English

• 1.   引 言

  银是人体的微量元素之一,离子形式的银毒性最大^[1]。Ag⁺在水中易被生物富集,进而抑制蛋白的活性,间接影响生物的繁殖^[2]。世界卫生组织规定银在饮用水中的限量为0.05 μg/mL。近年来,由于其特殊的杀菌、催化和光学特性,使银在电子、电镀、感光等行业广泛应用,这些行业的工业废水造成多地水体中的Ag⁺含量不断上升,对环境的污染非常严重^[3]。因此,发展灵敏度高、响应快且抗干扰能力强的Ag⁺检测方法具有重要意义。

  目前,Ag⁺的检测方法有很多,如原子吸收光谱法^[4]、原子发射光谱^[5]、电感耦合等离子体-质谱法^{[6, 7]}、荧光检测^[8]等。这些方法具有较好的特异性、准确性及灵敏性,但都需依赖大型仪器,样品前处理步骤复杂,不适合快速的现场实时检测。近年来,基于DNA检测金属离子的研究引起越来越广泛的关注,并发展了许多传感器。例如赵秋伶^[9]等利用DNA中胸腺嘧啶(T)和Hg²⁺ 的特异性结合检测Hg²⁺。Zhao等^[10]利用Ag⁺能与C形成C-Ag⁺-C结构的特点,发展了一种检测 Ag⁺的方法。1962年,美国科学家Gellert等^[11]发现,一条富含鸟嘌呤(G)的 DNA 短链,在一定条件下可以由自身 4个 G 通过Hoogsteen氢键自组装成G-四分体,多个G-四分体通过π-π堆积作用进而形成 G-四链体DNA (G-quadruplex DNA),其与卟啉铁(Hemin)结合形成具有过氧化物酶催化活性的DNA酶。Hemin嵌入式G-四分体DNA酶的催化性能远比游离的Hemin强,这种新型的DNA酶制成生物传感器后,被广泛地用于生物分子和金属离子分析^[12~16]。Zhou等^[17]在相关研究中发现,Ag⁺的存在可有效阻止碱基G之间Hoogsteen氢键的形成,破坏G-四链体结构,极大地抑制G-四链体-Hemin的酶活性。该方法的建立为Ag⁺快速、高效检测开辟了新思路。然而,这类方法虽然优势明显,但由于传感器没有构建有效的分离体系,在复杂样品检测时容易受到干扰。

  半胱氨酸(Cys)是人体非常重要的一种含巯基的氨基酸,参与蛋白质的合成、解毒和代谢等多种重要的生理功能,许多疾病的发生都与Cys缺乏有关^{[10, 18]},如肾功能衰竭、艾滋病、老年痴呆症、帕金森病等病症。所以,Cys的定量检测一直备受关注^[19~21],是临床分析、法医鉴定以及食品检验中的一项重要指标。

  本探究提出了一种将磁纳米颗粒和分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶相结合检测 Ag⁺和半胱氨酸的方法。与传统的DNA生物传感器分离难相比,用磁纳米颗粒为固相载体,可通过磁分离将检测探针与复杂体系中的干扰组分分离,排除了非特异性干扰,大大降低背景信号,实现了实际样品中Ag⁺ 和半胱氨酸的快速、灵敏、特异的比色分析。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器和试剂

  UV-1800型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);THZ-C-1台式冷冻恒温摇床(太仓市实验设备厂);Milli-Q Reference超纯水器(德国默克密理博公司);pH-2602酸度计(杭州陆恒生物科技有限公司);磁分离架(无锡百运纳米科技有限公司)。

  DNA序列1(5'-GGGTAGGGCGGGAACTTTGATTTTGTTTTATCATGGACGTGCGTG TGAC-C10-Biotin 3')和DNA序列2(5'- GTCACACGCACGTCCATGATAAAA CAAAATCAAAGAAGGGT 3')由上海生工生物工程股份有限公司合成并经HPLC纯化;链霉亲和素功能化的磁纳米颗粒(MNPs,直径100 nm,德国Chemicell公司);Cys含量检测试剂盒购自北京方程佰金科技有限公司(酶标法);氯化血红素(Hemin)、2,2'-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻挫啉-6-磺酸)(ABTS)、30% H₂O₂、二甲亚砜(DMSO)、AgNO₃、Pb(NO₃)₂、MgCl₂、FeCl₃及其它金属离子均购自上海生工生物工程股份有限公司;牛血清白蛋白(BSA,上海华蓝化学科技有限公司); 所用试剂均为分析纯。

  2.2.   实验过程

  2.2.1.   磁纳米颗粒(MNPs)的修饰

  离心管用1% BSA溶液润洗后,加入15 μL包裹链霉亲和素的磁性纳米颗粒(10 mg/mL),同时加入100 μL 柠檬酸盐缓冲液(150 mmol/L NaCl,15 mmol/L柠檬酸三钠,pH=7.0),漩涡搅拌,磁分离后弃上层液,以除去磁珠中多余的叠氮化纳。清洗3次。继续向MNPs中加入柠檬酸盐缓冲液和15 μL DNA 1(100 pmol),37℃条件下振荡反应1 h(180 r/min)。反应结束后用PBS缓冲液(pH=7.4)清洗3次。然后在4℃用100 μL 2% BSA溶液封闭1 h,以减少特异性吸附,命名为MNPs/DNA-1。将上述溶液磁分离,弃上层液后,加入60 μL Tris(10 μmol/L Tris-HAc,0.002% Triton,5 mmol/L KAc,pH=7.0)缓冲溶液和15 μL DNA 2,37℃恒温摇床振荡反应30 min形成互补的双链DNA。将溶液磁分离,弃上层液后,用PBS清洗3次除去多余的DNA 1和DNA 2 ,加入100 μL Tris-HAc缓冲溶液,于4℃下保存待用,命名为MNPs/DNA-1/DNA-2。

  2.2.4.   尿液中Cys的检测

  采用乙腈沉淀法去除尿液中蛋白及其它物质对检测体系的干扰。步骤如下:取1 mL尿液与1 mL乙腈混合,漩涡反应5 min,然后于20℃ 12000 r/min离心10 min,上清液于50℃真空干燥12 h,最后加入100 μL Tris-HAc缓冲溶液,待测。随后的检测流程与2.2.3节一致。

  2.2.3.   Cys的检测

  取10 μL MNPs/DNA-1/DNA-2(1.5 mg/mL),用100 μL PBS清洗1次,再加入100 μL 150 nmol/L Ag⁺,37℃下反应20 min。接着加入100 μL不同浓度的Cys,37℃下反应40 min,然后加入1 μL 100 μmol/L Hemin,随后反应过程同2.2.2节。裂分式G-四链体DNA酶可催化ABTS/H₂O₂产生有色产物,在420nm有最大吸收,因此选择 420 nm 处的吸光度作为测量值。

  2.2.2.   Ag⁺的检测

  取10 μL杂交后的磁纳米颗粒(MNPs/DNA-1/DNA-2,1.5mg/mL),用100 μL PBS清洗1次,再加入100 μL含不同浓度 Ag⁺ 的Tris-HAc缓冲溶液,搅拌均匀后在37℃条件下反应20 min。再加入1 μL 100 μmol/L Hemin,37℃恒温避光反应1 h。磁分离弃上层液,再用100 μL Tris-HAc洗涤1次,除去多余的Hemin和Ag⁺。向其中加入4 mmol/L ABTS和4 mmol/L H₂O₂各50 μL,在37℃条件下反应8 min,磁分离,取上层液进行紫外吸收检测。

  3.   结果与讨论

  3.1.   检测原理

  借助分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶的氧化还原催化特性,以磁纳米颗粒为固相载体,构建了Ag⁺和半胱氨酸的检测体系。此体系使用了两条寡聚核苷酸探针链(DNA 1和DNA 2),DNA 1中3'端带有生物素标记和C10延长链,通过生物素和链霉亲和素的特异性结合,将DNA固定到链霉亲和素修饰的磁纳米颗粒表面。DNA 1和DNA 2 反向互补,两者杂交形成dsDNA,从而使DNA 1的5'端和DNA 2的3'端的两段富G序列相互接近,进而折叠形成分子间裂分G-四链体^[22],hemin 插入G-四链体,导致明显增强的类过氧化物酶的催化活性,能催化ABTS-H₂O₂反应体系并产生有色产物(图 1)。当Ag⁺存在时,Ag⁺可与鸟嘌呤碱基G结合(图 1 插图),这种结合作用有效阻止碱基G之间Hoogsteen氢键的形成,从而破坏G-四链体结构,使催化体系的酶活性显著降低。然而半胱氨酸存在时,巯基与Ag⁺发生强烈的相互作用,将Ag⁺从碱基G上竞争下来,从而促进G-四链体结构的重新形成,使G-四链体-血红素DNA酶催化体系的活性得以恢复,催化ABTS-H₂O₂反应体系,溶液显绿色。以磁纳米颗粒作为分离手段,极大地提高了检测体系的稳定性及提高灵敏度。

  图 1

  

  图 1  DNA酶传感器检测Ag⁺和半胱氨酸原理图

  Figure 1.  Schematic diagram of fabricated DNAzyme sensor for detection of Ag⁺ and cysteine

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  3.2.   传感器检测Ag⁺和Cys 的可行性分析

  由于MNPs本身也具有一定的氧化催化性能^[23],用2% BSA溶液对 MNPs/DNA-1表面做封闭处理后可避免 MNPs 本身催化的影响,还可以有效降低DNA 在磁颗粒表面的非特异吸附^[13]。为验证Ag⁺定量检测的可行性,向MNPs/DNA-1/DNA-2中加入Hemin,其混合溶液能催化ABTS-H₂O₂体系,反应产物ABTS⁺在420 nm处有最大吸收峰,图 2 为不同组分体系传感器的紫外吸收曲线。当加入不同浓度的Ag⁺时,吸收值有不同程度的下降,这是由于ABTS-H₂O₂催化反应急剧减弱,导致反应的有色产物生成量减少。同样,在溶液中加入100 μL 100 nmol/L和40 nmol/L Cys。从图 2可见,420 nm处吸收值上升,说明Cys的巯基与Ag⁺发生强烈的相互作用,将Ag⁺从碱基G上竞争下来,促进G-四链体结构的重新形成,酶活性得以恢复。

  图 2

  

  图 2  不同组分体系中传感器的紫外吸收曲线(C_Hemin: 100 μmol/L)

  Figure 2.  UV absorption curves of biosensor in the presence of different components (C_Hemin: 100 μmol/L)

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  3.3.   实验条件的优化

  根据产品说明书可知,100 μL(含1 mg MNPs) MNPs可以结合150 pmol生物素化探针,本实验取出的15 μL 包裹链霉亲和素的MNPs可以结合22.5 pmol生物素化探针。考察了修饰体系中DNA 1的量为25,50,75,100,125和150 pmol时对G-四链体DNA酶催化性能的影响(不加Ag⁺)。结果如图 3A所示,随着修饰体系中DNA序列1的量增加,吸光值也不断增加。当修饰时DNA 1的量为100 pmol时,MNPs表面的探针固定量达到最好。ABTS和H₂O₂按照1:1比例发生氧化还原反应,参照文献^[24],实验中ABTS和H₂O₂的浓度均为2 mmol/L。由于G碱基之间氢键的形成受pH值影响,本研究考察了加入Ag⁺后缓冲溶液pH值对检测性能的影响。从图 3B可见,当pH 7.0时,体系的A_{420 nm} 达到最小,说明此时体系的酶活性最低。因此,本实验选取pH=7.0的Tris-HAc缓冲液。选择6个温度(20℃,25℃,30℃,35℃,40℃,45℃),对DNA酶催化反应的最适温度进行了考察。随着DNA酶催化反应温度升高,体现在反应体系ΔA_{420 nm}增加(ΔA_{420 nm}=A₀-A₁,A₀,A₁分别为未加Ag⁺前和加Ag⁺后的吸光度),当温度达到35℃~40℃时,ΔA_{420 nm}达到最大,可能的原因在于当反应温度为37℃时,G-四链体DNA酶的活性最高,因此选择37℃为最适温度(图 3C )。

  图 3

  

  图 3  (A) DNA 1的量对A_{420 nm}的影响;(B)pH值对A_{420 nm}的影响;(C)DNA酶催化温度对ΔA_{420 nm}的影响 (C_Ag⁺: 150 nmol/L)

  Figure 3.  (A) Influence of quantities of DNA 1 on A_{420 nm},(B) Influence of pH on A_{420 nm},(C) Influence of DNAzyme catalyzing temperature on ΔA_{420 nm} (C_Ag⁺: 150 nmol/L)

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  此外,还考察了Ag⁺及与Cys反应时间对检测性能的影响。从图 4A可见,DNA酶传感器与Ag⁺反应时间从5 min延长到20 min时,反应体系的吸光值A_{420 nm}降低,说明随着时间的延长,Ag⁺ 破坏G-四链体DNA酶结构越多,催化性能降低,当反应时间达到20 min时体系的吸光值A_{420 nm}达到最低。而传感器与Cys分别反应10~40 min时,体系的吸光值A_{420 nm}随着反应时间的增加而增大,当反应时间到40 min时,体系吸光值达到最高 (图 4B)。所以,选择20和40 min分别作为Ag⁺和Cys的反应时间。

  图 4

  

  图 4  反应时间对A_{420 nm}的影响(A,150 nmol/L Ag⁺,B,100 nmol/L Cys)

  Figure 4.  Influence of DNAzyme reaction time on A_{420 nm} (A,150 nmol/L Ag⁺,B,100 nmol/L Cys)

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  3.4.   定量检测

  3.5.   方法的选择性

  3.6.   实际样品的检测

  分别对湘江水,湖水,自来水采样,进行Ag⁺的加标回收实验。水样先经0.22 μm 滤膜过滤,以除去不溶性物质,随后加入一定浓度的Ag⁺,用本方法对Ag⁺进行定量分析。由表 1 可见,自来水、湖水、湘江水的Ag⁺含量很低,当加入20 nmol/L Ag⁺,Ag⁺的回收率为94.5%~105.5%,相对标准偏差为1.3%~2.6%,说明此传感器能够检测河水与自来水样品中微量的Ag⁺。根据《国家生活饮用水卫生标准》GB 5749-2006 规定,饮用水中Ag⁺的限量为0.05 μg/mL,因此此DNA酶传感器可满足国家限量标准的要求。同时,采用Cys含量检测试剂盒(酶标法)检测了人尿液样本中半胱氨酸的含量,结果见表 2。3 个实际样品的测试结果和试剂盒检测值基本一致,标准偏差为3.5%~4.8%,结果令人满意。说明设计的G-四链体 DNA 酶生物传感器检测半胱氨酸的方法是可行的。

  表 1

  

  表 1  水体样品中Ag⁺分析结果及加标回收实验

  Table 1.  Analytical results of Ag⁺ in water samples and recovery tests

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  Sample	Ag+ in samples (nmol/L)	Added (nmol/L)	Total found (nmol/L)	Average recovery (%, n=5)	RSD (%, n=5)
  自来水 Tap water	未发现 Not found	20	18.90	94.5	2.1
  湖水 Lake water	未发现 Not found	20	21.1	105.5	2.6
  湘江水 Xiangjiang river	未发现 Not found	20	19.48	97.4	1.3

  表 2

  

  表 2  人尿液样品分析结果

  Table 2.  Analytical results of three human urine samples

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  Sample	L-cysteine in samples (nmol/L)	Found (mean±SD) (nmol/L)	Recovery(%, n=5)	RSD(%, n=5)
  1	20.50	21.0 ± 1.0	102.4	4.8
  2	35.2	34.3 ± 1.2	97.5	3.5
  3	52.0	54.5 ± 2.3	104.8	4.2

  3.4.1.   Ag⁺的定量检测 在优化条件下,考察了基于G-四链体DNA酶的Ag⁺ 传感器对不同浓度Ag⁺

  (0~150 nmol/L)的响应。如图 5所示 ,随着Ag⁺浓度增大,反应体系的A_{420 nm}不断降低。当Ag⁺浓度在0.5~100 nmol/L之间时,呈良好的线性关系,回归方程为A_{420 nm}= 0.237-0.001 C_Ag⁺,线性相关系数R=0.9967。本方法的检出限为0.2 nmol/L(3σ),低于其它基于酶催化的C-Ag⁺-C 传感器(30 nmol/L)^[17]、基于荧光标记DNA 的银离子检测法(60 nmol /L) ^[25]以及胶体金法(10 nmol /L) ^[26]等方法。

  图 5

  

  图 5  (A)Ag⁺浓度在0~150 nmol/L时,体系的吸收光谱图。 Ag⁺浓度(nmol/L): (1) 0.0 (2) 0.5 (3) 1.0 (4) 5.0 (5) 10 (6) 20 (7) 40 (8) 60 (9) 80 (10)100 (11)150 (pH=7.0),(B) 线性关系图

  Figure 5.  (A) Absorption curves of system at Ag⁺ concentrations of : (1) 0.0,(2) 0.5,(3) 1.0,(4) 5.0,(5) 10,(6) 20,(7) 40,(8) 60,(9) 80,(10) 100 and (11)150 nmol/L (pH=7.0),(B) Linear calibration curve

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  3.4.2.   Cys的定量检测

  在优化实验条件下,考察了传感器对不同浓度Cys的响应情况(图 6)。从图 6A可见,随着Cys浓度的增大,反应体系的A_{420 nm}不断增加。当Cys浓度在0.1~80 nmol/L之间时,呈良好的线性关系,回归方程为A_{420 nm}=0.121+0.002C_Cys,线性相关系数R=0.99427(图 6B)。以空白的3倍标准偏差除以标准曲线的斜率得到本方法的检出限为0.04 nmol/L,说明本研究的DNA酶生物传感器能够有效检测低浓度的Cys,可用于实际样品的快速检测。与其它半胱氨酸检测方法比较,如基于金纳米颗粒的半胱氨酸双信号传感器(检出限10 nmol/L^[27]、检出限8.0 nmol/L^[28])、基于量子点的荧光传感器(检出限3.8 nmol/L^[29])、基于DNAzyme/ABTS-H₂O₂体系的比色传感器(50 nmol /L)^[17]),本方法可以检测复杂试样体系,而且具有较高检测灵敏度。

  图 6

  

  图 6  (A)不同半胱氨酸浓度时体系吸收曲线图: (1) 0.0,(2) 0.1,(3) 1.0,(4) 5.0,(5) 10,(6) 20,(7) 40,(8) 60,(9) 80,(10)100 (pH=7.0),(B)线性关系图(C_Ag⁺: 150 nmol/L)

  Figure 6.  (A) Absorbance curves of cys concentration from 0 to 100 nmol/L: (1) 0.0,(2) 0.1,(3) 1.0,(4) 5.0,(5) 10,(6) 20,(7) 40,(8) 60,(9) 80,and (10)100 nmol/L (pH=7.0),(B) Linear calibration curve (C_Ag⁺: 150 nmol/L)

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  3.5.1.   Ag⁺的选择性检测

  选择了9种金属离子(Mg²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺,Pb²⁺,Ni²⁺,Fe³⁺,Co²⁺,Cu²⁺,Cr³⁺),其中Ag⁺浓度为100 nmol/L,干扰离子的浓度均为10μmol/L,分别检验了它们对Ag⁺检测的干扰。如图 7所示,在无Ag⁺存在条件下,体系的吸光值未降低(白色柱型);向体系中同时加入Ag⁺和上述其它金属离子时(黑色柱型),此传感体系的吸收值和只加入Ag⁺的吸收值相差不多,相对标准偏差在1.6%~3.7%之间。这表明水样中存在的大量共存离子不影响传感器对Ag⁺的高选择性分析。

  图 7

  

  图 7  Ag⁺传感器的特异性(C_Ag⁺: 100 nmol/L)

  Figure 7.  Selectivity of Ag⁺-sensing system(C_Ag⁺: 100 nmol/L)[]

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  3.5.2.   Cys的选择性检测

  为了检验传感体系对Cys的选择性,选择了其它常见的氨基酸进行检测,其中Cys的浓度为 100 nmol/L,其它氨基酸的浓度为1 μmol/L,如图 8。在最优条件下,半胱氨酸的加入使得吸收值明显增大;而其它氨基酸单独存在时,对体系的A_{420 nm}基本没有影响,相对标准偏差在2.6%~5.8%之间。说明用此传感器检测Cys具有很高的选择性。

  图 8

  

  图 8  半胱氨酸传感器的特异性(Ccys: 100 nmol/L)

  Figure 8.  Selectivity of cys-sensing system(Ccys: 100 nmol/L)

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  4.   结 论

  本研究以磁纳米颗粒和分子间裂分式G-四链体-氯化血红素DNA酶为基础发展了一种Ag⁺和半胱氨酸比色传感器。磁纳米颗粒的引入极大地增强了传感器的抗干扰能力,降低了背景信号,可以实现天然水体中痕量Ag⁺ 的快速检测以及生物复杂样本中半胱氨酸的检测,加标回收率误差在允许的范围内。本方法操作简单、灵敏度高、特异性好,适合发展为环境监测、临床分析等领域的现场实时分析技术。

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  Figure 1  Schematic diagram of fabricated DNAzyme sensor for detection of Ag⁺ and cysteine

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  Figure 2  UV absorption curves of biosensor in the presence of different components (C_Hemin: 100 μmol/L)

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  Figure 3  (A) Influence of quantities of DNA 1 on A_{420 nm},(B) Influence of pH on A_{420 nm},(C) Influence of DNAzyme catalyzing temperature on ΔA_{420 nm} (C_Ag⁺: 150 nmol/L)

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  Figure 4  Influence of DNAzyme reaction time on A_{420 nm} (A,150 nmol/L Ag⁺,B,100 nmol/L Cys)

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  Figure 5  (A) Absorption curves of system at Ag⁺ concentrations of : (1) 0.0,(2) 0.5,(3) 1.0,(4) 5.0,(5) 10,(6) 20,(7) 40,(8) 60,(9) 80,(10) 100 and (11)150 nmol/L (pH=7.0),(B) Linear calibration curve

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  Figure 6  (A) Absorbance curves of cys concentration from 0 to 100 nmol/L: (1) 0.0,(2) 0.1,(3) 1.0,(4) 5.0,(5) 10,(6) 20,(7) 40,(8) 60,(9) 80,and (10)100 nmol/L (pH=7.0),(B) Linear calibration curve (C_Ag⁺: 150 nmol/L)

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  Figure 7  Selectivity of Ag⁺-sensing system(C_Ag⁺: 100 nmol/L)[]

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  Figure 8  Selectivity of cys-sensing system(Ccys: 100 nmol/L)

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  Table 1.  Analytical results of Ag⁺ in water samples and recovery tests

  Sample	Ag+ in samples (nmol/L)	Added (nmol/L)	Total found (nmol/L)	Average recovery (%, n=5)	RSD (%, n=5)
  自来水 Tap water	未发现 Not found	20	18.90	94.5	2.1
  湖水 Lake water	未发现 Not found	20	21.1	105.5	2.6
  湘江水 Xiangjiang river	未发现 Not found	20	19.48	97.4	1.3

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  Table 2.  Analytical results of three human urine samples

  Sample	L-cysteine in samples (nmol/L)	Found (mean±SD) (nmol/L)	Recovery(%, n=5)	RSD(%, n=5)
  1	20.50	21.0 ± 1.0	102.4	4.8
  2	35.2	34.3 ± 1.2	97.5	3.5
  3	52.0	54.5 ± 2.3	104.8	4.2

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