English

• 1.   引 言

  以原子力显微镜和扫描隧道显微镜为代表的扫描探针显微镜(Scanning probe microscopy)家族除了具有微观高分辨表征功能以外,其强大的微观材料加工能力也正为多个领域带来技术革新^{[1, 2]}。自从1989年IBM公司首次利用扫描隧道显微镜操控单个氙原子以来^{[3, 4]},扫描探针显微镜家族已逐步将相关研究拓宽至生命科学领域。其中,原子力显微镜由于对工作环境要求低,更适合研究生物大分子和生物组织,甚至在生理条件下精准控制单个生物大分子的位置、拉伸,乃至构象。通过融合其它领域的成熟技术,扫描探针显微镜还能对生物大分子进行微接触印刷(Microcontact printing)、纳米模板印刷(Nanolithography)等自上而下(Top-down)的微观材料加工处理^[5~10]。由于该类材料加工技术能在基质表面快速形成具有规则排列的生物大分子阵列,并保留其生物活性,这为制备高特异性的生物探针和生物芯片、合成新型微纳生物材料提供了一种极为有效的方法。以原子力显微镜为例,运用接触模式(Contact mode)时,施加在探针上的力大约在10^-11~10^-6 N之间。一般认为,10^-11 N量级的力对生物大分子及细胞表面不会造成损伤,而使用更大的力则可以对样品进行操控,甚至改变样品表面形貌^{[11, 12]}。

  胶原蛋白是一类构成所有多细胞生物结缔组织的主要组成成分的蛋白质的总称。作为最重要的细胞外基质(ECM)蛋白,胶原蛋白单体能自组装成胶原纤维来构架,并支撑几乎所有无脊椎动物与脊椎动物的组织器官^{[13, 14]}。在末端端肽引导下,胶原蛋白单体会互相错开,平行排列,自组装成细长的原纤维。在生物矿化过程中,羟磷灰石会在原纤维的特定位点结晶,并逐渐生长成带状小块,最后形成高度有序的交错结构^[13~15]。因此,这种自下而上(Bottom up)的胶原蛋白自组装成纤对生成骨骼等生物功能性材料至关重要。

  近年来,结合尺寸与功能可调的表面膜层合成技术以及大量不同微观晶体结构的基质选择,在基质表面控制分子膜层结构为获得功能可预测的新型微纳光电材料与器件开启了大门^[16~20]。本研究考察了利用原子力显微镜的接触模式将吸附在云母晶体表面的I型鼠尾胶原蛋白单体膜加工成排列较为规整的胶原蛋白纳米纤维阵列。到目前为止,尚未有通过非自组装方式形成胶原蛋白纤维的报道。根据纳米纤维阵列的取向与探针扫描方向的关系,并结合其它生物大分子与原子力显微镜探针的相互作用的实例,对本实验中胶原蛋白的成纤机理进行了深入的探讨。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  原子力显微镜(Bruker AXS,Dimension Icon)与探针(镀金和铬的硅材质,悬臂与针尖的力常数均为0.1 N/m,针尖高20 μm,锥角30°,曲率半径50 nm)购自德国Bruker公司。胶原蛋白单体(Rat tail tendon collagen type I,5 mg/mL,溶解于0.006 mol/L乙酸)购自北京索莱宝科技有限公司。云母基片(Muscovite mica)与载玻片购自北京中镜科仪技术有限公司。胶带购自3M公司。实验室自制去离子水,室温电阻率约18 MΩ·cm。

  2.2.   实验方法

  取适量5 mg/mL 胶原蛋白单体溶液,用去离子水稀释至50 μg/mL。将云母片切割成约1 cm×1 cm的方片,用双面胶贴在载玻片中央,用单面透明胶带撕开云母片表层使露出新鲜晶面,用去离子水润洗晶面两次,立刻滴上50 μg/mL的胶原蛋白单体溶液覆盖晶面约2 h,然后除去云母晶面上的蛋白质溶液,并用去离子水小心清洗晶面1~2次以除去吸附不牢的蛋白质,接着用去离子水覆盖云母晶面进行胶原蛋白的原子力显微镜表征与加工实验。原子力显微镜对胶原蛋白样品进行表征时设置为轻敲模式,行扫描方向平行于探针悬臂方向,振幅约100 nm,驱动频率约8 kHz,接近探针悬臂在溶液中的共振频率。原子力显微镜对胶原蛋白进行加工时设置为接触模式(施加在探针上的力在10^-8~10^-6 N之间)。两种扫描模式的分辨率均为256 × 256。

  3.   结果与讨论

  3.1.   胶原蛋白纳米纤维阵列的加工和表征

  在溶液中运用原子力显微镜的轻敲模式对样品表面不同位置进行表征,未发现文献报道的自组装而成的胶原蛋白纤维阵列^{[21, 22]}。这可能是本实验中的单体浓度较大,蛋白质覆盖较厚所致。另外,未使用文献中的缓冲溶液也可能抑制成纤。图 1A是具有代表性的5 μm×5 μm区域,其表面均方根粗糙度约为0.8 nm,这种不均匀性可能是胶原蛋白单体的随机覆盖导致。然而在原子力显微镜的接触模式下,对同一区域进行两次同样的扫描,接着使用轻敲模式进行表征,得到如图 1B所示的胶原蛋白纳米纤维阵列图。接触模式的行扫描方向平行于探针悬臂方向(图中用箭头标出),探针作用力设置为1×10^-7N。图 1B中单根胶原蛋白纳米纤维呈反复弯曲状,但整个纳米纤维阵列的取向较为一致,大致垂直于接触模式的探针行扫描方向。数据分析结果显示,单根蛋白纳米纤维的长度从几百纳米到几微米不等,平均高度约2 nm,宽度约150 nm,阵列中纳米纤维间距并不均匀,从互相接触到几百纳米不等。接触模式下的初次扫描可以均衡云母表面的蛋白单体分布,对同一区域进行两次同样的扫描便可以得到较稳定且排列规则的蛋白纳米纤维阵列,两次以上的扫描对单根纳米纤维的局部排列有显著改变,但对纳米纤维阵列的整体形貌影响不大。

  图 1

  

  图 1  去离子水覆盖的云母晶面上的胶原蛋白膜层的原子力显微镜表面形貌图(轻敲模式,箭头为探针悬臂方向): (A)未作预处理;(B)利用原子力显微镜的接触模式制造纳米纤维阵列,行扫描方向与箭头方向一致。

  Figure 1.  Atomic force microscopic (AFM) topographic images (Tapping mode) of the same collagen coated mica surface under deionized water (the arrow along the cantilever's long axis): (A) not pretreated by AFM contact mode; (B) after two scans in contact mode with the line-scanning direction parallel to the arrow

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  3.2.   胶原蛋白纳米纤维阵列的排列方向

  在去离子水覆盖的云母片表面的不同区域使用原子力显微镜的接触模式来制造蛋白纳米纤维时,当其它条件相同,仅扫描方向不同时,得到了如图 2所示的结果。图 2是两个不同位置的2.5 μm × 2.5 μm区域。两区域均使用原子力显微镜的接触模式连续扫描两次,紧接着使用轻敲模式来进行表征(图中白色箭头为平行探针悬臂方向);接触模式的探针作用力均设置为1×10^-7N。在接触模式下,图 2A区域的行扫描方向为平行于探针悬臂方向,图 2B的方向为垂直于探针悬臂方向。图 2中蛋白纤维密度较图 1稀疏,平均高度约3 nm,宽度约200 nm。尽管单根纤维呈反复弯曲状,但整个纤维阵列的取向大致垂直于接触模式下的行扫描方向。

  图 2

  

  图 2  利用原子力显微镜的接触模式在去离子水覆盖的云母晶面不同区域制造胶原蛋白纤维阵列(箭头为探针悬臂方向): (A)行扫描方向与箭头方向一致;(B)行扫描方向与箭头方向垂直。

  Figure 2.  Collagen fibrils created by AFM tip in contact mode on mica's two different areas under deionized water (the arrow along the cantilever's long axis) with the line-scanning direction: (A) parallel to the arrow; (B) perpendicular to the arrow.

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  3.3.   胶原蛋白纳米纤维的形成机理

  尽管胶原蛋白单体以自组装成纤著称,但目前尚无文献报道与本实验结构类似的胶原蛋白纤维。1989年,Drake等^[23]利用原子力显微镜的接触模式观测云母片上的凝血酶催化血纤蛋白原的聚合反应时观察到了平行的弯曲纤维阵列。1990年,Lin等利用原子力显微镜的接触模式观测免疫球蛋白G(4-4-20 IgG2)在PBS缓冲液中的自组装时也发现了蛋白质沉积而成的褶皱结构,其脊部呈反复弯曲状,但整体取向大致平行^[24]。在这些实验中,Drake和Lin等均未注意到探针对成纤的影响。直到1992年,当Lea等试图重现Drake和Lin的工作时,他们发现只要在探针上施加合适的力,多种样品都可以形成这种整体取向一致的纤维阵列,且与单体的自组装能力无关。例如,即使不添加凝血酶来催化聚合反应,仍然可以在云母片上观测到弯曲状血纤蛋白原纤维阵列。基于单根纤维的特性以及纤维阵列的取向与探针扫描方向的关系,Lea等提出了原子力显微镜探针的"分子扫帚(Molecular broom)"机理^[25]。

  如图 3A所示,在原子力显微镜的接触模式下,样品作用于探针上的力可分解成水平与垂直方向,其中垂直方向上的力会使悬臂发生弯曲。在扫描过程中,垂直方向的力或悬壁的弯曲度应保持恒定,这由压电传感器通过调节悬臂或样品台的高度来控制。当作用在探针上的力大于样品分子与基质的结合力时,探针将样品分子推动,像扫帚一样在图 3B中扫动分子并堆积起来。此时探针受力和悬臂弯曲度都会增大,当垂直方向的力大过压电传感器设置的阈值时,系统便将悬臂上提以缓解压力。于是,探针便如图 3C所示滑过堆积的样品分子表面。随着垂直方向的力进一步减小,在图 3D中压电传动系统将探针再次放低来进行新一轮的分子扫帚运动。这样,每一行扫描结束后,探针会将样品分子扫成几堆。当接下来的一行扫描时,又会形成新的样品分子堆积。如果行距合适使得相邻两行的样品分子堆能相互接触,它们便很可能随机结合起来,形成了呈之字形的随机反复弯曲的单根纤维,其大致取向垂直于探针的行扫描方向。

  图 3

  

  图 3  原子力显微镜接触模式下探针的"分子扫帚"机理: (A)探针沿箭头方向向右进行行扫描,3箭头为样品作用在探针上的力及其在水平和垂直方向上的分量;(B)样品分子与基质的结合力弱,探针将样品分子推动并堆积起来,同时作用在探针上的力增大;(C)作用在探针垂直方向的力大过压电传感器设置值,压电传感器将探针上提缓解压力,探针滑过堆积的样品分子表面;(D)作用在探针垂直方向的力小于压电传感器设置值,压电传感器将探针放低继续行扫描。

  Figure 3.  Schematic representation of AFM tip's "Molecular broom" mechanism in contact mode: (A) AFM tip moving across the sample surface in the line-scanning direction indicated by the arrow to the right,with the force and its horizontal and vertical components exerted on the tip indicated by the three arrows; (B) while the binding force between the molecules and the substrate is small,the tip begins to pile the molecules up,producing a larger vertical force exerted on the tip; (C) when the vertical force becomes larger than the value set on the piezoelectric crystal,the feedback system lifts the tip across the aggregates' surface to maintain a constant force; (D) piezoelectric crystal brings the tip down when the vertical force is diminished and the sweeping process begins again.

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  对原子力显微镜探针的"分子扫帚"机理,还可以做定量的评估来判断成纤的可能性。在接触模式下,原子力显微镜并不具有单原子分辨率,其探针与样品的接触面积A可用以下公式估算^[26]:

  A=K×(R×L)^2/3

  其中,K为常数,R为原子力显微镜探针针尖有固定的曲率半径,L为垂直方向施加在探针上的力。据此公式及文献的经验K值(1.65×10^-6 m²·J^-2/3),估算图 1和图 2中探针与样品的接触面积约20 nm × 20 nm。而探针扫描行间距分别为: 图 1,5000/256≈20 nm;图 2,2500/256≈10 nm。很显然,相邻两行扫描均有较大重叠区域,而图 2中的重叠区域更大,这也许是图 2中的纤维更稀疏和粗壮的原因。

  为进一步验证上述"分子扫帚"机理,另选了一块如图 4所示的10 μm × 10 μm区域来制造蛋白纳米纤维,图中白色箭头平行于探针悬臂。首先,在A区域(5 μm × 5 μm)利用原子力显微镜的接触模式连续扫描两次,行扫描方向垂直于探针悬臂方向,探针作用力设置为2 × 10^-7 N。紧接着在B区域(2.5 μm × 2.5 μm)使用同种模式、相同方向以及相同探针作用力进行两次连续扫描。接下来,在C区域(5 μm ×5 μm)利用接触模式连续扫描两次,行扫描方向平行于探针悬臂方向,探针作用力增加到5×10^-7 N。接着,在D区域(2.5 μm × 2.5 μm)使用同种模式和相同方向进行两次连续扫描,但是探针作用力增加到1×10^-6 N。最后,在原子力显微镜的轻敲模式下对整个区域进行表征,得到了图 4中分块的胶原蛋白纳米纤维阵列图。很显然,A区域和C区域的纳米纤维阵列的取向互相大致垂直,均垂直于接触模式下探针的行扫描方向。对比图 1,在图 4的A区域由于探针作用力增加,单根蛋白纤维的平均宽度增加到约270 nm,而在B区域由于扫描行间距变小产生更大重叠区域,蛋白纤维变得稀疏和粗壮,单根蛋纤维宽度约350 nm。在C区域,由于探针作用力进一步增加,可能有大量蛋白分子被探针带出该区域,纤维变得稀疏且单薄。在D区域,当探针的作用力较图 1增加了一个数量级时,胶原蛋白分子基本上被探针"扫"走了。

  图 4

  

  图 4  接触模式下原子力显微镜探针在去离子水覆盖的云母晶面的不同区域制造胶原蛋白纤维阵列(箭头为探针悬臂方向)。

  Figure 4.  Collagen fibrils created by AFM tip in contact mode on mica's different areas under deionized water (the white arrow along the cantilever's long axis)]

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  对实验结果分析表明,在原子力显微镜的接触模式下制造胶原蛋白纳米纤维阵列有如下特点: (1)在合适的探针作用力下才能产生纤维,当探针作用力远大于吸附分子与基质或分子之间的作用力时,探针便可能将蛋白分子"扫"出扫描区域;(2)纤维取向垂直于探针行扫描方向;(3)单根纤维的尺寸由探针作用力和扫描行间距共同决定。综上所述,本实验利用原子力显微镜探针的"分子扫帚"机理开发了一种自上而下的生物大分子纳米线阵列的制备方法,该方法对实验条件要求低,生成的蛋白纳米纤维阵列结构可控,为生产细胞培养器皿、制备高特异性的生物探针,合成新型有机微纳光电材料与器件提供了一种可行技术。

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  Figure 1  Atomic force microscopic (AFM) topographic images (Tapping mode) of the same collagen coated mica surface under deionized water (the arrow along the cantilever's long axis): (A) not pretreated by AFM contact mode; (B) after two scans in contact mode with the line-scanning direction parallel to the arrow

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  Figure 2  Collagen fibrils created by AFM tip in contact mode on mica's two different areas under deionized water (the arrow along the cantilever's long axis) with the line-scanning direction: (A) parallel to the arrow; (B) perpendicular to the arrow.

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  Figure 3  Schematic representation of AFM tip's "Molecular broom" mechanism in contact mode: (A) AFM tip moving across the sample surface in the line-scanning direction indicated by the arrow to the right,with the force and its horizontal and vertical components exerted on the tip indicated by the three arrows; (B) while the binding force between the molecules and the substrate is small,the tip begins to pile the molecules up,producing a larger vertical force exerted on the tip; (C) when the vertical force becomes larger than the value set on the piezoelectric crystal,the feedback system lifts the tip across the aggregates' surface to maintain a constant force; (D) piezoelectric crystal brings the tip down when the vertical force is diminished and the sweeping process begins again.

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  Figure 4  Collagen fibrils created by AFM tip in contact mode on mica's different areas under deionized water (the white arrow along the cantilever's long axis)]

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