS QDs-PNPG system
表 1 共存物质对体系磷光信号干扰
Table 1. Effect of co-exiting substances on RTP intensity
| 存在物质 Existing substances |
浓度 Concentration |
信号变化 Changed intensity (%) |
| 谷氨酸 Glutamic acid | 100 μmol/L | 5.1 |
| 组氨酸 Histidine | 100 μmol/L | 1.6 |
| 缬氨酸 Valine | 100 μmol/L | -5.3 |
| 异亮氨酸 Isoleucine | 100 μmol/L | -3.3 |
| 天冬酰胺 Asparagine | 100 μmol/L | -3.9 |
| 苏氨酸 Threonine | 100 μmol/L | 1.2 |
| 天门冬氨酸 Arginine | 100 μmol/L | -5.1 |
| 丙氨酸 Alanine | 50 μmol/L | -8.2 |
| 半胱氨酸 L-cysteine | 20 μmol/L | -1.3 |
| 葡萄糖 Glucose | 10 mmol/L | -1.9 |
| 谷胱甘肽 GSH | 1 μmol/L | 1.1 |
| 抗坏血酸 Ascorbic acid | 1 μmol/L | -3.2 |
| K+ | 1 mmol/L | -0.20 |
| Ca2+ | 100 μmol/L | 5.6 |
| Mg2+ | 50 μmol/L | -1.6 |
| Fe3+ | 500 nmol/L | 0.06 |
| Zn2+ | 2 μmol/L | 0.38 |
| Mn2+ | 500 nmol/L | 4.6 |
| Cu2+ | 200 nmol/L | -26.0 |
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